頭孢菌素C對蔬菜種子萌發(fā)的毒理效應(yīng)

周睫雅，任愛玲，劉宏博，吳昊，馬雙，3，崔思嘉，4，王旭明，田書磊*

（1. 河北科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊050080；2. 中國環(huán)境科學(xué)研究院固體廢物污染控制技術(shù)研究所，北京100012；3. 內(nèi)蒙古大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，呼和浩特010021；4.東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林 吉林132012；5.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京100097）

我國是抗生素原料藥生產(chǎn)和使用大國，每年生產(chǎn)的抗生素超過2×105t，國內(nèi)消耗量約占75%，其中β-內(nèi)酰胺類抗生素使用量較大，占總使用量的21%[1-4]，頭孢菌素C 是頂頭孢霉菌產(chǎn)生的一種β-內(nèi)酰胺類抗生素，是需求量較大的大宗類抗生素。據(jù)統(tǒng)計，2013年我國抗生素產(chǎn)量就已達(dá)到24.8 萬t，依據(jù)生產(chǎn)1 t抗生素平均產(chǎn)生30～40 t 濕菌渣估算，2013 年我國抗生素菌渣產(chǎn)生量約為1 000 萬t[4-6]。相關(guān)研究表明，在中國、美國和歐盟等多個國家的土壤[7]、地表水[8-9]、城市污水或廢水[10]、沿海城市近岸海域[11]、蔬菜及肉食產(chǎn)品中[12-13]，均能檢出各類抗生素。課題組前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，不同企業(yè)或不同生產(chǎn)工藝產(chǎn)出的菌渣殘留的抗生素量不同，螺旋霉素殘留量為750～800 mg·kg-1[14]，頭孢菌素C 殘留量為530～550 mg·L-1?？股鼐驓埩艨股兀溥M(jìn)入環(huán)境后將促進(jìn)耐藥菌的發(fā)生和傳播[15]，依據(jù)2016 年新版《國家危險廢物名錄》，抗生素菌渣被納入危險廢物名錄。

按照危廢管理要求，目前菌渣的安全處理處置方式主要為填埋和焚燒，這兩種方式不僅安全處置難度大，而且費(fèi)用高，已嚴(yán)重制約了抗生素制藥行業(yè)的健康發(fā)展。因此，亟待開發(fā)安全、有效、經(jīng)濟(jì)合理的利用處置技術(shù)。根據(jù)課題組前期測樣發(fā)現(xiàn)，經(jīng)無害化處理后，頭孢菌渣的含水率由90.68% 降至2.76%，而有機(jī)質(zhì)、總養(yǎng)分（N + P2O5+ K2O）含量分別為89.00% 和10.57%，均滿足《有機(jī)肥料》（NY 515—2012）要求。因此，肥料化是實現(xiàn)其資源化利用可行性較好的方式?？股鼐蚝写罅康拇值鞍?、粗脂肪等有機(jī)物[16]，經(jīng)無害化處理技術(shù)消除殘留抗生素后，可作為有機(jī)肥料基料，但缺少相關(guān)技術(shù)規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)。目前，中國環(huán)境科學(xué)研究院和抗生素菌渣國家工程技術(shù)中心已向國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會提出制訂青霉素、頭孢菌素以及紅霉素等典型大宗抗生素菌渣作為有機(jī)肥基料進(jìn)行無害化處置技術(shù)要求、環(huán)境風(fēng)險評估方法等相關(guān)技術(shù)規(guī)范的立項需求，為抗生素菌渣肥料化利用奠定基礎(chǔ)。

