肼基標(biāo)記試劑在質(zhì)譜生化分析中的應(yīng)用

于 越，周穎琳*，張新祥*

(北京分子科學(xué)國家研究中心，生物有機(jī)與分子工程教育部重點實驗室，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871)

1 前言

質(zhì)譜(Mass Spectrometry，MS)具有定性能力強(qiáng)、靈敏度高、分析速度快等固有的優(yōu)點，是一種功能強(qiáng)大的檢測工具。自1942年第一臺商業(yè)化質(zhì)譜儀推出以來，質(zhì)譜技術(shù)便進(jìn)入了蓬勃發(fā)展的階段，各種各樣的離子源及質(zhì)量分析器被設(shè)計出來以拓展質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用范圍。迄今為止，質(zhì)譜技術(shù)，尤其是其與氣相色譜、液相色譜以及毛細(xì)管電泳聯(lián)用的技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于生化分析[1-3]、臨床檢測[4]、環(huán)境科學(xué)[5]、石油化學(xué)[6]、食品安全[7]等各個研究領(lǐng)域。

在生化分析中，盡管質(zhì)譜技術(shù)能夠進(jìn)行快速鑒定及準(zhǔn)確定量，但是仍然存在一些問題。一方面，在生物體內(nèi)，生物分子如糖、脂肪酸，以及生物化學(xué)修飾如蛋白質(zhì)糖基化、堿基修飾，它們通常具有較大的極性，并且沒有易電離的官能團(tuán)，使得它們在質(zhì)譜檢測中離子化效率較低。另一方面，一些化合物及化學(xué)修飾在生物體內(nèi)的豐度極低，受樣品中復(fù)雜基質(zhì)的干擾嚴(yán)重。這都使得這些生物分子及生物化學(xué)修飾無法獲得理想的質(zhì)譜檢測靈敏度，在分析模型中難以檢出或無法檢出，從而在一定程度上限制了質(zhì)譜對它們的深入研究。因此，提高難電離及低豐度待測物的質(zhì)譜離子化效率是研究者們亟待解決的問題。

化學(xué)衍生法已被證明是一種提高質(zhì)譜檢測靈敏度的有效方法。通過引入恰當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)改變目標(biāo)待測物的性質(zhì)，不僅能夠通過提高離子化效率改善質(zhì)譜檢測靈敏度[8,9]，還可以起到輔助結(jié)構(gòu)解析[10,11]、減少基質(zhì)干擾[12]、促進(jìn)異構(gòu)體分離[13,14]及穩(wěn)定待測物[15]等作用。近年來，化學(xué)標(biāo)記試劑層出不窮，在代謝組學(xué)[16]、蛋白組學(xué)[17,18]、環(huán)境分析[19]、食品安全[20]、質(zhì)譜成像[21]等多個研究領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。其中，肼基標(biāo)記試劑是標(biāo)記試劑中常見的一類。它能夠與帶有醛基(羰基)或羧基官能團(tuán)的化合物反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)活性較氨基更高，反應(yīng)速度更快，還可以結(jié)合特定基團(tuán)的引入提高電噴霧離子化效率和毛細(xì)管電泳分離，從而備受研究者們青睞。

在過去的幾年中，本課題組以及其他研究者開發(fā)了多種基于肼基標(biāo)記試劑衍生-質(zhì)譜分析的方法，對多種重要的生物分子及化學(xué)修飾進(jìn)行高靈敏和選擇性分析。本文將從糖及蛋白質(zhì)糖基化分析、堿基修飾分析、脂肪酸分析三個方面對肼基標(biāo)記試劑在質(zhì)譜生化分析中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)。

2 糖及蛋白質(zhì)糖基化分析

糖作為細(xì)胞識別的信息分子在生物體內(nèi)具有重要作用，如細(xì)胞相互作用[22]、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的形成[23]、免疫應(yīng)答[24]等。據(jù)估計，超過90%的人類蛋白質(zhì)都是糖基化的。糖基化作為蛋白翻譯過程中最廣泛也是最重要的修飾類型之一，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)中起著非常重要的作用，其水平與結(jié)構(gòu)的變化與風(fēng)濕病[25]、糖尿病[26]和癌癥[27,28]等疾病相關(guān)，被廣泛地視為潛在的生物標(biāo)志物。

