不同葉綠素測(cè)定方法的比較研究

趙京東，宋彥濤，何 暢，徐鑫磊，烏云娜，李琳琳

(大連民族大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧 大連 116605)

高等植物體中葉綠素主要包括葉綠素a和葉綠素b，均是參與光合作用的重要色素[1]，其含量的多少是衡量植物光合作用強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[2]。目前，研究者們測(cè)量植物體內(nèi)葉綠素含量主要有兩種方法。其一是實(shí)驗(yàn)室化學(xué)分析，即使用丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑浸泡植物葉片后，根據(jù)葉綠素在溶劑中對(duì)特定波長(zhǎng)的光有最大吸收，采用分光光度計(jì)測(cè)定在該波長(zhǎng)下葉綠素溶液的吸光度，再根據(jù)相關(guān)公式推導(dǎo)即可計(jì)算葉綠素含量[3]，但由于該方法所需儀器較多，耗時(shí)較長(zhǎng)，不適于樣品量較多的野外實(shí)驗(yàn)。其二是使用便攜式SPAD 葉綠素儀，其特點(diǎn)是測(cè)量過(guò)程中不需試劑，在保證植物與葉綠素儀接觸的情況下可直接得出葉綠素的相對(duì)含量，即SPAD值，具有無(wú)損、實(shí)時(shí)檢測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室分析的不足，深受廣大學(xué)者們的青睞[4]。先前的研究表明，葉綠素儀已在羊草葉片、黑麥草葉片、煙葉、草莓葉片、西葫蘆葉片以及小麥葉片等葉綠素含量預(yù)測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用[5-10]，但不同物種利用SPAD值預(yù)測(cè)葉綠素含量的模型準(zhǔn)確度還存在一些差異[5]，針對(duì)同一環(huán)境下不同的功能群和物種，便攜式SPAD葉綠素儀和傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室分析兩種方法是否均適用，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究對(duì)大連民族大學(xué)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)校區(qū)校園內(nèi)的四類功能群共八種植物的SPAD值和葉綠素含量進(jìn)行了測(cè)定，探討不同功能群和物種間的SPAD值和葉綠素含量差異以及SPAD 值與葉綠素含量之間是否存在相關(guān)性，為利用SPAD值預(yù)測(cè)不同物種間的葉綠素含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)地概況

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)位于大連民族大學(xué)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)校區(qū)(遼寧省大連市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)遼河西路18號(hào))校園內(nèi)。該校區(qū)位于大連經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)中心地帶，屬暖溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，年均降水量550-950毫米，年均氣溫10.5℃左右，最高氣溫35.3℃左右，最低氣溫在-18.8℃左右。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與取樣方法

于2017年9月晴朗天氣，在大連民族大學(xué)校園內(nèi)選取八種常見(jiàn)物種，共四類功能群，每類功能群兩種植物。分別為：?jiǎn)棠荆杭訔?、銀杏；灌木：紫丁香、冬青；藤本：紫藤、蘿藦；草本：苦賣菜、車前草。采用便攜式SPAD(502)葉綠素儀測(cè)定和丙酮浸取法測(cè)定兩種方法進(jìn)行植物葉綠素的測(cè)定。

便攜式SPAD葉綠素儀測(cè)定法：在植物葉片上隨機(jī)選取五個(gè)位置進(jìn)行SPAD值的測(cè)定，最后取平均值，記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)后采摘裝袋，標(biāo)記后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行丙酮法測(cè)定。每種植物隨機(jī)測(cè)定30片樣品。

丙酮浸取法測(cè)定：將帶回的鮮葉用打孔器取樣并稱重(與SPAD測(cè)量的葉片相同)，然后放置于標(biāo)號(hào)的試管中，在每個(gè)試管中用移液管加入10 ml的80%的丙酮溶液，用封口膜封口置于陰暗處放置48 h。48 h后分別在吸光度663 nm和646 nm下以80%的丙酮為空白測(cè)定吸光度，記錄數(shù)據(jù)。采用Lichtenthaler[11]公式計(jì)算葉綠素a(Ca)、葉綠素b(Cb)以及總?cè)~綠素(Ca+b)含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將功能群、物種作為固定因子進(jìn)行一般線性模型分析，不同功能群和物種間進(jìn)行多重比較(Tukey檢驗(yàn))，采用一般線回歸分析度量SPAD和葉綠素之間的線性相關(guān)，顯著性水平α=0.05。統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 26中完成，Sigmaplot 12.5和Excel2018作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物之間葉綠素的方差分析

