場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器用于細(xì)胞研究進(jìn)展

周 瑩，張國(guó)軍，李玉桃

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，湖北武漢 430065)

1 引言

細(xì)胞是生命的起源，是生命體結(jié)構(gòu)與生命活動(dòng)的基本單元。而細(xì)胞間信息與信號(hào)傳導(dǎo)是實(shí)現(xiàn)生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。信號(hào)通路的傳導(dǎo)異常會(huì)導(dǎo)致多種系統(tǒng)疾病，因此監(jiān)測(cè)胞間信號(hào)分子的釋放，及細(xì)胞電生理的變化對(duì)闡明信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，疾病的早期診斷與治療具有重要意義[1,2]。近年來(lái)，多種檢測(cè)手段及成像技術(shù)飛速發(fā)展，在細(xì)胞研究方面取得了極大的進(jìn)展。如細(xì)胞膜片鉗技術(shù)[3]、微電極電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)[4]等在檢測(cè)細(xì)胞電生理和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)方面發(fā)揮了重要作用。然而細(xì)胞膜片鉗技術(shù)雖然精度高，但需要經(jīng)驗(yàn)豐富的人員進(jìn)行高精密的操作，難以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。電化學(xué)微陣列傳感器雖然可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，但僅限于電活性物質(zhì)，限制了其應(yīng)用范圍。此外熒光技術(shù)[5]也用于胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)示蹤，然而熒光染料的細(xì)胞毒性不可忽視，光漂白性也對(duì)長(zhǎng)時(shí)間的觀察帶來(lái)阻礙。

近年來(lái)，基于場(chǎng)效應(yīng)晶體管(FET)的生物傳感器因具有免標(biāo)記、靈敏度高、特異性好、響應(yīng)快速、易于集成等優(yōu)勢(shì)引起眾多研究人員的關(guān)注。FET在細(xì)胞水平的應(yīng)用可追溯于1991年，F(xiàn)romherz等[6]將水蛭神經(jīng)元置于柵介質(zhì)上，使輸出的電流受動(dòng)作電位的調(diào)節(jié)，成功檢測(cè)其細(xì)胞膜電位。如今，隨著科技的發(fā)展與研究人員的不斷努力，F(xiàn)ET生物傳感器已經(jīng)成為細(xì)胞分析領(lǐng)域重要的檢測(cè)工具。與傳統(tǒng)電化學(xué)傳感平臺(tái)相比，F(xiàn)ET生物傳感器件不受電活性物質(zhì)的限制，單純是靶標(biāo)分子自帶電荷引起的傳感信號(hào)，可以做到免標(biāo)記與實(shí)時(shí)檢測(cè)。并且，F(xiàn)ET傳感器僅在0.1 V低偏壓下工作，幾乎不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成影響(而其他的電化學(xué)傳感器檢測(cè)電壓則大于0.5 V)。這些突出的優(yōu)勢(shì)都使得FET生物傳感器成為細(xì)胞研究的重要工具。

2 場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器概述

2.1 場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器的構(gòu)造及用于細(xì)胞檢測(cè)的傳感機(jī)制

FET生物傳感器由信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)放大的FET元件和生物信號(hào)識(shí)別元件兩部分組成，將分子間的相互作用轉(zhuǎn)化為可測(cè)量的電學(xué)信號(hào)。FET器件通常由沉積在襯底材料的源極、漏極以及施加?xùn)艍旱臇艠O三個(gè)電極構(gòu)成，使用半導(dǎo)體材料連接源、漏電極構(gòu)成導(dǎo)電溝道。柵極施加的柵壓可調(diào)節(jié)溝道電流，控制器件的“開(kāi)”和“關(guān)”。溝道電流在柵極的調(diào)控下可放大輸出，所以FET器件自身有放大電學(xué)信號(hào)的特點(diǎn)，適合作為生物傳感器的電學(xué)轉(zhuǎn)化元件。生物分子對(duì)溝道電導(dǎo)微小的變化可通過(guò)FET放大輸出，極大的提高了其靈敏度。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)生物分子的傳感，通常在溝道上修飾生物識(shí)別分子捕獲靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子與溝道材料相互作用改變溝道電導(dǎo)，輸出電特性變化。由于納米材料具有高比表面積，所以使用納米半導(dǎo)體材料作為溝道的FET器件，尤其是單層納米材料，幾乎每個(gè)原子都可與生物分子相互作用，因此微量的靶標(biāo)分子就能使納米溝道的電導(dǎo)發(fā)生顯著改變，這是FET型生物傳感器高敏感的基礎(chǔ)[7]。