菌渣中殘留抗生素對植物生長毒性的影響是抗生素菌渣肥料化利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)規(guī)范編制需解決問題之一。目前，國內(nèi)外關(guān)于抗生素植物毒性的研究已有報道，主要通過種子發(fā)芽和幼苗生長發(fā)育實驗來考察抗生素污染脅迫下植物種子發(fā)芽、生長等指標(biāo)來綜合評價其毒性。Hillis 等[15]對磺胺類和大環(huán)內(nèi)脂類等抗生素對萵苣的生態(tài)毒性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)金霉素、左氧氟沙星和磺胺甲惡唑生態(tài)毒性最為顯著。Wang 等[16]采用水培法分別研究了土霉素和鹽酸多西環(huán)素在0～90 mg·L-1、乳酸恩諾沙星在0～320 mg·L-1對油菜的生態(tài)毒性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在設(shè)定濃度范圍內(nèi)各種抗生素對根長的抑制作用均強(qiáng)于芽長。李萌等[17]通過白菜種子發(fā)芽實驗，發(fā)現(xiàn)抗生素濃度與白菜根長抑制率之間存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。鄧世杰等[18]研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素對種子發(fā)芽率的最大無響應(yīng)濃度（NOEC）為5 mg·L-1，環(huán)丙沙星和磺胺嘧啶對黑麥草種子發(fā)芽率的NOEC 為1 mg·L-1。課題組通過美國環(huán)境保護(hù)署（US EPA）毒性數(shù)據(jù)庫和相關(guān)已發(fā)表的文獻(xiàn)篩選收集了一部分β-內(nèi)酰胺類（其中必須包括青霉素、頭孢）等的水生和陸生生物（藻類、水生植物、魚類、甲殼類和昆蟲類等）的急慢性毒性效應(yīng)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有關(guān)頭孢菌素類藥物的生態(tài)毒理學(xué)數(shù)據(jù)還不足以論證其對環(huán)境的具體影響。

本研究以生菜、油麥菜、白菜和油菜為研究對象，開展了不同濃度梯度下頭孢菌素C 對4 種常見蔬菜種子的發(fā)芽、鮮質(zhì)量、胚軸長和胚根長的毒性效應(yīng)研究，對其根長進(jìn)行了劑量-效應(yīng)關(guān)系擬合，推導(dǎo)不同蔬菜種子對頭孢菌素C的響應(yīng)敏感程度，以期為頭孢菌素類抗生素菌渣肥料化利用的環(huán)境基準(zhǔn)生態(tài)閾值建立與生態(tài)風(fēng)險評估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試蔬菜種子：生菜（Lactuca sativaLinn. var. ramosa Hort.），油 麥 菜（Lactuca sativavar. longifoliaf.Lam），白菜（Brassica pekinensis（Lour.）Rupr.），油菜（Brassica campestrisL.），購于北京派得偉業(yè)科技發(fā)展有限公司。

供試頭孢菌素C（cephalosporin C）標(biāo)準(zhǔn)品，由伊犁川寧生物技術(shù)有限公司提供（從菌渣中提煉純化），純度大于99%，分子式為C16H21N3O8S，結(jié)構(gòu)式如圖1。

圖1 頭孢菌素C的結(jié)構(gòu)式Figure 1 Constitutional formula of cephalosporin C

1.2 實驗方法

參考國際種子檢驗協(xié)會（ISTA）的種子監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)[19]，采用保濕培養(yǎng)法進(jìn)行試驗。

用體積分?jǐn)?shù)為10% 的H2O2溶液對種子消毒15 min，再用去離子水沖洗3 遍，濾干，于直徑90 mm 無菌培養(yǎng)皿中放置1 張濾紙，將15 粒種子均勻排列在培養(yǎng)皿中，向培養(yǎng)皿中加入3 mL 不同濃度梯度的頭孢菌素C 溶液，濃度梯度設(shè)定為：10、100、500、1 000、1 500、2 000 mg·L-1，以加入等量的去離子水為對照，試驗設(shè)3 組平行。將培養(yǎng)皿置于（25±1）℃智能型光照培養(yǎng)箱（GXZ-280，寧波江南儀器廠）中黑暗培養(yǎng)，試驗周期4 d。每日定時記錄種子發(fā)芽數(shù)，通過恒質(zhì)量法保持濾紙和種子濕潤。試驗期間，直到對照組的發(fā)芽率趨于穩(wěn)定不變（發(fā)芽率≥85%）；當(dāng)對照組胚根長＞20 mm 時，結(jié)束培養(yǎng)并測定幼苗鮮質(zhì)量，胚根長和軸長。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 發(fā)芽率、胚根長生長率的計算

