磷酸酸蝕和不同磷酸酯單體預(yù)處理牙釉質(zhì)表面的微觀形態(tài)學(xué)觀察和粗糙度評(píng)價(jià)

韓 菲，陳 晨，楊家雪，石 煒，景雙林，謝海峰

磷酸酸蝕是牙釉質(zhì)粘接前的表面處理經(jīng)典程序[1-3]。然而酸蝕-沖洗技術(shù)存在操作費(fèi)時(shí)，處理后易重新污染等缺點(diǎn)[4]。在此背景下，自酸蝕粘接劑被開(kāi)始應(yīng)用于牙釉質(zhì)的粘接，其中包含了酸性單體實(shí)現(xiàn)牙釉質(zhì)的脫礦和調(diào)節(jié)，而無(wú)需進(jìn)行磷酸酸蝕預(yù)處理，因此能縮短工作時(shí)間和降低技術(shù)敏感性[5-6]。由于自酸蝕粘結(jié)劑的酸性比磷酸低，被質(zhì)疑是否能提供足夠的牙釉質(zhì)脫礦能力[7]。目前關(guān)于酸蝕-沖洗和自酸蝕粘結(jié)系統(tǒng)對(duì)牙釉質(zhì)與樹(shù)脂間粘接強(qiáng)度的影響已有研究，但關(guān)于不同酸蝕時(shí)間和不同表面處理的牙釉質(zhì)表面粗糙度和表面形貌的研究較少。本實(shí)驗(yàn)的目的即探討磷酸酸蝕不同時(shí)間以及不同磷酸酯單體預(yù)處理牙釉質(zhì)表面粗糙度和微觀形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，征得個(gè)人知情同意后從南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院收集7顆新鮮拔除的無(wú)齲人類(lèi)第三磨牙，保存在4 ℃ Hanks平衡鹽溶液中，并在1個(gè)月內(nèi)使用。使用低速切割機(jī)(Buehler公司，美國(guó))在流水狀態(tài)下將牙齒沿釉牙骨質(zhì)界分開(kāi)，去除所有牙根。將牙冠在牙體長(zhǎng)軸方向沿近遠(yuǎn)中向切開(kāi)，制備成19個(gè)相同規(guī)格(3 mm×3 mm×2 mm)的牙釉質(zhì)樣本，使用鎢鋼車(chē)針(FG7664，美國(guó))進(jìn)行表面高度拋光。選取7個(gè)牙釉質(zhì)樣本分別接受以下表面處理：對(duì)照組：不進(jìn)行進(jìn)一步處理(Ctr)；酸蝕組：分別使用35%磷酸(格魯瑪，德國(guó))酸蝕3 s(Etch3組)、15 s(Etch15組)、30 s(Etch30組)、60 s(Etch60組)；磷酸酯單體調(diào)節(jié)組：按照廠家推薦，分別涂抹含甘油磷酸二甲基丙烯酸酯(glycerol phosphate dimethacrylate，GPDM)的Optibond Versa (OV， Kerr，美國(guó))的預(yù)處理劑(OV組)和含10- 甲基丙烯酰氧癸二氫磷酸酯(10-Methacryloyloxydecyl dihydrogen phosphate，10-MDP)的Tetric N Bond Universal (TNBU，義獲嘉，列支敦士登)(TNBU組)各20 s，吹勻，自然揮發(fā)20 s。

在沒(méi)有光固化的情況下，OV和TNBU組用丙酮和去離子水交替清洗，去除殘留單體。所有樣本在乙醇水溶液中逐級(jí)脫水。干燥后備用。

1.2 掃描電鏡表面形貌觀察

將各組經(jīng)過(guò)表面處理的牙釉質(zhì)樣本進(jìn)行濺射鍍金，使用掃描電子顯微鏡(TESCAN， MAIA3，捷克)在真空狀態(tài)下，工作電壓為5 kV，工作距離為8 mm下進(jìn)行微觀形態(tài)學(xué)觀察，放大倍數(shù)分別在2 000和 10 000倍。