由于糖自身極性很大且沒有發(fā)色基團(tuán)，無法直接使用熒光、質(zhì)譜等檢測方法進(jìn)行檢出。大部分糖的分析方法都要求對糖進(jìn)行衍生化。常見的糖衍生化方法有全甲基化/全乙酰化、還原胺化、肼基化和邁克爾加成。盡管還原胺化在糖標(biāo)記中廣泛應(yīng)用，多種標(biāo)記試劑如2-氨基苯甲酰胺(2-Aminobenzamide，2-AB)[29]、2-氨基苯甲酸(2-Aminobenzoic acid，2-AA)[30]、1-氨基-3，6，8-三磺酸芘(1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonic acid，APTS)[31]等均已經(jīng)商品化。但是由于這一方法會產(chǎn)生大量劇毒副產(chǎn)物，反應(yīng)條件要求嚴(yán)格，還有可能會導(dǎo)致糖結(jié)構(gòu)中的唾液酸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，因此在一定程度上限制了還原胺標(biāo)記方法的應(yīng)用。

肼基相較于氨基具有更高的反應(yīng)活性，可以與糖的還原端形成穩(wěn)定的亞胺結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了標(biāo)記效率，縮短了標(biāo)記時間，并且避免了劇毒試劑的使用。因此，自1996年Shinohara等[32]首次使用肼基修飾的生物素對糖衍生化后，這一類標(biāo)記方法在糖分析中的研究與應(yīng)用逐漸增多[33,34]。Lattova等[35]使用苯肼對N-聚糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生化，并證明衍生產(chǎn)物使用高效液相色譜-質(zhì)譜(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS)進(jìn)行定量分析的可行性。Kapkova等[36]使用生物素氨基己酰肼對單糖、二糖、三糖、標(biāo)準(zhǔn)N-聚糖、酶解蛋白釋放的N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果表明，衍生后的聚糖質(zhì)譜檢測靈敏度得到了提高。根據(jù)糖的不同衍生后的質(zhì)譜響應(yīng)信號強(qiáng)度比未衍生的高1～3個數(shù)量級。

盡管基于肼基標(biāo)記試劑的糖分析在HPLC-MS檢測中廣泛應(yīng)用，但是毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry，CE-MS)在糖分析中一直沒有得到充分的重視與應(yīng)用，而糖作為一類極性大、水溶性好、豐度低的生物樣品，恰恰是CE-MS分離分析的理想樣品。本課題組設(shè)計合成了一類新型肼基三嗪標(biāo)記試劑(圖1)，適用于CE-MS對糖進(jìn)行分離與分析[37]。肼基三嗪標(biāo)記試劑中的二乙氨基一方面能夠在酸性背景電解質(zhì)中帶電，效果最優(yōu)的T3能夠使得中性聚糖攜帶多個電荷，提高了聚糖的電泳遷移率，從而提高了分離效率；另一方面其具有非常高的離子化效率，可以使得質(zhì)譜的檢測靈敏度提高10倍以上，因此在CE-MS對糖的分析檢測中具有明顯的優(yōu)勢。最近，Partyka等[38]也提出了一種應(yīng)用于CE-MS的多電荷糖標(biāo)記試劑，他們使用肽肼標(biāo)簽對N-聚糖進(jìn)行標(biāo)記，衍生化后的N-聚糖在75 cm長的分離毛細(xì)管中不到15 min即可獲得良好的分離，并可以獲得40 nmol/L的檢出限。

圖1 肼基標(biāo)記試劑T3與糖的反應(yīng)示意圖及T3標(biāo)記后的聚糖的CE-MS提取離子流譜圖[37]Fig.1 Reaction between hydrazine labeling reagent T3 and glycans,and extracted ion current chromatograms of T3-labeled glycans obtained by CE-MS[37]

本課題組設(shè)計的肼基三嗪標(biāo)記試劑在糖的HPLC-MS檢測中也表現(xiàn)出優(yōu)異的效果。Zhang等[39]應(yīng)用T3標(biāo)記試劑，開發(fā)了一種基于衍生化預(yù)處理與HPLC-MS結(jié)合的靈敏、穩(wěn)定、高效的寡糖分析方法，實現(xiàn)了中草藥淫羊藿屬寡糖的圖譜分析。該方法的檢出限低至fmol量級，比已經(jīng)被廣泛應(yīng)用的糖標(biāo)記試劑1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的靈敏度更高，可以鑒定到66種寡糖化合物，并可以使用篩選出的13種寡糖化合物作為淫羊藿屬植物鑒定的潛在生物標(biāo)志物。該方法還可以應(yīng)用于咖啡粉的摻假鑒定中。利用該方法Zhang等完成了111種寡糖的同時檢測，確定了17種寡糖標(biāo)志物用于鑒定咖啡粉中的大豆和大米兩種主要的摻假物，并通過對商業(yè)咖啡粉樣品的測試，證明該方法是識別咖啡摻假的可靠而有效的方法[40]。與我們合作，Lubman等應(yīng)用T3標(biāo)記試劑開發(fā)了一種從患者血清中的結(jié)合珠蛋白中檢測生物標(biāo)志物巖藻糖基化聚糖的方法(圖2)[41]。衍生化之后，使用親水作用色譜-質(zhì)譜(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography-mass Spectrometry，HILIC-MS)聯(lián)用系統(tǒng)，可以從不到1 μL的患者血清中檢測出結(jié)合珠蛋白中的聚糖，如果不進(jìn)行衍生化，則無法檢測到聚糖。他們進(jìn)一步拓展了該方法的應(yīng)用，開發(fā)出一種區(qū)分糖蛋白每個位點上聚糖的核心巖藻糖基化和觸角巖藻糖基化的方法[42]。

