熒光各向異性信號(hào)放大策略研究進(jìn)展

范埡玲，田智全,2，龐代文，張志凌*

(1.武漢大學(xué)化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072；2.西藏大學(xué)理學(xué)院，西藏拉薩 850000)

1 前言

20世紀(jì)50年代，Weber首次將熒光各向異性法應(yīng)用于生化分析領(lǐng)域，用于牛血清白蛋白和卵白蛋白的相互作用研究[1]。之后，熒光各向異性方法的研究越來(lái)越受到重視[2]。

上世紀(jì)80年代，隨著熒光探針和熒光各向異性分析儀器的商業(yè)化，熒光各向異性技術(shù)在生命科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域扮演著越來(lái)越重要的角色[3-5]。歸其原因主要有：(1)熒光各向異性分析屬于均相分析，不需要分離、洗滌步驟，操作簡(jiǎn)便[6,7]；(2)可直接、實(shí)時(shí)測(cè)定熒光探針的結(jié)合/解離速率[8]；(3)易于實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化分析[9-11]；(4)探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，只需要一個(gè)熒光分子標(biāo)記[12]。然而，由于檢測(cè)目標(biāo)分子的體積或質(zhì)量很小，與探針結(jié)合不能引起明顯的熒光各向異性值的改變，因此研究者們采用一些熒光各向異性信號(hào)放大策略來(lái)解決這一問(wèn)題，從而大大提高了該方法的靈敏度。本文對(duì)熒光各向異性法的檢測(cè)原理和信號(hào)放大策略展開綜述。

2 熒光各向異性法的檢測(cè)原理

2.1 基本原理

熒光各向異性是熒光分子的固有屬性。當(dāng)熒光分子定向排列后，熒光分子發(fā)出的熒光具有各向異性。此時(shí)，用取向垂直和水平的檢偏器就會(huì)檢測(cè)到不同的熒光強(qiáng)度。

1920年，Perrin等對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行理論研究，并提出了關(guān)于熒光各向異性值(r)的Perrin方程。對(duì)于熒光壽命值固定的熒光分子，若它在介質(zhì)中保持靜止不旋轉(zhuǎn)狀態(tài)，r非常大，趨近于1；若它在介質(zhì)中自由旋轉(zhuǎn)，r趨近于0。Perrin方程表明r值的大小與熒光分子的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)狀態(tài)有關(guān)，如下式：

(1)

(2)

其中，r為所測(cè)得的熒光各向異性值，r0為內(nèi)在各向異性，τ為熒光壽命，θ為旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間，R為氣體常數(shù)，T為絕對(duì)溫度，η為溶液粘度，V為旋轉(zhuǎn)體的體積。

由Perrin方程(1)和(2)可知，當(dāng)熒光壽命、溶液的粘度和溫度保持不變時(shí)，熒光體的體積(或質(zhì)量)增大時(shí)，熒光各向異性值增大；當(dāng)熒光體的體積(或質(zhì)量)減小時(shí)，熒光各向異性值減小[13-15]。通過(guò)反應(yīng)前后熒光體的分子體積(或質(zhì)量)的顯著改變可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的高靈敏檢測(cè)。然而檢測(cè)目標(biāo)分子的體積通常很小，與熒光探針結(jié)合后不能引起熒光各向異性值的顯著改變。因此，研究如何放大熒光各向異性信號(hào)，實(shí)現(xiàn)生物分子的高靈敏檢測(cè)成為研究熱點(diǎn)。

2.2 熒光各向異性探針

由Perrin方程(1)可知，熒光各向異性探針的熒光壽命(τ)應(yīng)與目標(biāo)分子的旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間(θ)具有相同的數(shù)量級(jí)。因此，在熒光各向異性分析中，熒光各向異性探針的選擇也非常關(guān)鍵。