SPAD和丙酮法都能體現(xiàn)不同功能群或物種之間的差異，一般線性模型結(jié)果顯示：不同功能群和不同物種之間SPAD與葉綠素含量差異極顯著(P≤0.001)，見(jiàn)表1。

2.2 不同功能群葉片SPAD和葉綠素含量的差異

從SPAD值來(lái)看，四類功能群SPAD值變化范圍分別為：?jiǎn)棠荆?4.04～61.44，灌木：48.10～82.14，藤本：29.38～62.00，草本：28.62～66.36。灌木SPAD值最高，顯著高于喬木、藤本及草本(P<0.001)，喬木SPAD值顯著高于藤本和草本，藤本和草本之間無(wú)差異(圖1A)。從葉綠素含量來(lái)看，四類功能群葉綠素a含量變化范圍分別為：?jiǎn)棠荆?.65～2.97 mg·g-1，灌木：0.52～2.75 mg·g-1，藤本：0.03～1.09 mg·g-1，草本：0.39～1.80 mg·g-1。喬木和灌木葉綠素a含量最高，其次為藤本，草本葉綠素a含量最低(P<0.001)(圖1B)；葉綠素b含量變化范圍分別為：?jiǎn)棠荆?.01～1.34 mg·g-1，灌木：0.09～1.16 mg·g-1，藤本：0.02～1.99 mg·g-1，草本：0.07～0.59 mg·g-1。藤本葉綠素b含量最高，顯著高于喬木、灌木及草本(P<0.001)，而喬木、灌木以及草本間無(wú)差異(圖1C)；總?cè)~綠素含量變化范圍分別為：?jiǎn)棠荆?.79～3.74 mg·g-1，灌木：0.62～2.96 mg·g-1，藤本：0.41～2.08 mg·g-1，草本：0.49～2.20 mg·g-1。喬木和灌木總?cè)~綠素含量最高，藤本和草本最低(P<0.001)，如圖1。

2.3 不同物種葉片SPAD和葉綠素含量的差異

從SPAD值來(lái)看，八種植物SPAD值變化范圍分別為：加楊：34.04～58.36，銀杏：46.66～61.44，紫丁香：48.10～62.66，冬青：63.54～82.14，紫藤：34.20～62.00，蘿藦：29.38～49.28，苣荬菜：35.34～66.36，車前：28.62～52.28，SPAD值由高到低表現(xiàn)為冬青>紫丁香>銀杏>苣荬菜>紫藤>加楊>蘿藦>車前(圖2A)。從葉綠素含量來(lái)看，八種植物葉綠素a含量變化范圍分別為：加楊：0.97～2.97 mg·g-1，銀杏：0.65～1.51 mg·g-1，紫丁香：1.15～2.75 mg·g-1，冬青：0.52～1.71 mg·g-1，紫藤：0.03～0.15 mg·g-1，蘿藦：0.36～1.09 mg·g-1，苣荬菜：0.54～1.80 mg·g-1，車前：0.39～1.03 mg·g-1。葉綠素a含量由高到低表現(xiàn)為紫丁香>加楊>苣荬菜>銀杏>冬青>蘿藦>車前>紫藤(P<0.001)(圖2B)；葉綠素b變化含量分別為：加楊：0.06～1.34 mg·g-1，銀杏：0.01～0.32 mg·g-1，紫丁香：0.20～1.16 mg·g-1，冬青：0.09～0.48 mg·g-1，紫藤：0.42～1.99 mg·g-1，蘿藦：0.02～0.59 mg·g-1，苣荬菜：0.07～0.59 mg·g-1，車前：0.08～0.24 mg·g-1。葉綠素b含量由高到低表現(xiàn)為紫藤>加楊>紫丁香>苣荬菜>冬青>蘿藦>車前>銀杏(P<0.001)(圖2C)；總?cè)~綠素含量變化范圍分別為：加楊：1.09～3.74 mg·g-1，銀杏：0.79～1.67 mg·g-1，紫丁香：1.89～2.96 mg·g-1，冬青：0.62～2.19 mg·g-1，紫藤：0.46～2.08 mg·g-1，蘿藦：0.41～1.38 mg·g-1，苣荬菜：0.62～2.20 mg·g-1，車前：0.49～1.22 mg·g-1?？?cè)~綠素含量由高到低表現(xiàn)為加楊>紫丁香>苣荬菜>紫藤>冬青>銀杏>蘿藦>車前(P<0.001)，如圖2。