發(fā)芽率和根生長率的計算公式如下：

式中：GR為發(fā)芽率，%；n為發(fā)芽種子數(shù)，個；N為供試種子數(shù)，個；RLR為胚根生長率，%；RL0為對照組胚根長，mm；RLt為處理組胚根長，mm。

1.3.2 最大無響應(yīng)濃度（NOEC）及半抑制濃度（IC50）的計算

建立以頭孢菌素C濃度與根生長率的劑量-效應(yīng)關(guān)系圖，并進(jìn)行擬合。當(dāng)根生長率為0 時，對應(yīng)的頭孢菌素C 濃度即為該種抗生素的NOEC 值；當(dāng)根生長率為-50% 時，對應(yīng)的頭孢菌素C 濃度即為該種抗生素的IC50值。

1.3.3 統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS Statistics 25 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素（One-way ANOVA）方差分析和差異顯著性檢驗，P=0.05 為顯著性指標(biāo)，用Origin 2019 對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。圖表中各指標(biāo)的數(shù)據(jù)為3 組平行實驗的平均值，或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度頭孢菌素C脅迫下對種子發(fā)芽率的影響

如表1 所示，頭孢菌素C 處理下生菜、油麥菜、白菜及油菜種子的發(fā)芽率與對照組相比無顯著差異（P＞0.05），即在本試驗濃度范圍內(nèi)，頭孢菌素C 對供試的4 種蔬菜種子的萌發(fā)無明顯抑制或促進(jìn)作用。這與Derek 等[20]進(jìn)行的10 種抗生素對苦菊、萵苣、紫花苜及胡蘿卜的植物毒性試驗的結(jié)果相似。其主要原因，一是種子發(fā)芽期較短，抗生素還未對種子產(chǎn)生明顯影響就已經(jīng)萌發(fā)，在種子萌發(fā)初期，植物幼嫩細(xì)胞中未形成液泡，根也還未破皮而出，此時種子對水分的吸收是沿著水勢梯度進(jìn)行的吸脹吸水物理過程；二是種皮的保護(hù)作用，抗生素吸附在種皮表面，阻礙了胚根與外界環(huán)境直接接觸，使得種子萌發(fā)過程受到的侵害較不明顯[21]。種子萌發(fā)是種子從吸水到胚根突破種皮期間一系列酶催化的生理生化過程。種子內(nèi)各類參與萌發(fā)的酶在此階段激活，并作用于種子子葉儲存的淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪的分解活動，為后期幼苗植物細(xì)胞的合成提供能量來源。這就意味著，從表觀上看種子正常發(fā)芽，但并不能斷定抗生素的脅迫對植物細(xì)胞無毒性效應(yīng)[22]。

表1 不同濃度頭孢菌素C處理下蔬菜種子的發(fā)芽率Table 1 Germination rate of seeds under cephalosporin C stress

2.2 不同濃度頭孢菌素C 脅迫下對幼苗胚軸和鮮質(zhì)量的影響

圖2 不同濃度頭孢菌素C溶液對4種蔬菜幼苗胚軸和鮮質(zhì)量的影響Figure 2 Effects of cephalosporin C on fresh weight and hypocotyl of different seedlings