為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平動(dòng)態(tài)檢測(cè)，通常選擇生物相容性好的納米材料(如石墨烯、碳納米管等)以及性質(zhì)穩(wěn)定的硅基底。將細(xì)胞培養(yǎng)在傳感器表面，使用Ag/AgCl電極作為柵極調(diào)控溝道內(nèi)電流。當(dāng)細(xì)胞釋放的信號(hào)分子在傳感器表面擴(kuò)散時(shí)，帶電生物分子與溝道表面通過(guò)親和性結(jié)合或者吸附聚集在溝道表面，產(chǎn)生靜電柵控效應(yīng)或電荷摻雜效應(yīng)從而改變溝道電導(dǎo)[7,8]，輸出電流或者電導(dǎo)變化，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平對(duì)生物分子的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

2.2 場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器的制備流程及其用于生物檢測(cè)

2.2.1 常用納米材料的制備納米材料在物理、化學(xué)、光學(xué)、電學(xué)方面的獨(dú)特性能使其成為傳感器應(yīng)用的候選材料。目前FET傳感器中常用的納米材料有硅納米線(SiNW)、碳納米管(CNTs)、石墨烯、MoS2。其中SiNW組件的合成方法可分為“自上而下”的刻蝕法和“自下而上”的化學(xué)氣相沉積(CVD)生長(zhǎng)法[9,10]。相比之下，CVD生長(zhǎng)法更具優(yōu)勢(shì)，因其可產(chǎn)生直徑小、質(zhì)量高的單晶納米線，但后續(xù)需要對(duì)其進(jìn)行排列。CNTs的合成主要有三種方法:電弧放電法[11]、激光燒蝕法[12]、CVD法[13]。FET器件中用到的為半導(dǎo)體CNTs，需要從金屬管的混合物中分離。石墨烯的制備方法主要有機(jī)械剝離法[14]、碳化硅外延生長(zhǎng)法[15]、CVD生長(zhǎng)法[16]和還原氧化石墨烯法[17]。其中CVD法生長(zhǎng)的石墨烯缺陷最?。贿€原的氧化石墨烯(RGO)并未將氧化石墨烯中所有的sp3缺陷恢復(fù)成sp2鍵，因此只能恢復(fù)部分電學(xué)性能。MoS2的制備方法主要分為微機(jī)械剝離法、鋰離子插層法、液相超聲法和CVD法[18]。CVD法制備的二維MoS2納米片具有優(yōu)異的電學(xué)性能，然而均勻的大面積合成仍需努力。此外，也有其他的一些有機(jī)材料用于制備有機(jī)場(chǎng)效應(yīng)晶體管，這里暫不做討論。

2.2.2 場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器的制備FET芯片采用標(biāo)準(zhǔn)的光刻技術(shù)，如紫外光刻和電子束光刻將源極和漏極圖案化到襯底上，再用金屬蒸鍍技術(shù)沉積兩個(gè)金屬電極，最后將合成的納米半導(dǎo)體材料轉(zhuǎn)移到襯底上作為導(dǎo)電溝道連接源、漏電極制得場(chǎng)效應(yīng)晶體管器件。采用微納半導(dǎo)體制備技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)FET芯片低成本、批量制造。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)分子的特異性響應(yīng)，需將生物識(shí)別元件，包括抗體、受體、酶、核酸適配體等固定在半導(dǎo)體溝道上，使之可以特異性的捕獲或者催化待測(cè)的靶標(biāo)分子，又稱為表面功能化，主要分為以共價(jià)鍵結(jié)合為主的化學(xué)修飾法，和以π-π堆積、靜電作用力吸附為主的物理修飾法。例如化學(xué)修飾法中，偶聯(lián)劑3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)可在SiNW表面引入氨基，抗體中的羧基可與其形成酰胺鍵穩(wěn)定固定在硅基表面。物理吸附的典型例子是帶負(fù)電的DNA探針可通過(guò)靜電作用力吸附在帶正電荷的傳感器表面，但需避免非特異性吸附[19,20]。根據(jù)溝道材料與生物識(shí)別元件的特性，選擇合適的方法實(shí)現(xiàn)表面功能化。

