鉤枝藤抗腫瘤有效部位的制備及活性篩選

陳 靜, 李珂珂, 弓曉杰,

(1.大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連116622;2.大連民族大學 生命科學學院, 遼寧 大連116605)

鉤枝藤(Ancistrocladustectorius,A.tectorius)是鉤枝藤科(Ancistrocladaceae)鉤枝藤屬(Ancistrocladus)的一種藤本植物，屬內(nèi)約有20個種，分布于亞、非大陸熱帶地區(qū)[1-3]。中國只有A.tectorius一種，生長于海南島[4]，在當?shù)刈鳛槔枳宓拿耖g藥物使用，主要用于治療瘧疾、寄生蟲感染等疾病[5]。

近年來國內(nèi)外的研究表明，鉤枝藤的提取物或從鉤枝藤中分離得到的化合物單體在體外具有良好的抗腫瘤活性。2013年Jiang[6]等從鉤枝藤莖和葉的70%乙醇提取物中分離得到 18個萘基異喹啉類生物堿化合物，活性測試發(fā)現(xiàn)化合物ancistrotectorine E對HL-60、K562和U937三種人白血病腫瘤細胞系表現(xiàn)出較強的抑制活性，IC50值分別為1.70、4.18和2.56 μM；2015年，蔡彩虹[7]等采用MTT法對鉤枝藤的生物活性成分進行了體外研究，發(fā)現(xiàn)鉤枝藤乙醇提取物對人白血病細胞 K562、胃癌細胞 SGC-7721、肝癌細胞 BEL-7402均具有良好的抑制活性，并與陽性對照紫杉醇的抑制活性相當。

基于上述研究結(jié)果，本研究將對中國海南島所產(chǎn)的鉤枝藤，利用人白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7、結(jié)腸癌SW-480等5種腫瘤細胞系進行系統(tǒng)的抗腫瘤活性篩選，從而得到有效部位，為進一步單體化合物的分析制備及藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

鉤枝藤于2018年6月采于海南省昌江縣，經(jīng)大連民族大學弓曉杰教授鑒定，憑證標本(No. 201806)存放于大連民族大學生命科學學院天然產(chǎn)物研究室。腫瘤細胞株HL-60、A549、SMMC-7721、MCF-7和SW-480 細胞均購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎(chǔ)研究所細胞庫。

1.2 鉤枝藤的提取

鉤枝藤莖枝(40 kg)晾干粉碎，用95%乙醇(135 L × 2)在70 °C下回流提取2次，每次2 h，藥渣再用70%乙醇在80°C下提取1次，提取液經(jīng)減壓濃縮，得到95%乙醇提取物(GZT-1，2.34 kg)，70%乙醇提取物(GZT-2，1.34 kg)。

1.3 萃 取

將GZT-1用少量水分散溶解，先用環(huán)己烷(1L × 6，3次)萃取，收集上清液，得到環(huán)己烷層萃取物(GZT-3，38 g)；再用二氯甲烷(1L × 4，

3次)萃取，收集下層萃取液，得到二氯甲烷層(GZT-5，350 g)；余下的濃縮后得到水層(GZT-4，68 g)。

1.4 流份制備

將萃取物GZT-5(300 g)進行二醇基柱色譜閃式層析，采用梯度洗脫，洗脫劑依次為環(huán)己烷:二氯甲烷(9:1)、二氯甲烷:乙酸乙酯(20:1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯:甲醇(5:1)及甲醇。每個梯度均洗脫至洗脫液無色，分別收集各個洗脫液，得到5個流份GZT-6、GZT-7、GZT-8、GZT-9、GZT-10。

1.5 有效部位初篩

以人白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7及結(jié)腸癌SW480 細胞為指示瘤株， 以3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺吩基)-2H-四唑鎓(MTS； Promega，中國北京)法測定各個萃取物或流份的細胞毒活性。將處于對數(shù)周期的細胞接種到96孔板中(3000～15000個細胞/孔)，每孔100 μL。在37 °C下培養(yǎng)12～24 h后，加入用DMSO溶解的100 μg·mL-1的每種待測樣品溶液中，每孔200 μL，每種處理設(shè)三組平行試驗。在37° C下培養(yǎng)48 h后，每孔添加20 μL MTS溶液和100 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液(DMEM或RMPI1640)，繼續(xù)孵育2～4 h，使反應充分進行，在492 nm的波長下測量吸光度，繪制抑制率圖。