圖2 基于T3標(biāo)記的血清中結(jié)合珠蛋白巖藻糖基化的檢測[41]Fig.2 Detection of haptoglobin fucosylation in serum based on T3 labeling[41]

為了提高糖分析中定量的準(zhǔn)確性，本課題組設(shè)計合成了質(zhì)量數(shù)相差20的氘代標(biāo)記試劑d20-T3，保證了兩種標(biāo)記試劑標(biāo)記的同一種目標(biāo)待測物即使在電噴霧離子源中帶上2個甚至3個電荷，在質(zhì)譜圖中得到的m/z值也不會發(fā)生重疊，從而降低了數(shù)據(jù)處理的難度。我們利用該氘代標(biāo)記試劑開發(fā)了一種基于質(zhì)譜的廉價、高效的相對定量方法，在人血清中成功實現(xiàn)了48種N-聚糖的準(zhǔn)確定量檢測[43]。Li等利用T3及d20-T3，探索了HILIC結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸電離-質(zhì)譜成像(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometric Imaging，MALDI-MSI)平臺對N-聚糖進(jìn)行定量分析的能力[44]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與直接MALDI-MS相比，HILIC-MALDI-MSI提供了更高的N-聚糖覆蓋率以及更好的定量精度，表明使用肼標(biāo)記試劑的HILIC-MALDI-MSI系統(tǒng)具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性和高度可重復(fù)性，在比較糖組學(xué)研究中具有巨大的潛力。

此外，本課題組在此標(biāo)記試劑的基礎(chǔ)上，保持其肼基三嗪的母核結(jié)構(gòu)，設(shè)計并合成了一系列取代基不同的肼基三嗪標(biāo)記試劑，進(jìn)一步提高質(zhì)譜的檢測靈敏度，并擴(kuò)展該類標(biāo)記試劑的應(yīng)用范圍(圖3)[45]。在對麥芽七糖的檢測中，效果最佳的標(biāo)記試劑n-Pr2N標(biāo)記之后的質(zhì)譜響應(yīng)信號比已經(jīng)商品化的2-AB糖標(biāo)記試劑標(biāo)記之后的質(zhì)譜響應(yīng)信號提高了10倍，且標(biāo)記反應(yīng)完成之后只需將反應(yīng)體系旋干再溶解即可直接進(jìn)樣。相比2-AB還原胺化后所需要柱純化等復(fù)雜操作，肼基標(biāo)記在反應(yīng)后處理方面更加快速簡便。對生物樣品中使用PNGase F酶解下來的N-聚糖進(jìn)行n-Pr2N標(biāo)記，N-聚糖的信號強(qiáng)度平均提升了100倍，并且可以檢測到更多種類的N-聚糖，表明肼基三嗪類標(biāo)記試劑是糖分析及蛋白質(zhì)糖基化分析的有力工具。

圖3 一系列肼基標(biāo)記試劑結(jié)構(gòu)示意圖及其標(biāo)記麥芽七糖的提取離子流譜圖[45]Fig.3 Structures of a series of hydrazine labeling reagents and extracted ion current chromatograms of maltoheptaose labeled by different labeling reagents[45]