2.3 場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器在核酸和蛋白質(zhì)檢測(cè)方面的應(yīng)用

核酸是生物的遺傳物質(zhì)，蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)。近十年來(lái)，發(fā)展了多種FET生物傳感器用于核酸和蛋白質(zhì)的檢測(cè)。對(duì)于DNA的檢測(cè)多采用序列特異性雜交的檢測(cè)策略，即在傳感溝道上固定與靶標(biāo)DNA序列完全互補(bǔ)的探針?lè)肿?，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)特異性捕獲靶標(biāo)DNA。Cai等[17]報(bào)道了一種基于RGO的FET生物傳感器檢測(cè)DNA，使用電中性的肽核酸(PNA)作探針?lè)肿樱瑴p小了兩條雜交鏈之間的靜電斥力，提高了雜交效率，檢測(cè)限達(dá)到100 fmol/L。Zheng等[16]開(kāi)發(fā)了一種基于CVD生長(zhǎng)的單層石墨烯FET生物傳感器用于檢測(cè)DNA，由于單層石墨烯溝道增大了比表面積，將靈敏度提升了一個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè)限達(dá)到了10 fmol/L。Liu等[21]使用CVD生長(zhǎng)的單層MoS2構(gòu)建的FET生物傳感器檢測(cè)唐氏綜合征相關(guān)的DNA片段，規(guī)避了石墨烯類FET器件電流難以完全關(guān)斷的問(wèn)題。并且在固定DNA探針之前使用金納米顆粒(Au NPs)修飾MoS2溝道，增大溝道表面積以結(jié)合更多的DNA探針，檢測(cè)限進(jìn)一步提升，低至0.1 fmol/L，可以對(duì)孕產(chǎn)婦進(jìn)行產(chǎn)前篩查，降低唐氏患兒的出生率。

對(duì)于蛋白的檢測(cè)多采用抗體作為識(shí)別分子，利用抗原抗體的特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的選擇性檢測(cè)。Lei等[22]開(kāi)發(fā)了一種集成型FET生物傳感器，結(jié)合自制的過(guò)濾器，能夠直接檢測(cè)全血中的腦鈉肽(BNP)，具有較高的靈敏度和特異性。此外，作者使用鉑納米顆粒(Pt NPs)修飾RGO溝道，一方增大了比表面積，另一方面也增強(qiáng)了溝道的導(dǎo)電性，最終BNP的檢測(cè)限為100 fmol/L。Okamoto等[23]構(gòu)建了基于機(jī)械剝離的單層石墨烯FET生物傳感器，可以對(duì)熱休克蛋白(HSPs)進(jìn)行特異性檢測(cè)。作者使用IgG抗體中抗原結(jié)合位點(diǎn)的Fab片段作HSPs識(shí)別分子，其尺寸僅為3～5 nm，使靶標(biāo)蛋白更接近傳感溝道表面，減小電荷屏蔽作用，該傳感器的檢測(cè)限為100 pmol/L。

FET傳感器免標(biāo)記的特點(diǎn)使核酸和蛋白的檢測(cè)步驟簡(jiǎn)化，縮短了檢測(cè)時(shí)間，避免了生物靶標(biāo)分子的失活與分解。此外，其微型化的尺寸易于與其他系統(tǒng)集成，實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。結(jié)合FET傳感器自身超高的靈敏度和良好的特異性，在疾病標(biāo)志物的早期檢測(cè)方面有潛在的應(yīng)用前景。

3 場(chǎng)效應(yīng)晶體管生物傳感器在細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 細(xì)胞生理電信號(hào)檢測(cè)

電興奮性細(xì)胞受到刺激時(shí)膜離子通道打開(kāi)，胞內(nèi)外離子跨膜流動(dòng)產(chǎn)生生理電信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)，若細(xì)胞放電異常會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)系統(tǒng)疾病，如癲癇、心臟驟停等威脅生命健康。因此需在細(xì)胞層面對(duì)細(xì)胞生理電信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，為闡明疾病的發(fā)生機(jī)制提供幫助。