由圖2 可見，處理組生菜的胚軸長均高于對照組，而油麥菜胚軸長則隨著頭孢菌素C濃度的增加呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢。油菜的胚軸長與頭孢菌素C 濃度≤1 500 mg·L-1時，與對照差別不大，當(dāng)濃度為2 000 mg·L-1時，則略高于對照。而白菜的胚軸長在不同濃度之間差異不顯著。相對于胚軸長，頭孢菌素C 對4 種蔬菜幼苗鮮質(zhì)量的影響更為明顯，但也存在一定的差異。不同濃度頭孢菌素C溶液脅迫下，生菜及白菜的鮮質(zhì)量均高于對照組，油菜則低于對照組，油麥菜鮮質(zhì)量在頭孢菌素C 濃度≥1 000 mg·L-1時，也低于對照組。隨著頭孢菌素C 的濃度提高，4 種蔬菜幼苗的鮮質(zhì)量均呈現(xiàn)不同程度下降趨勢，尤其是白菜和油麥菜，而生菜和油菜則不太顯著。當(dāng)濃度為10 mg·L-1時，白菜鮮質(zhì)量最高，比對照組高37.11%；當(dāng)濃度為1 000 mg·L-1時，生菜鮮質(zhì)量最高，比對照組高47.04%。當(dāng)頭孢菌素C 濃度為1 000～2 000 mg·L-1時，油麥菜鮮質(zhì)量則顯著低于對照。

與發(fā)芽率和幼苗胚軸相比較，生菜、油麥菜、白菜及油菜幼苗鮮質(zhì)量對頭孢菌素C 的脅迫敏感性更顯著，其原因是在胚根向胚軸傳遞運(yùn)輸過程中，頭孢菌素C的濃度沿水勢方向遞減，使得在幼苗生長發(fā)育過程中，胚軸與頭孢菌素C 溶液接觸的濃度較低，受到的影響小。

2.3 不同濃度頭孢菌素C脅迫下對幼苗胚根的影響

胚根是種子萌發(fā)后首先出現(xiàn)的器官，具有固著、貯存合成氨基酸和植物激素等有機(jī)物質(zhì)的作用，其主要功能是吸收環(huán)境中水分及養(yǎng)分，并通過維管組織輸送給莖。幼苗生長過程根尖與抗生素溶液接觸非常緊密，對其中的抗生素響應(yīng)較為顯著。Alessandro等[23]研究了4 種抗生素（氯霉素、螺旋霉素、大觀霉素及萬古霉素）對番茄種子萌發(fā)過程中根系發(fā)育的影響，證明了4 種抗生素對番茄頂端根系細(xì)胞分裂造成明顯損害。

由圖3 可知，隨著溶液中頭孢菌素C 濃度的提高，4 種蔬菜胚根長整體呈現(xiàn)出先促進(jìn)后抑制的現(xiàn)象，當(dāng)濃度為100 mg·L-1時，基本均達(dá)到生長峰值。隨著頭孢菌素C濃度逐漸增大，其對胚根長的抑制作用越趨明顯。4種蔬菜對頭孢菌素C的響應(yīng)程度各不同，但趨勢相似。與發(fā)芽率、幼苗鮮質(zhì)量及胚軸長相比，胚根對頭孢菌素C 脅迫的敏感性最為顯著，選取胚根長作為4 種蔬菜受損程度的判斷指標(biāo)。葛成軍等[24]在進(jìn)行四環(huán)素類抗生素對白菜種子發(fā)芽實驗時也得出了類似結(jié)論，試供作物對金霉素和土霉素的生態(tài)敏感性表現(xiàn)為：根伸長＞軸伸長＞發(fā)芽率。張乙涵等[25]也報道根長可作為診斷抗生素植物毒性的敏感指標(biāo)。

3 討論

3.1 不同毒性指標(biāo)與頭孢菌素C之間的關(guān)系

圖3 不同濃度頭孢菌素C溶液對胚根影響Figure 3 Effects of cephalosporin C on radicle length under stress