基于熒光團(tuán)的性質(zhì)，熒光各向異性探針主要分為三類，如圖1所示。第一類是有機(jī)染料，例如Alexa Fluor488(AF488)、四甲基羅丹明(TMR)、熒光素(發(fā)射波長(zhǎng)：500～600 nm)，尼羅藍(lán)(Nile Blue)、德克薩斯紅(發(fā)射波長(zhǎng)：600～700 nm)等[16-24]。這些熒光染料具有良好的性能，如高量子產(chǎn)率、良好的穩(wěn)定性和易偶聯(lián)等。然而上述有機(jī)染料的熒光會(huì)受到樣品基質(zhì)的藍(lán)/綠色背景熒光的干擾[25]。因此，有機(jī)染料的熒光各向異性探針大部分只適用于緩沖溶液或稀釋血清，難于用于復(fù)雜生物樣品中，如全血等。第二類是過(guò)渡金屬配位化合物，主要是發(fā)射波長(zhǎng)在600～700 nm范圍的釕(Ⅱ)螯合物[26]。釕(Ⅱ)螯合物熒光壽命較長(zhǎng)，有利于區(qū)分探針-目標(biāo)分子復(fù)合物與游離探針間的熒光各向異性值差異。最后一類是熒光納米粒子，其發(fā)射波長(zhǎng)范圍為500～1 500 nm，主要包括染料摻雜的納米粒子和量子點(diǎn)(QDs)[27-32]。

圖1 熒光各向異性探針的種類Fig.1 Types of fluorescent anisotropic probes

近紅外熒光由于具有穿透組織深，組織和血液的散射小，吸收和自發(fā)熒光的干擾小的優(yōu)勢(shì)，在體內(nèi)成像領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[33]。近紅外熒光各向異性探針也引起了研究者極大的興趣[34,35]。例如，Deng等制備了一種亞甲基藍(lán)摻雜的近紅外熒光納米顆粒，并構(gòu)建近紅外熒光各向異性探針，實(shí)現(xiàn)了全血樣品中的甲胎蛋白(AFP)和急性白血病細(xì)胞的含量檢測(cè)[31,32]。QDs是具有巨大潛力的熒光各向異性探針，特別是發(fā)射波長(zhǎng)在第二近紅外窗口(NIR-Ⅱ，1 000～1 500 nm)的近紅外QDs[36,37]。與熒光有機(jī)染料相比，QDs具有光穩(wěn)定性好、發(fā)射光譜窄、尺寸可調(diào)、自發(fā)熒光干擾小等諸多優(yōu)勢(shì)[33]。近紅外二區(qū)QDs的熒光各向異性探針在復(fù)雜基質(zhì)方面具有廣闊前景。我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功制備了各種類型近紅外QDs，例如Ag2Te QDs、Ag2S QDs和Ag2Se QDs等[38-41]。

3 熒光各向異性信號(hào)放大策略

傳統(tǒng)熒光各向異性分析是基于熒光各向異性探針與目標(biāo)分子結(jié)合后引起的質(zhì)量發(fā)生變化[3,14,28]。但是，對(duì)于小分子分析物，很難得到有效的熒光各向異性信號(hào)變化。近年來(lái)，研究人員開發(fā)了各種熒光各向異性信號(hào)放大策略。從熒光各向異性方法的檢測(cè)原理可以看出，熒光各向異性值與結(jié)合物質(zhì)量，結(jié)合物的熒光壽命和結(jié)合物的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)自由程度有關(guān)?；诖耍瑹晒飧飨虍愋苑糯蟛呗钥煞譃橐韵氯?，其示意圖如圖2所示。

圖2 熒光各向異性信號(hào)放大策略的示意圖。(1)分子質(zhì)量；(2)熒光分子的自由轉(zhuǎn)動(dòng)程度；(3)熒光壽命Fig.2 Schematic representation of fluorescence anisotropic signal amplification strategy.(1) Mass amplifying strategy；(2) Degree of free rotation of fluorescent molecules；(3) Fluorescence lifetime

3.1 分子質(zhì)量放大熒光各向異性信號(hào)

當(dāng)溫度及溶液的粘度一定，熒光分子質(zhì)量是影響熒光各向異性值的最重要的原因之一。由于目標(biāo)分子的分子質(zhì)量比較小，通常引入分子質(zhì)量較大且穩(wěn)定性好的材料作為熒光各向異性信號(hào)放大器，例如蛋白質(zhì)、金納米顆粒(Au NPs)、氧化石墨烯(GO)等。