Lieber課題組[24]使用摻雜技術(shù)在合成的銳角SiNW上構(gòu)建FET，并將合成的納米尺度的SiNW-FET作為探頭組裝在可以向上彎曲的基底上，開(kāi)發(fā)了一種三維nanoFET(圖1A)。其對(duì)溶液pH的Nernst響應(yīng)高達(dá)58 mV/pH，電學(xué)性能極佳，滿足對(duì)細(xì)胞內(nèi)電生理檢測(cè)的要求。修飾了磷脂分子層的納米FET探測(cè)頭可通過(guò)細(xì)胞融合無(wú)損進(jìn)入雞胚心肌細(xì)胞，監(jiān)測(cè)到的電位出現(xiàn)規(guī)律間隔的峰值，詳細(xì)分析單個(gè)峰值，其5個(gè)特征符合心肌細(xì)胞的動(dòng)作電位。該團(tuán)隊(duì)所構(gòu)建的三維立體納米FET傳感器，可無(wú)損刺入細(xì)胞監(jiān)測(cè)胞內(nèi)電生理，具有較高的時(shí)間分辨率，且穩(wěn)定性好，可以進(jìn)行多次測(cè)量。隨后，他們將頂端直徑僅為3 nm的空心SiO2納米管集成在一個(gè)SiNW-FET的頂部，制成一個(gè)表面帶有直立納米管分支的FET器件，進(jìn)一步減小了探測(cè)頭的尺寸，能夠探測(cè)進(jìn)更微小的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，包括樹突和樹突棘(圖1B)[25]。修飾了磷脂的納米管可以自發(fā)的穿透細(xì)胞膜，當(dāng)跨膜電勢(shì)發(fā)生變化時(shí)，細(xì)胞質(zhì)的電勢(shì)變化會(huì)通過(guò)空心SiO2納米管直接影響SiNW-FET的電導(dǎo)。結(jié)果顯示電學(xué)信號(hào)具有胞內(nèi)動(dòng)作電位的形態(tài)和特征，構(gòu)建的分支FET生物傳感器可以產(chǎn)生穩(wěn)定的、全振幅的細(xì)胞內(nèi)動(dòng)作電位記錄，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)的細(xì)胞內(nèi)膜電位的監(jiān)測(cè)。

為了解決普遍SiNW-FET制備工藝產(chǎn)量低，SiNW長(zhǎng)度較短的問(wèn)題，Pui等[26]采用了與CMOS相兼容的“top-down”的半導(dǎo)體技術(shù)，制備了上百根長(zhǎng)度為100 μm的SiNW，均勻排列于傳感區(qū)域，制備了傳感面積可觀的陣列FET生物傳感器，可實(shí)時(shí)、無(wú)損的監(jiān)測(cè)細(xì)胞群乃至單個(gè)細(xì)胞的胞外電生理信號(hào)(圖1C)。該研究組分別監(jiān)測(cè)了大鼠心肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞兩種細(xì)胞模型的電生理信號(hào)，均出現(xiàn)了瞬時(shí)變化的雙相電流峰信號(hào)。結(jié)果顯示傳感器可成功將硅納米線與粘附細(xì)胞狹小間隙內(nèi)的細(xì)胞外電位轉(zhuǎn)化為溝道電流變化輸出，結(jié)合微流控管道，提高了通量，降低了成本，簡(jiǎn)化了操作，具備長(zhǎng)期的、連續(xù)的無(wú)創(chuàng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)能力。