1.3 表面粗糙度測(cè)定

剩余12個(gè)牙釉質(zhì)樣本，分為4組(n=3)，分別進(jìn)行鎢鋼車(chē)針拋光、35%磷酸酸蝕15 s、OV預(yù)處理劑和TNBU表面處理，使用表面輪廓儀(Contour GT-X 3D optical microscope，Bruker公司，美國(guó))進(jìn)行表面粗糙度(Ra)的測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

記錄各組的粗糙度值，通過(guò)正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析比較不同表面處理因素對(duì)牙釉質(zhì)表面粗糙度的影響。LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 22.0(IBM SPSS Inc，美國(guó))，顯著性為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 表面形貌

根據(jù)掃描電鏡觀察(圖1～3)，經(jīng)過(guò)鎢鋼車(chē)針拋光的牙釉質(zhì)表面可見(jiàn)車(chē)針打磨的清晰劃痕。低倍視野下，用磷酸酸蝕3 s的牙釉質(zhì)表面可見(jiàn)較明顯的魚(yú)鱗狀排列的釉柱，高倍視野下可以觀察到釉柱結(jié)構(gòu)輕度溶解，釉柱間質(zhì)輕微暴露。磷酸酸蝕15 s的牙釉質(zhì)表面在低倍視野下觀察到由于釉柱溶解而顯示出明顯的蜂窩狀圖案，高倍視野下表現(xiàn)出類(lèi)似于觸須樣的結(jié)構(gòu)。磷酸酸蝕30 s的釉柱結(jié)構(gòu)在低倍視野下表現(xiàn)出比酸蝕15 s相對(duì)平坦、聚合的圖案，高倍視野下可觀察到釉柱結(jié)構(gòu)輕微塌陷，釉柱間隙較酸蝕15 s增大。磷酸酸蝕60 s的牙釉質(zhì)表面在低倍視野下觀察到的釉柱排列方式發(fā)生了變化，部分釉柱結(jié)構(gòu)不再立體，高倍視野下可觀察到釉柱結(jié)構(gòu)明顯塌陷,釉柱間隙較酸蝕30 s明顯增大且大小不一。OV預(yù)處理劑處理過(guò)的牙釉質(zhì)表面在低倍視野下劃痕明顯消失，高倍視野下可以觀察到明顯的釉柱邊界。TNBU未見(jiàn)明顯的釉柱蝕刻表現(xiàn)，劃痕明顯。

A： ×2 000；B: ×10 000

2.2 表面粗糙度

不同處理方式后牙釉質(zhì)平均表面粗糙度(Ra)及標(biāo)準(zhǔn)差如表1所示。統(tǒng)計(jì)分析顯示：Etch15組的Ra值最高，TNBU組的Ra值最低，用磷酸處理牙釉質(zhì)產(chǎn)生的表面粗糙度顯著大于Ctr組、OV組和TNBU組(P<0.001)，OV組明顯高于TNBU組(P=0.032)，OV組和TNBU組都顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。圖4～7為經(jīng)過(guò)鎢鋼車(chē)針拋光(Ctr)、35%磷酸酸蝕15 s(Etch15)、OV預(yù)處理劑、TNBU處理過(guò)的牙釉質(zhì)表面的典型三維圖像。

A、a: 酸蝕3 s；B、b：酸蝕15 s；C、c: 酸蝕30 s;D、d: 酸蝕60 s。A、B、C、D： ×2000； a、b、c、d: ×10 000

A、a: Optibond Versa預(yù)處理劑；B、b: Tetric N Bond Universal, A、B: ×2 000； a、b: ×10 000

表1 牙釉質(zhì)表面粗糙度

圖4 鎢鋼拋光處理后牙釉質(zhì)表面三維形貌圖

圖5 35%磷酸酸蝕15 s后牙釉質(zhì)表面三維形貌圖

3 討 論

牙釉質(zhì)是人體內(nèi)最堅(jiān)硬的組織，由92%～96%的無(wú)機(jī)物以及4%的有機(jī)物組成。無(wú)機(jī)物質(zhì)的主要成分是羥基磷灰石晶體[8-9]。牙釉質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)由排列成棱柱或棒狀，大致垂直于釉牙本質(zhì)界的釉柱組成[10]。1955年，Buonocore引入了對(duì)牙釉質(zhì)進(jìn)行磷酸蝕刻以將丙烯酸類(lèi)樹(shù)脂粘接到酸蝕表面的概念，認(rèn)為適當(dāng)?shù)难烙再|(zhì)表面粗糙結(jié)構(gòu)對(duì)于在粘接劑和牙釉質(zhì)之間建立持久的粘結(jié)非常重要[11-12]。