3.1.1 蛋白質(zhì)放大熒光各向異性信號(hào)蛋白質(zhì)是一類生物大分子，生物相容性好，具有較大的分子質(zhì)量和體積，能夠增強(qiáng)與之結(jié)合的熒光體的熒光各向異性信號(hào)。單鏈結(jié)合蛋白(Single-Strand Binding Proteins,SSB)，又名DNA結(jié)合蛋白，參與DNA復(fù)制過(guò)程，分子量約為70 kDa[42,43]。

Pryrin課題組[44]將SSB作為熒光各向異性信號(hào)放大器，實(shí)現(xiàn)了小分子ATP的檢測(cè)。之后Yang等[45]將凝血酶(分子量約為37 kDa)作為質(zhì)量放大器，設(shè)計(jì)了一種功能化核酸探針，其中包含ATP的核酸適配體(熒光素標(biāo)記)、凝血酶的核酸適配體和阻斷鏈。當(dāng)目標(biāo)靶物不存在時(shí)，探針的阻斷鏈將無(wú)法被取代，探針的結(jié)構(gòu)也未發(fā)生任何改變，因此熒光各向異性信號(hào)不會(huì)發(fā)生改變。加入ATP之后，ATP與核酸適配體特異性結(jié)合使阻斷鏈從探針上解鏈，并暴露凝血酶的核酸適配體部分。此時(shí)，凝血酶與核酸適配體結(jié)合，從而引起探針部分的分子量顯著增大，熒光各向異性值增大。通過(guò)熒光各向異性值的變化量實(shí)現(xiàn)對(duì)小分子ATP的定量檢測(cè)。

Tian等[46]將常用的熒光素標(biāo)記物換為CdTe-CdS QDs，利用特異性抗原抗體反應(yīng)放大熒光各向異性信號(hào)，實(shí)現(xiàn)ATP的高靈敏檢測(cè)。在QDs的表面偶聯(lián)捕獲DNA鏈，捕獲修飾有地高辛抗原的ATP核酸適配體，然后與抗體特異性結(jié)合形成復(fù)合物。加入ATP之后，核酸適配體從復(fù)合物上解離與ATP結(jié)合，此時(shí)QDs表面只剩下捕獲DNA鏈，熒光各向異性值顯著減小。通過(guò)蛋白質(zhì)放大熒光各向異性信號(hào)，熒光各向異性值變化范圍一般在0.03以下，檢測(cè)限通常為μmol/L水平，其檢測(cè)的靈敏度還有待提高[47-51]。

3.1.2 納米材料放大熒光各向異性信號(hào)與蛋白質(zhì)相比，納米材料具有很多優(yōu)勢(shì)，如熱穩(wěn)定性好、較大的體積和質(zhì)量、易于合成及表面修飾等。因此納米材料被用于放大熒光各向異性信號(hào),如Au NPs、Ag NPs、聚苯乙烯納米顆粒(PS NPs)和SiO2NPs等[52-57]。Ye等[58]提出利用Au NPs增強(qiáng)熒光各向異性信號(hào)實(shí)現(xiàn)金屬離子的高靈敏度檢測(cè)。該方法對(duì)Hg2+的檢測(cè)限為1 nmol/L,與不使用Au NPs的情況相比檢測(cè)限降低2個(gè)數(shù)量級(jí)。在此基礎(chǔ)上，Ye課題組[59]將DNA酶反應(yīng)信號(hào)放大技術(shù)與Au NPs結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Cu2+和Pb2+的檢測(cè)。同樣，Gao等[60]也通過(guò)Au NPs實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性的快速檢測(cè)。另外，Tian課題組[28]利用Au NPs放大熒光各向異性信號(hào)，通過(guò)抗原抗體作用形成復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)對(duì)ATP的檢測(cè)，檢測(cè)限低至1.8 pmol/L。