圖1 (A)(Ⅰ) 三維納米FET器件的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像；(Ⅱ) 器件結(jié)構(gòu)示意圖；(Ⅲ) 微分干涉顯微鏡圖像顯示HL-1細(xì)胞和60°彎折的納米線探針接觸和內(nèi)化；(Ⅳ) 使用納米FET測(cè)得來(lái)自心胚細(xì)胞穩(wěn)定的胞內(nèi)電信號(hào)[24]。(B)(Ⅰ) 單個(gè)細(xì)胞與FET耦合的原理圖；(Ⅱ) SiNW上空心納米管的SEM圖像(插圖，納米管頂部和底部的放大圖[25])。(C)(Ⅰ) 一只跳動(dòng)的大鼠心臟放置在納米線芯片頂端的記錄室里；(Ⅱ) 納米線陣列的SEM圖像。(插圖為透射電子顯微鏡圖像，說(shuō)明了納米線的矩形截面；(Ⅲ) 通過(guò)納米線芯片監(jiān)測(cè)完好跳動(dòng)的心臟產(chǎn)生的電流信號(hào)(在左側(cè)的圖片中，一系列的電流尖峰與心臟跳動(dòng)是一致的[26]))。Fig.1 (A)(Ⅰ) SEM image of three-dimensional nanoFET device；(Ⅱ) Device structure diagram；(Ⅲ) Differential interference contrast microscopy image of an HL-1 cell and 60°kinked nanowire probe contact and internalize；(Ⅳ) Steady-state intracellular electrical recording from beating cardiomyocytes measured by nanoFET device[24].(B)(Ⅰ) Schematic showing a cell coupled to a FET；(Ⅱ) SEM image of a hollow nanotube on a SiNW.Insets,magnified images of the top and bottom of the nanotube[25].(C)(Ⅰ) A beating rat heart was placed in the recording chamber on top of a nanowire chip；(Ⅱ) SEM image of nanowires in array.The inset is a transmission electron microscope image illustrating the rectangular cross-section of a nanowire；(Ⅲ) Nanowire current from an intact beating heart was monitored by a nanowire chip.(In the left panel,a series of current spikes that was in concert with the heart beating is illustrated[26]).

石墨烯材料的應(yīng)用使FET類器件的制造有了新的選擇。Lieber課題組[27]率先在同一塊襯底上集成了石墨烯-FET與SiNW-FET，當(dāng)雞胚心肌細(xì)胞同時(shí)與兩個(gè)器件的傳感區(qū)域相接觸時(shí)，二者可并行檢測(cè)雞胚細(xì)胞的胞外生理電信號(hào)。使用石墨烯-FET記錄細(xì)胞外電信號(hào)時(shí)，器件從P型轉(zhuǎn)換為N型，信號(hào)相位發(fā)生了翻轉(zhuǎn)，有力的證實(shí)了電信號(hào)產(chǎn)生于場(chǎng)效應(yīng)，這是其他單極性的材料所無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。在石墨烯-FET與SiNW-FET并行檢測(cè)雞胚細(xì)胞電生理實(shí)驗(yàn)中，二者輸出信號(hào)的峰間寬度相似，然而事實(shí)上石墨烯-FET的面積比硅納米線FET的面積幾乎大了100倍。這表明在多類型器件集成的多路復(fù)用檢測(cè)生物傳感器中，還需要更多的研究時(shí)間分辨率、電極尺寸等問(wèn)題對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

3.2 神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)

神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的“信使”作用，分泌異常會(huì)引起復(fù)雜的神經(jīng)功能障礙，嚴(yán)重影響大腦機(jī)能。例如帕金森氏癥、精神分裂癥、阿爾茲海默癥均與神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放異常相關(guān)，因此對(duì)于這類神經(jīng)遞質(zhì)快速，靈敏的檢測(cè)不僅在臨床上具有重要意義，也推動(dòng)了對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)信號(hào)通路的進(jìn)一步研究。Cho等[28]開(kāi)發(fā)了一種基于碳納米管的FET生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了高鉀刺激下細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺(DA)的實(shí)時(shí)檢測(cè)。他們通過(guò)制備帶負(fù)電荷的Nafion-ABTS+薄膜，靜電吸引水溶液中帶正電荷的DA分子到傳感溝道附近。多巴胺與ABTS+發(fā)生氧化還原反應(yīng)生成的H+在nafion膜中擴(kuò)散，增加了傳感溝道附近的正電荷密度，進(jìn)而改變電導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)對(duì)DA的實(shí)時(shí)響應(yīng)，檢測(cè)限低至10 nmol/L。該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步將PC12細(xì)胞懸液引入傳感溝道，并且通過(guò)檢測(cè)匹莫齊特藥物作用下的PC12細(xì)胞在高鉀刺激下DA的釋放量，可以有效評(píng)估該抗精神病藥物的療效。同樣是對(duì)PC12細(xì)胞釋放的DA實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，Chen課題組[29]通過(guò)在FET溝道表面固定對(duì)DA分子具有高親和力的核酸適配體，構(gòu)建了超靈敏的SiNW-FET傳感器，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)缺氧條件下誘導(dǎo)PC12細(xì)胞釋放的DA(圖2A、2B)。該傳感器對(duì)DA的檢測(cè)限低至10 pmol/L。隨后，Chen課題組[30]又將對(duì)神經(jīng)肽(NPY)具有高親和力的核酸適配體固定在SiNW傳感溝道表面構(gòu)建FET生物傳感器，并在亞秒水平直接檢測(cè)PC12細(xì)胞分泌的NPY。利用這種適配體修飾的FET傳感器，他們繼續(xù)深入研究了組胺刺激PC12細(xì)胞釋放NPY和DA的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制，證明組胺在較低水平時(shí)誘導(dǎo)明顯的NPY釋放，但DA分泌很少；此后，PC12細(xì)胞在高組胺濃度誘導(dǎo)下分泌的DA會(huì)使細(xì)胞周圍的局部DA濃度升高，成為抑制NPY釋放的反饋因子。該傳感器對(duì)于目標(biāo)分子的高特異性與高靈敏度，可進(jìn)一步用于研究神經(jīng)遞質(zhì)的釋放動(dòng)力學(xué)，以了解神經(jīng)元如何協(xié)同釋放這些信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)突觸。