3 堿基修飾分析

核酸(DNA和RNA)中除了經(jīng)典堿基，即腺嘌呤(Adenine，A)、鳥嘌呤(Guanine，G)、胞嘧啶(Cytosine，C)、胸腺嘧啶(Thymine，T)和尿嘧啶(Uracil，U)外，還包含許多修飾堿基[46]。這些堿基修飾雖然相對豐度極低，但在生物體中發(fā)揮著基因選擇性表達(dá)、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種重要的生物學(xué)功能，并與腫瘤等許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是近年來精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域的研究熱點[46,47]。目前，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)是堿基修飾分析的主流方法[48-52]。因為堿基修飾在生物體內(nèi)的含量通常極低，例如在哺乳動物中，5-醛基胞嘧啶(5-Formylcytosine，5fC)的含量約占胞嘧啶的百萬分之一到二十[48]，所以常需要通過化學(xué)衍生法等樣品前處理過程，以滿足低豐度堿基修飾以及少量樣品中堿基修飾的定量檢測要求。

本課題組使用肼基三嗪標(biāo)記試劑i-Pr2N，針對不同的堿基修飾建立了高靈敏的HPLC-MS/MS檢測方法(圖4)。5fC和5-羧基胞嘧啶(5-Carboxylcytosine，5caC)是兩種豐度極低的修飾堿基，利用標(biāo)記試劑i-Pr2N中肼基的高反應(yīng)活性，能夠?qū)?fC和5caC進(jìn)行快速標(biāo)記，尤其是5fC和標(biāo)記試劑之間的衍生反應(yīng)非?？欤瑑H通過振蕩旋干便可以完成反應(yīng)，無需額外的反應(yīng)時間。衍生化后的5fC和5caC的檢測靈敏度提高了100倍以上，檢出限分別低至10 amol和25 amol。一方面，衍生反應(yīng)引入了易于離子化的叔胺基團(tuán)；另一方面，三嗪基團(tuán)的引入提高了5fC和5caC的疏水性，根據(jù)小分子化合物電噴霧電離的機(jī)制，疏水性的提高能夠使得質(zhì)譜離子化效率得到提升。使用建立的方法，能夠在約600 ng的DNA樣品中進(jìn)行5fC和5caC的檢出，展現(xiàn)出該方法應(yīng)用于臨床樣品檢測的可能性[53]。5-羥甲基胞嘧啶(5-Hydroxymethylcytosine，5hmC)是一種癌癥標(biāo)志物，本課題組建立了一種基于MnO2氧化和i-Pr2N標(biāo)記的方法，實現(xiàn)了少量的DNA樣品中5hmC的定量分析。該方法使5hmC的檢測靈敏度提高了178倍，檢測限低至14 amol，可以在340 pg基因組DNA(相當(dāng)于57個細(xì)胞中的基因組DNA含量)中量化5hmC水平。利用該方法首次實現(xiàn)了不依賴于二代測序技術(shù)對血清中游離DNA(Cell-free DNA，cfDNA)中5hmC的定量檢測，為探究珍貴樣品中的5hmC功能和基于5hmC的非侵入性疾病診斷提供了一種新的檢測手段，在臨床檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景[54]。

圖4 胞嘧啶修飾的標(biāo)記策略及i-Pr2N標(biāo)記后的提取離子流譜圖[53-54]Fig.4 Labeling strategies of modified cytosines and extracted ion current chromatograms of modified cytosines labeled by i-Pr2N[53-54]

除了i-Pr2N衍生化外，Hong等[55]使用吉拉德試劑T(Girard reagent T，GirT)對5-醛基尿嘧啶(5-Formyluracil，5fU)進(jìn)行標(biāo)記，與未標(biāo)記的相比靈敏度提高約20倍，檢出限為3～4 fmol。Yuan等使用一系列吉拉德試劑(GirD，GirT和GirP)對5fC和5caC進(jìn)行標(biāo)記，檢測靈敏度提高52～260倍。其中GirP的效果最好，5fC和5caC的檢出限可分別達(dá)到30 amol和420 amol，利用建立的檢測方法在擬南芥和水稻基因組DNA中鑒定發(fā)現(xiàn)了5fC和5caC[56]。隨后，他們對方法進(jìn)行改進(jìn)，使用GirP化學(xué)衍生結(jié)合管內(nèi)固相微萃取實現(xiàn)了DNA和RNA中6種醛基化修飾的高靈敏檢測，檢測靈敏度提高了307～880倍[57]。他們還利用MnO2氧化和丹磺酰肼(Dansylhydrazine，DNSH)衍生的策略建立了一種測定DNA和RNA中5hmC和5fC的新方法[58]。在該方法中，DNA和RNA中5hmC氧化衍生化產(chǎn)物的檢出限分別為 40 amol 和30 amol，與未標(biāo)記的相比，檢測靈敏度分別提高了363倍和380倍。在優(yōu)化條件下，20 ng DNA和100 ng RNA 足以分析其中的5hmC。