對發(fā)芽率、幼苗鮮質(zhì)量、胚軸長及胚根和頭孢菌素C 濃度及蔬菜種類進(jìn)行了主成分分析（PCA），見圖4。方差貢獻(xiàn)率第一主成分為38.0%，第二主成分為29.6%，累計方差貢獻(xiàn)率為67.6%，共同解釋所有樣品的差異。第一主成分的特征指標(biāo)有發(fā)芽率、鮮質(zhì)量和胚根，其中頭孢菌素C 濃度對胚根長呈負(fù)相關(guān)，說明頭孢濃度變化會影響胚根的生長狀態(tài)。根是蔬菜主要的吸收和代謝器官，同時也是最容易受毒物分子影響的部位，且與頭孢菌素C 直接接觸，通過影響蔬菜根部的抗氧化防御系統(tǒng)和細(xì)胞分裂來影響根長[26-27]，也有研究指出，種子萌發(fā)發(fā)生在植物暗生芽期，此時胚根是快速生長的器官，對抗生素敏感[27]，使胚根長在頭孢菌素C 存在下受到顯著抑制（P＜0.05）。第二主成分的特征指標(biāo)是發(fā)芽率和鮮質(zhì)量，種子發(fā)芽率與鮮質(zhì)量呈正相關(guān)，種子的發(fā)芽數(shù)，直接對幼苗鮮質(zhì)量產(chǎn)生影響。

由圖4 可見，生菜組與油麥菜組之間的樣品相似性高，且有部分重疊，油菜和白菜之間也有相同的規(guī)律。本試驗的供試蔬菜中，油麥菜和生菜均屬于菊科萵苣屬，油菜和白菜均屬于十字花科蕓薹屬，造成不同屬蔬菜在頭孢菌素C 溶液脅迫下呈現(xiàn)出不同的聚集狀態(tài)，這可能與蔬菜中營養(yǎng)物質(zhì)的儲存狀態(tài)有關(guān)[28]。與萵苣屬蔬菜相比，蕓薹屬蔬菜種子中不具有淀粉粒，使得抗生素作用在不同屬蔬菜中的靶分子不同[29]，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

不同濃度頭孢菌素C處理下，發(fā)芽率、鮮質(zhì)量、胚軸及胚根毒性指標(biāo)都會受到不同程度的影響。圖4的相關(guān)性分析可見頭孢菌素C 濃度對胚根的影響最為顯著，其次是鮮質(zhì)量和胚軸，影響最不顯著的是發(fā)芽率。抗生素對胚軸的作用機(jī)制主要是種子胚根與抗生素接觸后，將吸收抗生素并沿著胚軸向上輸送，所以與其他部位相比，根中抗生素累積量最多[30]，多位學(xué)者的研究結(jié)果[31-33]指出，隨抗生素濃度的升高，蔬菜胚軸長和胚根長生長逐漸受到抑制，且受抑制程度胚根長＞胚軸長。

圖4 不同毒性指標(biāo)與頭孢菌素C濃度之間的關(guān)系Figure 4 The principal components analysis between different toxicity indexes and cephalosporin C