最近Li等[31]直接在石墨烯-FET傳感芯片上培養(yǎng)原代分離的海馬神經(jīng)元，并對(duì)該神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)(圖2C、2D)。他們將人工合成的代謝型谷氨酸受體(mGluR)固定在石墨烯傳感溝道上，mGluR對(duì)谷氨酸具有高度的特異性，當(dāng)谷氨酸與mGluR結(jié)合時(shí)，可以改變溝道內(nèi)載流子的濃度從而引起電流變化進(jìn)行傳感。該傳感器對(duì)谷氨酸的檢出限低至1 fmol/L。該傳感器首次實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞釋放非電活性信號(hào)分子的直接原位實(shí)時(shí)檢測(cè)，為非電活性信號(hào)分子的檢測(cè)提供了一種新的檢測(cè)平臺(tái)。

圖2 (A) SiNW-FET傳感器的實(shí)驗(yàn)示意圖，用于監(jiān)測(cè)缺氧條件下誘導(dǎo)PC12細(xì)胞釋放DA[29]；(B) 使用SiNW-FET實(shí)時(shí)記錄PC12細(xì)胞(底部插圖：光鏡圖)在低氧緩沖液刺激下釋放的DA。頂部插圖顯示的是未接種細(xì)胞的傳感器進(jìn)行實(shí)時(shí)記錄的對(duì)照實(shí)驗(yàn)[29]；(C)RGO-FET傳感器用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)高K+刺激下神經(jīng)元釋放谷氨酸示意圖[31]；(D)實(shí)時(shí)記錄高K+刺激下海馬神經(jīng)元釋放的谷氨酸[31]。Fig.2 (A) Illustration of the experience of SiNW-FET device for detecting exocytotic DA under hypoxic stimulation from living PC12 cells[29]；(B) Real-time recording of DA relased from PC12 cells seeded with SiNW-FET(bottom inset:optical microscopy image) upon addition of hypoxic buffer.Top inset shows a control test using the same SiNW-FET but without cells seeding[29]；(C)Schematic of RGO-FET biosensor is used for real time recording of glutamate released from neuron upon addition of high K+ stimulus[31]；(D) Real-time monitoring of glutamate released from hippocampal neurons upon addition of high K+ stimulus[31].

