雪里蕻對(duì)于Cd、Zn的耐性及富集特性研究

郭堤，管偉豆，張洋，劉翔宇，李一曼，張?jiān)鰪?qiáng)*

（1.西北工業(yè)大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，西安710129；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌712100；3.西安市固體廢棄物處置中心，西安710038）

在眾多的重金屬污染土壤修復(fù)技術(shù)中，植物提取由于其綠色環(huán)保性及實(shí)用性，自20 世紀(jì)80 年代以來就出現(xiàn)在公眾視野中[1]。植物提取技術(shù)的關(guān)鍵是尋找到合適的、能高效吸收重金屬的植物，即超富集植物。由于植物提取技術(shù)主要依靠超富集植物對(duì)重金屬污染土壤進(jìn)行修復(fù)，所以植物生長(zhǎng)狀況、對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和對(duì)重金屬的吸收等成為植物修復(fù)技術(shù)效率的關(guān)鍵因素[2]。然而，自然界中符合該條件的超富集植物種類相當(dāng)有限。因此，眾多科研工作者將工作重心放在超/高富集植物品種篩選方面[3-4]。

修復(fù)植物的生物量和重金屬富集轉(zhuǎn)運(yùn)能力直接決定了植物中金屬提取量的大小和植物提取的效率。另外，修復(fù)植物對(duì)于重金屬的解毒能力和耐受性也能夠顯著影響植物生長(zhǎng)的狀況，從而影響其生物量的大小。重金屬能夠誘發(fā)植物一系列生化、形態(tài)變化和生理紊亂。超富集植物在重金屬污染土壤中采取不同的策略以避免細(xì)胞損傷，維持生長(zhǎng)。植物所采用的耐受機(jī)制之一是通過各種抗氧化酶對(duì)抗活性氧的增加，這些酶包括過氧化氫酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶和過氧化物酶等[5]。因此，修復(fù)植物的重金屬耐受性和解毒能力亦是植物提取技術(shù)的關(guān)鍵。由于超/高富集植物種植的地域差異性，圍繞礦山開采及金屬冶煉廠周邊篩選優(yōu)勢(shì)先鋒植物進(jìn)行場(chǎng)地植被恢復(fù)和污染修復(fù)是經(jīng)濟(jì)可行的，且相比其他超/高富集植物適宜性更強(qiáng)。近年來，國(guó)內(nèi)學(xué)者在礦山及冶煉廠廢棄場(chǎng)地生態(tài)修復(fù)方面取得了一些新的進(jìn)展。例如，黃建洪等[6]發(fā)現(xiàn)羽序燈心草具有較強(qiáng)的惡劣環(huán)境適應(yīng)性及Zn/Cu 耐受性，具有較大的修復(fù)酸性礦山廢棄場(chǎng)地的潛力。葉文玲等[7]的研究結(jié)果表明蘇槐藍(lán)、續(xù)斷菊、苦賣菜和巢菜可作為耐性植物，應(yīng)用于重金屬含量比較高的尾礦區(qū)修復(fù)。薛清潑等[8]指出可選用苜蓿修復(fù)鈾礦污染土壤中的U和Cd。

我想：重點(diǎn)在心意，只要味道好就可以了。之后，我先往鍋里倒一些油，等油微熱便把肉倒進(jìn)了鍋里，一下子，熱油像發(fā)怒了似的全都濺了出來。我非常害怕，飛一般地跑開，等油不再四處飛濺了，再跑回去。這時(shí)，肥肉正好有些微黃，根據(jù)爸爸的指導(dǎo)，我將煤氣調(diào)到小火，往鍋中倒入醬油、料酒，撒入少許的糖，翻炒幾下后加入了一碗水，使水剛剛沒過肉。再調(diào)到大火，沸騰約七分鐘后，復(fù)調(diào)成小火燉了一個(gè)多小時(shí)，爸爸掀開鍋蓋，看了一眼后，對(duì)我說：“兒子，準(zhǔn)備收汁！”我趕緊調(diào)大火收汁。眼前一塊塊五花肉油亮亮的，香氣撲鼻，實(shí)在太誘人了！

十字花科的許多種類植物由于生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量較高、易于收獲等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)作為植物修復(fù)候選者被廣泛報(bào)道。雪里蕻（Brassica juncea，Coss），又名雪里紅，隸屬于十字花科、蕓苔屬，是我們常見的蔬菜之一。本課題組于2012—2015 年對(duì)陜西鳳縣某鋅冶煉廠（33°56′45.5″N，106°31′53.5″E）周邊65 種植物（分屬28 科、56 屬）的生物量、重金屬富集轉(zhuǎn)運(yùn)能力和耐受性進(jìn)行了分析。雪里蕻從眾多植物中脫穎而出，其對(duì)Cd 和Zn 有較好的富集和耐受能力，在修復(fù)Cd、Zn 污染土壤方面具有很大的應(yīng)用潛力[9]。然而，在試驗(yàn)條件可控情況下，基于雪里蕻作為修復(fù)植物的目的，關(guān)于其對(duì)Cd、Zn 耐受性和富集轉(zhuǎn)運(yùn)能力的系統(tǒng)研究還未曾報(bào)道。因此，本研究著眼于探討供試植物雪里蕻在不同培養(yǎng)方式（土培和砂培）下對(duì)于重金屬Cd、Zn的富集轉(zhuǎn)運(yùn)能力及雪里蕻生長(zhǎng)狀況和生理響應(yīng)，以期為雪里蕻修復(fù)農(nóng)業(yè)Cd、Zn 污染場(chǎng)地提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，為土壤重金屬植物修復(fù)技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用污染土壤采自陜西省鳳縣某鋅冶煉廠附近的農(nóng)田，干凈土壤采自距該鋅冶煉廠上風(fēng)向10 km左右的農(nóng)田，取樣深度為0～20 cm。采集的土壤去除大顆粒石塊和植物殘骸，風(fēng)干后過2 mm尼龍網(wǎng)篩。供試土壤基本理化性質(zhì)如表1所示。