圖6 Optibond Versa預(yù)處理劑處理后牙釉質(zhì)表面三維形貌圖

圖7 Tetric N Bond Universal處理后牙釉質(zhì)表面三維形貌圖

酸蝕-沖洗模式是牙釉質(zhì)-樹(shù)脂粘結(jié)的傳統(tǒng)方式，也是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的方式。磷酸蝕刻會(huì)溶解牙釉質(zhì)羥基磷灰石晶體，并在表面形成多孔的固位結(jié)構(gòu)，從而增加表面粗糙度和表面自由能。酸蝕-沖洗模式獲得粘接力的來(lái)源即依賴(lài)于酸蝕的釉柱和羥基磷灰石晶體結(jié)構(gòu)與滲入、包裹的粘接樹(shù)脂聚合后形成的微樹(shù)脂突[2]。酸蝕技術(shù)最初應(yīng)用于牙釉質(zhì)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)的酸蝕時(shí)間為60 s，但后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，15 s的磷酸酸蝕已能為牙釉質(zhì)表面提供足夠的微機(jī)械固位力，進(jìn)一步酸蝕或許可使牙釉質(zhì)表面粗糙度(Ra)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的增加，但形態(tài)特征和表面積并沒(méi)有明顯變化[11，13]。牙釉質(zhì)-樹(shù)脂的粘結(jié)耐久性并不與磷酸酸蝕時(shí)間存在相關(guān)性[14]，過(guò)度延長(zhǎng)的磷酸酸蝕時(shí)間并不能提高牙釉質(zhì)-樹(shù)脂的剪切粘結(jié)強(qiáng)度[3]。因此，本研究中只測(cè)量了酸蝕15 s這一推薦的磷酸酸蝕時(shí)間，因其已能夠代表磷酸酸蝕實(shí)現(xiàn)牙釉質(zhì)表面粗糙度的較好狀態(tài)，并將此作為對(duì)照，評(píng)價(jià)磷酸酯單體包含的粘接產(chǎn)品調(diào)節(jié)牙釉質(zhì)時(shí)獲得表面粗糙度的優(yōu)劣。

本研究中的不同磷酸酸蝕時(shí)間的牙釉質(zhì)表面形貌觀察結(jié)果顯示，酸蝕牙釉質(zhì)3 s即可見(jiàn)釉柱結(jié)構(gòu)輕度溶解，釉柱間質(zhì)輕微暴露，酸蝕15 s的牙釉質(zhì)表面則表現(xiàn)出由于釉柱溶解而明顯的蜂窩狀圖案。這些現(xiàn)象與以往的研究[15]是一致的。酸蝕30 s的釉柱結(jié)構(gòu)則出現(xiàn)輕微塌陷，釉柱間隙較酸蝕15 s者增大。酸蝕60 s的釉柱結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出明顯的塌陷,釉柱間隙也較酸蝕30 s時(shí)明顯增大。這可能是因?yàn)樗嵛g時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而破壞了蜂窩狀的有利于微機(jī)械嵌合的釉柱結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)顯然不利于牙釉質(zhì)-樹(shù)脂的粘結(jié)強(qiáng)度和耐久性。