除了Au NPs外，科研工作者還將其它納米顆粒用于熒光各向異性信號(hào)放大。Yue等[61]利用三明治結(jié)構(gòu)，引入SiO2NPs作為熒光各向異性信號(hào)放大器，實(shí)現(xiàn)了0.2 nmol/L凝血酶的檢測(cè)。Qiu等[52]通過(guò)鏈酶親和素(Streptavidin,SA)和SiO2NPs結(jié)合共同放大熒光各向異性信號(hào)，實(shí)現(xiàn)乙型肝炎病毒的檢測(cè)，其檢出限為0.65 nmol/L。Huang等[55]將級(jí)聯(lián)鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)與PS NPs二者結(jié)合增強(qiáng)熒光各向異性信號(hào)，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)凝血酶的超靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)28 amol/L，與常規(guī)檢測(cè)方法相比降低了6個(gè)數(shù)量級(jí)。將納米顆粒作為熒光各向異性信號(hào)放大器可成功地實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的高靈敏檢測(cè)。但是上述方法都需要將DNA通過(guò)化學(xué)作用修飾到納米顆粒表面，其過(guò)程比較復(fù)雜，另外納米顆粒屬于零維納米材料，增加的分子量也相對(duì)有限。

一些獨(dú)特的二維納米材料很好地解決以上問(wèn)題，如碳納米材料[62-65]、MoS2[66]和TiS2[67]等。DNA可通過(guò)π-π堆積作用和范德華力吸附到氧化石墨烯(Graphene Oxide,GO)表面[68-72]。GO具有大體積和獨(dú)特的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)特性，因此與探針結(jié)合時(shí)會(huì)放大熒光各向異性信號(hào)[73]。Tan課題組[63]將修飾有熒光素的單鏈核酸適配體探針通過(guò)π-π作用吸附在GO的表面，由于GO質(zhì)量大、體積大使得熒光體轉(zhuǎn)動(dòng)較慢，熒光各向異性值變大。加入目標(biāo)物ATP之后，核酸適配體脫離GO的表面與目標(biāo)物結(jié)合從而使熒光各向異性值減小。Huang等[74]將GO和酶切循環(huán)放大二者結(jié)合設(shè)計(jì)熒光各向異性探針，實(shí)現(xiàn)了ATP的超靈敏度檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)2 pmol/L。由于熒光探針與GO作用較強(qiáng)，不易從GO表面脫離，檢測(cè)靈敏度受到一定限制[75]，Xiao等引進(jìn)捕獲DNA改變熒光探針與GO的結(jié)合方式，使探針更易從GO表面釋放，并結(jié)合一系列循環(huán)放大策略，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蓖麻素和microRNA的檢測(cè)[76-78]。Zhao等[79]利用碳納米管放大熒光各向異性信號(hào)，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)分析甲基轉(zhuǎn)移酶的活性及其抑制劑。

二維納米材料可以明顯放大熒光各向異性信號(hào)(熒光各向異性值變化范圍在0.15～0.35以內(nèi))，提高檢測(cè)靈敏度。但也存在一些問(wèn)題，如熒光各向異性探針的熒光易被GO猝滅，探針不易從GO的表面脫離，從而限制了檢測(cè)靈敏度[80,81]。

3.2 熒光分子自由轉(zhuǎn)動(dòng)程度放大熒光各向異性

當(dāng)熒光分子與生物大分子結(jié)合時(shí)，熒光各向異性值會(huì)受復(fù)合物的自由轉(zhuǎn)動(dòng)程度影響。熒光分子與質(zhì)量大的分子的距離越近，其自由轉(zhuǎn)動(dòng)能力越差，熒光各向異性值越大。Wang等[82]利用核酸適配體上熒光基團(tuán)與凝血酶距離的變化而引起的熒光各向異性值變化，在單個(gè)堿基水平研究核酸適配體與目標(biāo)蛋白的作用過(guò)程，為揭示適配體與靶分子作用的機(jī)理提供了理論支持。Zhang等[83]利用此原理實(shí)現(xiàn)了對(duì)凝血酶的高靈敏檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá)250 pmol/L。Perrier等[84]也利用類似放大策略實(shí)現(xiàn)了ATP的檢測(cè)。該放大策略的優(yōu)勢(shì)在于通過(guò)核酸適配體構(gòu)像變化直接檢測(cè)目標(biāo)物，檢測(cè)限通常比基于質(zhì)量放大策略低。