3.3 其他細(xì)胞信號(hào)分子檢測(cè)

活性氧(ROS)分子是細(xì)胞氧化代謝的產(chǎn)物，正常情況下參與細(xì)胞信號(hào)的傳遞，但它超出正常范圍時(shí)，會(huì)引起各類疾病。如H2O2會(huì)導(dǎo)致DNA分子的氧化損傷，誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生；NO的失調(diào)與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等一系列心血管疾病密切相關(guān)。但ROS在體內(nèi)半衰期短，不穩(wěn)定，因此對(duì)這類分子的檢測(cè)需快速且準(zhǔn)確。Zhang課題組[32]報(bào)道了一種基于RGO-鐵卟啉功能化的石墨烯-FET生物生物傳感器，借助鐵卟啉對(duì)NO獨(dú)特的催化特性以及石墨烯優(yōu)良的導(dǎo)電性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞釋放的NO進(jìn)行高靈敏的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)(圖3A)。構(gòu)造的NO生物傳感器對(duì)NO的檢出限低至1 pmol/L，并且傳感界面對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)友好，可以對(duì)單細(xì)胞釋放的NO進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。近年來(lái)，該課題組[33]使用具有催化性能的MoS2，構(gòu)造了基于MoS2-RGO復(fù)合材料的FET生物傳感器，無(wú)需修飾活性信號(hào)分子，借助MoS2優(yōu)越的催化性能和RGO卓越導(dǎo)電性，可直接快速監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞釋放的痕量H2O2。在檢測(cè)過(guò)程中MoS2可發(fā)揮類過(guò)氧化物酶的作用，催化H2O2分解釋放H+，誘導(dǎo)N型摻雜，改變溝道電導(dǎo)從而引起輸出電流變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的傳感。

Zn2+參與調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，是大腦具備多種功能不可或缺的金屬離子，然而過(guò)量的Zn2+對(duì)神經(jīng)元具有一定的毒性，而且會(huì)促進(jìn)β-淀粉蛋白(Aβ)的聚積，增加神經(jīng)退化和阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)。Anand等[34]利用對(duì)Zn2+具有高親和力的分子修飾在FET溝道表面，構(gòu)造了高靈敏的SiNW-FET生物傳感器，深入研究Zn2+的釋放對(duì)Aβ的調(diào)節(jié)作用(圖3B)。傳感器成功測(cè)得興奮后大腦皮層神經(jīng)元釋放的Zn2+濃度可上升至110 nmol/L，且證明釋放前主要儲(chǔ)存于突觸小泡內(nèi)。另一方面，將可與Zn2+結(jié)合的β-淀粉蛋白固定在SiNW-FET表面，用以檢測(cè)細(xì)胞釋放的Zn2+對(duì)Aβ的聚集作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明100 nmol/L的Zn2+水平足以形成Zn2+-Aβ聚合物，可能進(jìn)一步引起β-淀粉蛋白原纖維的形成，對(duì)神經(jīng)元具有毒性。

人體中的Ca2+調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、心肌細(xì)胞的興奮-收縮節(jié)律、免疫細(xì)胞的活化等多種細(xì)胞活動(dòng)活動(dòng)，因此對(duì)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測(cè)有助于各類系統(tǒng)疾病的進(jìn)一步研究。Son等[35]報(bào)道了利用拉制的硼硅酸鹽毛細(xì)管構(gòu)建針形場(chǎng)效應(yīng)晶體管，尖端直徑在亞微米級(jí)別，突破了傳統(tǒng)芯片F(xiàn)ET尺寸較大，難以應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)的限制，成功的對(duì)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+進(jìn)行檢測(cè)(圖3C)。研究人員利用Fluo-4-AM分子可以結(jié)合Ca2+并發(fā)出熒光的特性，將其作為探針?lè)肿庸潭ㄔ跍系辣砻?。納米針尖的微小尺寸使其易于刺入細(xì)胞內(nèi)，Ca2+特異性結(jié)合在溝道表面改變了溝道內(nèi)載流子濃度，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)胞內(nèi)Ca2+濃度變化。另一方面，探針捕獲Ca2+后發(fā)出熒光信號(hào)，成功對(duì)胞內(nèi)Ca2+進(jìn)行電學(xué)、熒光雙信號(hào)傳感。