由于自酸蝕粘接系統(tǒng)產(chǎn)生的牙釉質(zhì)表面與用磷酸處理的牙釉質(zhì)表面明顯不同[16-17]，磷酸酸蝕被認(rèn)為使粘結(jié)樹(shù)脂能夠比未酸蝕和自酸蝕粘結(jié)劑處理的牙釉質(zhì)表面滲透得更深入[18]，所以自酸蝕粘結(jié)劑與牙釉質(zhì)產(chǎn)生的粘結(jié)力被質(zhì)疑可能不如酸蝕-沖洗系統(tǒng)持久[19]。使用磷酸酸蝕可以明顯改變牙釉質(zhì)表面特性，與磷酸酸蝕相比，自酸蝕粘結(jié)劑對(duì)牙釉質(zhì)的蝕刻能力則主要取決于所含的酸性功能單體的性質(zhì)。有研究證實(shí)，10-MDP對(duì)牙釉質(zhì)的脫礦能力相對(duì)于磷酸酸蝕較差，導(dǎo)致晶體間粘結(jié)樹(shù)脂浸潤(rùn)較淺，微樹(shù)脂突形成較少[20]。本研究中使用兩種粘結(jié)劑Optibond Versa 和Tetric N Bond Universal分別代表兩種功能單體GPDM和10-MDP對(duì)牙釉質(zhì)的蝕刻能力，兩者成分的主要差別是TNBU含有D3MA(decandiol dimethacrylate)和MCAP(methacrylated carboxylic acid polymer)。到目前為止，沒(méi)有證據(jù)顯示10-MDP與羥基磷灰石的脫礦及結(jié)合能力會(huì)受TNBU中D3MA和MCAP成分的影響。本研究中，高倍視野下的掃描電鏡觀察顯示，與經(jīng)典的磷酸酸蝕15 s在牙釉質(zhì)表面暴露出的典型蝕刻圖案相比，OV預(yù)處理劑處理20 s的牙釉質(zhì)表面雖然沒(méi)有顯示出跟前者一樣典型的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，但是仍然暴露出一些釉柱結(jié)構(gòu)，證實(shí)了鎢鋼車(chē)針制備的牙釉質(zhì)表面劃痕大部分被溶解，釉柱輪廓輕微暴露，部分被單體鈣鹽沉積所遮擋，最接近于磷酸酸蝕3 s時(shí)的效果。而TNBU與牙釉質(zhì)相互作用時(shí)，在高倍鏡下仍可觀察到明顯劃痕，說(shuō)明其蝕刻效果低于OV。這一現(xiàn)象主要是歸因于OV預(yù)處理劑中的酸性單體GPDM(pH=1.6)對(duì)釉柱的蝕刻能力雖然低于酸蝕組(pH<0.5)，但是仍然產(chǎn)生了實(shí)現(xiàn)微機(jī)械嵌合力所需要的表面微觀形態(tài)。TNBU所含的10-MDP(pH介于2.5～3.0)對(duì)牙釉質(zhì)的蝕刻能力低于OV，所以推測(cè)提供的微機(jī)械固位力也低于OV。以往研究認(rèn)為，含GPDM的自酸蝕粘結(jié)劑比含10-MDP的呈現(xiàn)出更多更深的蝕刻凹坑狀結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)都被粘結(jié)樹(shù)脂滲透，緊密包圍著暴露的羥基磷灰石晶體，在牙釉質(zhì)釉柱之間形成了豐富的微觀和宏觀樹(shù)脂突[20]。這與本研究的結(jié)果是一致的。在本研究中，表面粗糙度分析結(jié)果也支持掃描電鏡的觀察結(jié)果。酸蝕15 s獲得了最高的牙釉質(zhì)表面粗糙度，其次是OV和TNBU，均高于對(duì)照組，因此，磷酸酸蝕在獲得足夠的牙釉質(zhì)脫礦深度上仍是具有更大優(yōu)勢(shì)的。同時(shí)，OV預(yù)處理所表現(xiàn)出的脫礦深度明顯大于TNBU，說(shuō)明了磷酸酯單體的pH值對(duì)牙釉質(zhì)表面的脫礦能力有關(guān)鍵作用。

通過(guò)當(dāng)前的研究結(jié)果可以推論：牙釉質(zhì)粘結(jié)推薦酸蝕-沖洗模式，磷酸酸蝕牙釉質(zhì)時(shí)間以15 s為宜。經(jīng)過(guò)磷酸酸蝕和應(yīng)用磷酸酯單體包含的預(yù)處理劑調(diào)節(jié)均可以改變牙釉質(zhì)表面特性，增加表面粗糙度，但磷酸酯單體GPDM對(duì)牙釉質(zhì)的蝕刻能力和脫礦深度均高于10-MDP，提示相應(yīng)的自酸蝕粘結(jié)劑可能更利于牙釉質(zhì)-樹(shù)脂的粘結(jié)效果。