4 脂肪酸分析

脂肪酸在生命過程中起著多種關(guān)鍵作用，可以通過氧化過程提供能量，參與分子信號傳導(dǎo)并調(diào)節(jié)生物學(xué)過程，還與多種疾病相關(guān)，包括腫瘤，糖尿病和心臟病，是一種潛在的生物標(biāo)志物[59-62]。然而，由于脂肪酸的離子化效率非常低，種類和結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，而且進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析時，在碰撞誘導(dǎo)解離中由于其剛性結(jié)構(gòu)而不能產(chǎn)生理想的產(chǎn)物離子，對其檢測造成了困難。化學(xué)衍生法普遍應(yīng)用于改善脂肪酸的質(zhì)譜檢測靈敏度[63-65]，肼基標(biāo)記試劑是其中一種常用的標(biāo)記試劑。

Zhang等使用肼基三嗪標(biāo)記試劑T3，開發(fā)了一種定量檢測脂肪酸的HPLC-MS/MS方法，并建立了適用于任何脂肪酸的通用的多反應(yīng)監(jiān)測(Multiple Reaction Monitoring，MRM)條件，方便定量分析，擴(kuò)大了該方法的應(yīng)用范圍[66,67]。該方法還使用氘化衍生試劑d20-T3作為內(nèi)標(biāo)，以盡量減少基質(zhì)效應(yīng)，保證了方法的準(zhǔn)確性和可靠性。衍生化后的脂肪酸的檢測靈敏度顯著提高了1 000倍，可以檢測到低至10 fg的脂肪酸。將該方法用于血漿樣品的研究，發(fā)現(xiàn)血漿中的幾種脂肪酸能夠區(qū)分幼鼠和老年鼠，有望作為衰老過程的潛在生物標(biāo)志物[66]。Li等[68]將該方法拓展應(yīng)用至小分子藥物Triptolide對肝臟和腎臟的毒性研究中，發(fā)現(xiàn)暴露于Triptolide的小鼠肝臟和腎臟組織中的多種脂肪酸的濃度均發(fā)生了顯著變化。

此外，Han等[69]使用3-硝基苯肼(3-Nitrophenylhydrazine，3NPH)對短鏈脂肪酸進(jìn)行標(biāo)記，采用同位素內(nèi)標(biāo)法實現(xiàn)了對10種短鏈脂肪酸的同時分離與準(zhǔn)確定量。衍生后的產(chǎn)物具有很好的穩(wěn)定性，并且不需要反應(yīng)后的處理，適用于高通量分析。該方法的檢出限低至0.15～15 fmol，日內(nèi)精密度和日間精密度均≤8.8%(n=6)。

最近，Zhao等[70]使用丹磺酰肼及其13C同位素試劑對包括脂肪酸在內(nèi)的羧基代謝物進(jìn)行標(biāo)記，建立了一種針對羧基代謝物的準(zhǔn)確相對定量方法，并構(gòu)建了由193種內(nèi)源性人類代謝物組成的標(biāo)記羧基標(biāo)準(zhǔn)庫用于代謝物的鑒定，涵蓋了超過55種代謝途徑。通過對30個尿液樣品的代謝組比較以及兩種尿酸的絕對定量，證明了使用此方法對復(fù)雜實際樣品中的羧基代謝組進(jìn)行全面分析的可能性。

5 總結(jié)與展望

肼基標(biāo)記試劑的應(yīng)用范圍非常廣，除了上文中提到的在糖及糖基化分析、堿基修飾分析及脂肪酸分析中的應(yīng)用外，還可以應(yīng)用于其他的含有醛基或羧基的目標(biāo)待測物的檢測中，如類固醇[21]、脂肪醛[71]、類花生酸等等[72]，因此可以廣泛應(yīng)用于臨床檢測、環(huán)境分析、醫(yī)藥檢測、食品分析等多種研究領(lǐng)域，具有極大的應(yīng)用潛力。但是，隨著科學(xué)研究的不斷深入，低樣品消耗量、低豐度目標(biāo)待測物檢測的需求日益迫切。此外，基于化學(xué)衍生-質(zhì)譜分析的方法也存在一定局限性，如副產(chǎn)物的形成和過量衍生化試劑的干擾。因此，針對目標(biāo)待測物設(shè)計開發(fā)具有更高檢測靈敏度、更好選擇性、更快反應(yīng)速度、沒有副產(chǎn)物的衍生化試劑，甚至新的衍生化反應(yīng)，以便更好地應(yīng)用于實際樣品的分析檢測中，仍然是研究者們努力的方向。