3.3 熒光壽命放大熒光各向異性信號(hào)

由Perrin方程可知，熒光各向異性值除了與熒光分子的質(zhì)量和體積及自由轉(zhuǎn)動(dòng)程度等有關(guān)，還與熒光壽命有關(guān)。如果熒光分子的熒光壽命較長(zhǎng)，隨著分子的快速轉(zhuǎn)動(dòng)，熒光就可能在各個(gè)方向上均勻分布，降低熒光各向異性值。

Wang小組[85]利用該原理研究了G-四鏈體(G-quadruplex)結(jié)構(gòu)的形成對(duì)熒光各向異性變化的影響。當(dāng)DNA單鏈沒(méi)形成G-四鏈體時(shí)，DNA上修飾的熒光分子與相鄰的堿基G發(fā)生分子內(nèi)作用，熒光被猝滅；當(dāng)形成G-四鏈體時(shí)，DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，由于空間位阻等因素?zé)晒夥肿訜o(wú)法與堿基G作用，熒光得以恢復(fù)，熒光壽命增加0.56 ns。該課題組利用該策略實(shí)現(xiàn)了對(duì)小分子赭曲霉素的檢測(cè)，檢測(cè)限為3 nmol/L[86]。Chovelon等用SYBR Green染料作為熒光標(biāo)記物，研究了其在游離態(tài)與DNA結(jié)合時(shí)熒光各向異性值的變化[87]。由于SYBR Green染料的熒光壽命(皮秒范圍)比其旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間(亞納秒范圍)小，游離SYBR Green的熒光各向異性非常大，約為0.3。與DNA結(jié)合后，熒光壽命增加，熒光各向異性值減小。當(dāng)加入目標(biāo)物后，目標(biāo)物與SYBR Green競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合DNA，導(dǎo)致大量SYBR Green呈游離狀態(tài)，熒光各向異性值改變。該方法具有簡(jiǎn)單易行、普適性、快速等優(yōu)勢(shì)，但是熒光各向異性信號(hào)微弱，影響檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

4 結(jié)論和展望

熒光各向異性檢測(cè)屬于均相分析方法，具有快速、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，是一種可靠且優(yōu)越的檢測(cè)方法。該方法可應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，如：蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用研究，藥物輸運(yùn)，食品安全檢測(cè)以及環(huán)境監(jiān)測(cè)等。針對(duì)小分子的熒光各向異性信號(hào)放大策略，包括分子質(zhì)量增強(qiáng)，熒光分子的自由旋轉(zhuǎn)和熒光壽命調(diào)控。這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在一定程度上放大了熒光各向異性信號(hào)，但是檢測(cè)靈敏度還有待進(jìn)一步提高。

基質(zhì)自發(fā)熒光一直是影響檢測(cè)方法準(zhǔn)確性的難題?；|(zhì)自發(fā)熒光來(lái)源復(fù)雜生物樣品中的某些蛋白質(zhì)或熒光分子。近年來(lái)，近紅外熒光納米材料(發(fā)射波長(zhǎng)為700～1 500 nm甚至更大)引起研究者的廣泛關(guān)注。近紅外熒光各向異性探針可能會(huì)大大降低基質(zhì)的自發(fā)熒光效應(yīng)。因此，近紅外熒光各向異性探針有望在復(fù)雜樣品(包括全血，未稀釋的細(xì)胞裂解緩沖液和尿液)中實(shí)現(xiàn)快速免分離分析。

熒光各向異性分析的優(yōu)勢(shì)可以滿足復(fù)雜樣品現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。因此，熒光各向異性分析在復(fù)雜生物基質(zhì)即時(shí)檢驗(yàn)(POCT)方面具有廣泛的應(yīng)用前景。