2.4 不同方法間的回歸關(guān)系

對(duì)四類功能群共八種植物葉片SPAD值與葉綠素含量進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表2。喬木功能群的加楊和銀杏SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量之間均存在顯著線性關(guān)系；灌木功能群的紫丁香SPAD值與葉綠素a和總?cè)~綠素含量之間存在顯著線性關(guān)系，與葉綠素b含量之間無(wú)顯著線性關(guān)系，而冬青SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量之間均存在顯著線性關(guān)系；藤本功能群的紫藤SPAD值與葉綠素a之間存在顯著線性關(guān)系，與葉綠素b和總?cè)~綠素含量之間無(wú)顯著線性關(guān)系，蘿藦SPAD值與葉綠素a之間存在顯著線性關(guān)系，與葉綠素b和總?cè)~綠素含量之間無(wú)顯著線性關(guān)系；草本功能群的苣荬菜SPAD值與葉綠素b和總?cè)~綠素含量之間存在顯著線性關(guān)系，與葉綠素a之間無(wú)顯著線性關(guān)系，車前SPAD值與葉綠素a和總?cè)~綠素含量之間存在顯著的線性關(guān)系，與葉綠素b之間無(wú)顯著線性關(guān)系。

表2 不同物種葉綠素含量與SPAD值的關(guān)系

續(xù)表2 不同物種葉綠素含量與SPAD值的關(guān)系

2.5 不同物種間葉綠素a和葉綠素b比值的差異

不同物種間葉綠素a/b值均存在極顯著差異(P<0.001)。銀杏葉綠素a/b值最高，紫藤葉綠素a/b值最低，其余六種植物間無(wú)顯著差異，如圖3。

3 討 論

葉綠素含量是植物生理的重要指標(biāo)之一，反映了植物光合能力、發(fā)育階段、生長(zhǎng)狀況、生理代謝水平及營(yíng)養(yǎng)條件[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同功能群和物種間SPAD值和葉綠素含量表現(xiàn)出極顯著差異(圖1～2)，這說(shuō)明便攜式SPAD葉綠素儀和80%丙酮浸取法(鮮葉)兩種方法均適用，但變化趨勢(shì)不同。SPAD葉綠素儀通過(guò)二極管發(fā)射660 nm和940 nm 的紅光和近紅光進(jìn)行葉綠素 SPAD 值的測(cè)定，SPAD值是一個(gè)無(wú)量綱的比值，在測(cè)定植物葉片相對(duì)葉綠素含量的同時(shí)具有對(duì)葉片無(wú)損傷的優(yōu)勢(shì)[2]，但不同物種利用 SPAD 值預(yù)測(cè)葉綠素含量的模型準(zhǔn)確度還存在一定差別，需根據(jù)測(cè)定目標(biāo)的不同進(jìn)行具體分析[5]。而傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室方法雖可避免物種間模型差異，但耗時(shí)較長(zhǎng)，野外實(shí)驗(yàn)中樣品存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也會(huì)導(dǎo)致葉綠素流失，王凱等[12]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以單位鮮重計(jì)算葉綠素含量時(shí)，含水量高的葉片往往會(huì)低于含水量低的葉片，結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定誤差，因此，兩種方法間存在差異。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了八種植物共24組葉綠素?cái)?shù)據(jù)(表2)，其中與SPAD值達(dá)到顯著線性關(guān)系的有17組，未達(dá)到顯著線性關(guān)系的有7組，其中包括葉綠素a一組，葉綠素b四組，總?cè)~綠素兩組，且除加楊和苣荬菜外，其余六種植物SPAD值與葉綠素a回歸系數(shù)(R2)均高于葉綠素b，說(shuō)明SPAD值與葉綠素b的相關(guān)性不及葉綠素a。這可能與SPAD葉綠素儀的吸收波長(zhǎng)有關(guān)(660 nm和940 nm)，葉綠素a和葉綠素b的吸收峰在663 nm和645nm附近[12-13]，相對(duì)于葉綠素b，葉綠素a的吸收峰更接近于儀器測(cè)定波長(zhǎng)，因此線性回歸系數(shù)更高。

在SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量呈顯著線性關(guān)系的三種植物中，SPAD值：冬青>銀杏>加楊，總?cè)~綠素含量：加楊>冬青>銀杏，在八種植物當(dāng)中，加楊的SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量回歸系數(shù)均最高，說(shuō)明SPAD值可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)加楊葉片中葉綠素含量，且加楊和紫丁香葉片中葉綠素總量最高。這可能是由于加楊、銀杏以及紫丁香屬高大喬木，具有較寬的生態(tài)位，優(yōu)先對(duì)光能進(jìn)行利用和截留，但銀杏的總?cè)~綠素含量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及加楊和紫丁香。梁俊林等[14]對(duì)9-11月份銀杏葉變色期的研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉從微黃變?nèi)S總?cè)~綠素含量從3.999 mg·g-1降到0.077 mg·g-1，本實(shí)驗(yàn)中銀杏的總?cè)~綠素含量為1.89～2.96 mg·g-1，已屬于微黃期，但單從外觀不易分辨，銀杏葉片中葉綠素的不斷降解是其逐漸變黃的成因[14-15]，導(dǎo)致結(jié)果偏低。

在本研究中，除紫藤外，其余七種植物葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量的變化趨勢(shì)一致，葉綠素a含量均顯著高于葉綠素b含量，而紫藤的葉綠素a卻顯著低于葉綠素b含量，導(dǎo)致葉綠素a與葉綠素b比值最低，為0.06，遠(yuǎn)低于其他物種(圖3)，這是一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)。Hoflacher等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在葉綠素a與葉綠素b比值中，陰生植物葉綠素a/b值往往小于3，說(shuō)明紫藤能夠忍受一定程度的遮蔭環(huán)境，而除紫藤外，其余七種植物均適合生活在光線充足的向陽(yáng)處。在研究區(qū)內(nèi)，紫藤位于遮蔭位置，且葉片多呈藍(lán)紫色，張春牛[17]研究發(fā)現(xiàn)葉綠素b在藍(lán)紫光部分的吸收帶較寬，而陰生植物能在散射光下更好的利用藍(lán)紫光，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)四類功能群即八種植物的SPAD值和葉綠素含量進(jìn)行了測(cè)定比較和相關(guān)分析，不同功能群和不同物種之間SPAD與葉綠素含量差異極顯著(P≤0.001)，但趨勢(shì)不同。其中加楊、銀杏以及冬青葉片SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總?cè)~綠素含量間均存在顯著線性正相關(guān)性，而紫丁香、紫藤、蘿藦、苣荬菜以及車前則存在無(wú)顯著關(guān)系。因此，在測(cè)定不同物種間葉綠素時(shí)，如兩種方法間存在顯著相關(guān)性，優(yōu)先選擇方便、快捷且無(wú)損的便攜式SPAD葉綠素儀；如出現(xiàn)無(wú)顯著關(guān)系的結(jié)果，在選擇實(shí)驗(yàn)方法時(shí)，可根據(jù)具體研究目的和內(nèi)容而定。