1.6 有效部位復篩

將處于對數(shù)周期的上述5種細胞以每孔100 μL的體積接種到96孔板中(3 000～1 5000個細胞/孔)。在37 °C下培養(yǎng)12～24 h后，加入待測樣品，樣品均用DMSO溶解，設(shè)置100 μg·mL-1、20 μg·mL-1、4 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1及0.16 μg·mL-1共5個濃度梯度，每孔終體積200 μL，每種平行處理3份。在37° C下培養(yǎng)48 h后，每孔添加20 μL MTS溶液和100 μL DMEM或RMPI1640培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育2～4 h，使反應充分進行，在492 nm的波長下測量吸光度。以順鉑和紫杉醇(Sigma，St.Louis，MO，USA)作為陽性對照藥。用IC50表示每個化合物的細胞毒活性，通過Reed和Muench方法計算IC50值，結(jié)果見表1。

表1 鉤枝藤樣品的細胞毒活性

2 結(jié)果與分析

2.1 鉤枝藤提取物抗腫瘤有效部位的制備

為了能得到較精準的有效部位，本研究在藥材提取及萃取后，對萃取物GZT-5進行了正相色譜的閃式柱層析。根據(jù)已有報道，鉤枝藤中主要的化學成分為萘基異喹啉類生物堿，此類成分的極性中等偏小，因此首次選用二醇基作為柱層析填料制備得到了5中極性大小不同的鉤枝藤流份，為其抗腫瘤有效部位篩選奠定了基礎(chǔ)。

2.2 有效部位初篩

以MTS法測定制備得到的鉤枝藤GZT-1～GZT-10分別對白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7及結(jié)腸癌SW-480 腫瘤細胞的生長抑制活性，結(jié)果如圖1。

由圖1可知，在100 μg·mL-1濃度下， GZT-1、GZT-5、GZT-7、GZT-8、GZT-9對白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7及結(jié)腸癌SW-480等細胞均有良好的半數(shù)抑制活性； GZT-2對乳腺癌MCF-7細胞具有較好的抑制活性；GZT-3對肺癌A549和乳腺癌MCF-7細胞具有較好的抑制活性； GZT-6對肺癌A549、乳腺癌MCF-7和結(jié)腸癌SW-480細胞具有良好的半數(shù)抑制活性； GZT-10對白血病HL-60、乳腺癌MCF-7和結(jié)腸癌SW480細胞具有良好的半數(shù)抑制活性。根據(jù)上述得到的初篩結(jié)果，將有針對性地開展進一步的復篩實驗，測定其IC50值。

2.3 有效部位復篩

根據(jù)上述初篩的實驗結(jié)果，采用MTS法又分別測定了相關(guān)萃取物或流份的IC50值。結(jié)果見表1。陽性對照藥結(jié)果見表2。

表2 陽性對照藥的細胞毒活性

由表1和2可知，GZT-3及GZT-6對肺癌A549細胞具有較強的抑制活性及顯著的選擇性，IC50值分別為2.46、2.77 μg·mL-1，抑制作用分別是陽性藥順鉑的7.8倍和7.0倍。對于乳腺癌MCF-7及結(jié)腸癌SW-480細胞，GZT-5、GZT-7、 GZT-8及GZT-9都有不同程度的抑制活性，但抑制效果不如GZT-3及GZT-6對肺癌A549的作用強，且沒有表現(xiàn)出腫瘤選擇性。對于白血病HL-60及肝癌SMMC-7721細胞，所測樣品的半數(shù)抑制濃度較大，細胞毒活性相對較弱。

3 結(jié) 論

隨著藥學及分子生物學技術(shù)在醫(yī)學研究領(lǐng)域的快速發(fā)展，癌癥的藥物治療逐漸趨于精準化，靶向藥物可以增強對腫瘤細胞的殺傷力，同時減少對正常細胞的毒副作用，已成為癌癥藥物治療的研究熱點。本研究通過對黎藥鉤枝藤的提取及色譜分離，采用MTS法測定了不同萃取物及流份的細胞毒活性，結(jié)果表明GZT-3及GZT-6對肺癌A549細胞具有顯著抑制作用及選擇性，提示GZT-3及GZT-6為鉤枝藤抗腫瘤的有效部位。基于A549為非小細胞肺癌細胞系，因此，在今后的研究中，可以深入研究此有效部位抗肺癌的作用機制，同時闡明有效部位的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，為開發(fā)新的非小細胞肺癌藥物提供有效來源。