Zhang等[36]同樣開(kāi)發(fā)了一種尖端直徑僅為200 nm的矛狀納米FET傳感器，可用于細(xì)胞環(huán)境乃至細(xì)胞內(nèi)的檢測(cè)(圖3D)。作者將聚吡咯(PPy)沉積在矛狀FET尖端連接雙管內(nèi)的碳納米電極作為溝道。當(dāng)溶液中H+濃度增高時(shí)，PPy中吡咯氮發(fā)生質(zhì)子化，使電導(dǎo)發(fā)生變化進(jìn)行傳感，因此PPy-FET可作為pH傳感器，置于癌細(xì)胞叢檢測(cè)胞外酸中毒，對(duì)癌癥具有早期提示作用。此外，研究人員將己糖激酶固定在PPy溝道表面，在己糖激酶參與的糖酵解反應(yīng)中，每裂解一分子ATP釋放一個(gè)質(zhì)子，可以被生物傳感器感應(yīng)到，檢測(cè)限低至10 nmol/L。這種尖針型FET具備尖端尺寸小和FET靈敏度高的特點(diǎn)，在未來(lái)有可能成為細(xì)胞外環(huán)境以及細(xì)胞內(nèi)分析的有力工具。

圖3 (A) 用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞NO釋放的FET生物傳感器原理圖[32]；(B) SiNW-FET生物傳感器的示意圖(生長(zhǎng)了皮質(zhì)神經(jīng)元的蓋玻片倒扣在傳感器表面，使神經(jīng)元可與傳感器表面親密接觸。右側(cè)圖片是FET傳感器的光鏡圖[34])；(C) 使用基于晶體管的納米針形傳感器測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣離子的示意圖[35]；(D) 左側(cè)是納米FET的結(jié)構(gòu)示意圖，右側(cè)是nano-FET探針靠近單個(gè)細(xì)胞的光鏡圖[36]。Fig.3 (A) Schematic diagram of the FET biosensor for real-time monitoring of NO release from cell[32]；(B) Schematic illustration of a SiNW-FET biosensor.The cortical neurons grown on a coverslip were placed in intimate contact with the SiNW-FET(In the right panel,an optical microscopy image of a SiNW-FET device[34]；(C) Schematic diagram depicting measurement of intracellular calcium ions using a nanoneedle-shape transistor-based sensor[35]；(D) In the left panel,structural diagram of a nanometer-scale FET，in the left panel,an optical microscopy image of a nano-FET probe approaches a single cell[36].

4 小結(jié)與展望

FET生物傳感器結(jié)合活細(xì)胞，具有原位監(jiān)測(cè)的優(yōu)勢(shì)，可以實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞電生理，也可應(yīng)用于細(xì)胞信號(hào)分子釋放的研究，是研究細(xì)胞功能與生理或病理聯(lián)系的重要工具。與其他傳感器相比，F(xiàn)ET檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便快速、無(wú)需標(biāo)記。器件自身的電學(xué)放大特性使此類傳感器靈敏度大大提高，并且半導(dǎo)體集成技術(shù)使FET傳感芯片可進(jìn)行高通量的檢測(cè)。隨著材料科學(xué)、納米科學(xué)以及微納加工技術(shù)的飛速發(fā)展，F(xiàn)ET生物傳感器的穩(wěn)定性和電學(xué)性能得以提升，其靈敏度和特異性滿足在細(xì)胞水平對(duì)靶標(biāo)分子超靈敏、實(shí)時(shí)、原位監(jiān)測(cè)的要求，這些優(yōu)異的特性使得FET生物傳感器在細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的信號(hào)分子檢測(cè)及電生理探測(cè)方面取得了重要進(jìn)展，也為細(xì)胞檢測(cè)研究提供了一種新的強(qiáng)有力工具和平臺(tái)。

FET生物傳感器未來(lái)可能有以下幾個(gè)發(fā)展方向：(1)FET與微流控系統(tǒng)的集成，在細(xì)胞檢測(cè)方面可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)與檢測(cè)的自動(dòng)化操作，減少外界環(huán)境與人為操作的影響，提高細(xì)胞傳感器的穩(wěn)定性。生物檢測(cè)方面，微流控體系有效減小樣品體積，并且能實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣本的分離檢測(cè)集成在一塊芯片上，可以發(fā)展成為POCT裝置使其能夠簡(jiǎn)單、便攜應(yīng)用于各種環(huán)境下的檢測(cè)。(2)發(fā)展新的納米材料用于連接源漏極溝道，進(jìn)一步提升FET生物傳感器的性能。(3)利用FET生物傳感器的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)合適的針型FET器件為活體檢測(cè)提供一種新的檢測(cè)工具和平臺(tái)，有望在生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得新的發(fā)現(xiàn)及突破性進(jìn)展。