3.2 基于胚根長的不同蔬菜敏感程度分析

試驗胚根長為重要毒性指標(biāo)，以頭孢菌素C 濃度為自變量，根生長率為因變量，建立了的根生長率與頭孢菌素C溶液濃度響應(yīng)曲線（圖5a），獲得回歸方程（表2）。從表2可知，4種蔬菜根的生長率與頭孢菌素C 濃度間均呈現(xiàn)出極顯著的線性關(guān)系（P＜0.01）。由圖5b 及表2 可知，生菜、油麥菜、白菜和油菜的NOEC分別為868.10、727.25、796.27 mg·L-1和629.27 mg·L-1。當(dāng)頭孢菌素C 濃度小于不同蔬菜各自對應(yīng)的NOEC 時，頭孢菌素C 對4 種蔬菜胚根的伸長具有明顯的促進(jìn)作用，當(dāng)濃度超出了幼苗耐受范圍，則出現(xiàn)了抑制效應(yīng)，但根伸長抑制率存在差異。劉娣[34]進(jìn)行的小白菜水培實驗，同樣發(fā)現(xiàn)低濃度四環(huán)素類抗生素促進(jìn)了小白菜種子根的伸長，而高濃度的四環(huán)素類抗生素則抑制了根伸長。蔡嘉穎等[35]也發(fā)現(xiàn)，土霉素在低濃度（≤5 mg·L-1）對苦菊根伸長有促進(jìn)作用，高濃度（≥10 mg·L-1）時抑制。這說明抗生素類物質(zhì)對試驗幼苗生長具有雙向調(diào)節(jié)功能，其主要原因可能與植物的逆境生理相關(guān)[36]，當(dāng)抗生素濃度在幼苗體內(nèi)超出其生理承受范圍，胚根就受到影響，同時高濃度抗生素會阻止抗氧化酶系統(tǒng)的信號傳遞[37]，使植物正常代謝受到影響。

目前，常用植物的IC50值來評價污染物的生態(tài)毒性強(qiáng)弱[38]。IC50值與植物對頭孢菌素C 的敏感程度負(fù)相關(guān)。從圖5b 可見，頭孢菌素C 對4 種蔬菜的敏感度依次為：油菜＞油麥菜＞白菜＞生菜。Pan 等[39]通過小油菜、番茄、胡蘿卜和黃瓜的根伸長試驗評價四環(huán)素（TC）、磺胺甲嘧啶（SMZ）、諾氟沙星（NOR）、紅霉素（ERY）和氯霉素（CAP）的毒性，得到上述抗生素對小油菜的IC50值分別為14.4、157、49.4、68.8 mg·L-1和204 mg·L-1，均小于本研究頭孢菌素C 對油菜的IC50值，即1 538.36 mg·L-1。頭孢菌素C 對小油菜的毒性遠(yuǎn)小于上述抗生素，這主要是由于抗生素毒性與其分子結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性具有相關(guān)性，頭孢菌素類分子具有不穩(wěn)定、高應(yīng)變和反應(yīng)性的β-內(nèi)酰胺鍵，易于水解，半衰期較短，因此對胚根毒性影響相對較小。由此可見，針對不同種類的蔬菜對頭孢菌素C 的耐受程度各不相同，頭孢菌渣的肥料化利用過程，應(yīng)充分考慮菌渣中頭孢菌素C 的殘留情況，合理種植蔬菜，保證農(nóng)產(chǎn)品安全，減少頭孢菌素C 沿食物鏈進(jìn)入人體的風(fēng)險。

圖5 濃度-根生長率的劑量-效應(yīng)曲線Figure 5 Dose-response curve of concentration-radicle growth rate

表2 頭孢菌素C與根生長率的相關(guān)性Table 2 Correlation between cephalosporin C and radicle growth rate

4 結(jié)論

（1）4 種蔬菜種子的毒性指標(biāo)對頭孢菌素C 的生態(tài)敏感性均表現(xiàn)為：胚根＞鮮質(zhì)量＞胚軸＞發(fā)芽率。胚根長作為診斷頭孢菌素C生態(tài)毒性的敏感指標(biāo)，可較好反映頭孢菌素C的污染狀況。

（2）生菜、油麥菜、白菜及油菜胚根的NOEC 分別為868.10、727.25、796.27 mg · L-1和629.27 mg · L-1。NOEC 可為頭孢菌渣殘留量的環(huán)境安全閾值的設(shè)定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

（3）4種蔬菜對頭孢菌素C的敏感分布順序為：油菜＞油麥菜＞白菜＞生菜。結(jié)果表明，油菜在所測試的蔬菜中是最為敏感的，其IC50為1 538.36 mg·L-1。油菜將作為后續(xù)探究施用頭孢菌渣肥對土壤抗性基因及微生物群落影響較為理想的毒性指示作物。