該方案的缺點(diǎn)為：地鐵車站被一分為二，對(duì)客流組織、運(yùn)營(yíng)管理、設(shè)備布置以及消防疏散提出了更高要求；乘客使用不方便，運(yùn)營(yíng)管理人員、費(fèi)用將增加；車站與高架橋總寬度約46 m，占用地下空間資源較大；施工過程中增加了兩排圍護(hù)墻，工程造價(jià)有一定的增加。

取121 ℃下滅菌30 min、直徑9 cm 的培養(yǎng)皿作為種子發(fā)芽皿床，在每個(gè)培養(yǎng)皿中放置兩張與皿同大小的無(wú)菌濾紙。按照設(shè)計(jì)處理，在相應(yīng)的皿床中加入10 mL 的蒸餾水（對(duì)照組）或重金屬溶液，設(shè)計(jì)濃度如表5 所示。選大小一致的雪里蕻種子30 粒，經(jīng)5%NaClO 溶液消毒后用蒸餾水沖洗干凈，并浸種6 h，然后均勻置于準(zhǔn)備好的濾紙皿床中，蓋上皿蓋，在28 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天以稱質(zhì)量法添加蒸餾水保持皿床的濕度，一周之內(nèi)觀察種子的萌發(fā)情況（以胚芽或胚根突破種皮者計(jì)為萌發(fā)）[10]。

群眾就業(yè)問題。潿洲島旅游產(chǎn)品開發(fā)程度較低，同質(zhì)化現(xiàn)象突出，休閑度假產(chǎn)品較少，沒有形成具有潿洲島地方特點(diǎn)和清晰明確的旅游產(chǎn)品體系。仍以旅游觀光產(chǎn)品為主，游客當(dāng)天往返，刺激島上經(jīng)濟(jì)發(fā)展和帶動(dòng)島內(nèi)居民就業(yè)及收入提高的作用不強(qiáng)。

砂培試驗(yàn)所用Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液配方如表2 所示。配制全營(yíng)養(yǎng)液時(shí)，取A液、B液各10 mL、C液與鐵鹽溶液各1 mL 進(jìn)行混合，然后稀釋至1 L，即得理論濃度的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液。Cd、Zn 復(fù)合重金屬溶液中Cd、Zn 的來源分別為CdCl2、ZnCl2（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。分別稱取CdCl2、ZnCl2溶于蒸餾水中，制成100 mg·L-1和1 000 mg·L-1的Cd/Zn 儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中，使用時(shí)按設(shè)計(jì)濃度進(jìn)行稀釋。

1.2 不同培養(yǎng)方式下雪里蕻Cd、Zn耐性及富集特性試驗(yàn)

過氧化氫酶（CAT）是一種存在于生物體內(nèi)的金屬酶，可將對(duì)生物體有害的H2O2分解為H2O 和O2。由圖4C 可看出，砂培下雪里蕻植株內(nèi)CAT 活性隨著Cd、Zn 濃度的不斷增高而逐漸降低，并在S4 處理時(shí)達(dá)到最低值15.0 U·g-1FW·min-1。Feng 等[29]研究表明，當(dāng)植物中的重金屬含量達(dá)到一定濃度時(shí)，CAT 活性會(huì)受到抑制。Chen等[30]表示，CAT活性取決于植物受重金屬脅迫的程度。朱成豪等[25]發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cd、Zn 濃度尤其是Cd 濃度持續(xù)增加到一定程度時(shí)，麻瘋樹植株受到毒害作用而產(chǎn)生的過量O-2會(huì)使CAT 氧化壓力增大，失去調(diào)節(jié)平衡，催化H2O2分解的能力減弱，植物細(xì)胞可能發(fā)生膜脂過氧化，CAT活性降低。

土培試驗(yàn)在西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院旱棚中進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，共計(jì)15盆。采用圓形塑料盆（高12 cm、直徑20 cm），將已風(fēng)干的供試土壤過孔徑2 mm 尼龍篩后裝盆，每盆3 kg，再分別加入N 0.3 g·kg-1、P 0.2 g·kg-1和K 0.3 g·kg-1（來源分別為尿素、磷酸二氫鈉和氯化鉀，分析純）作為底肥。每盆播種經(jīng)5% NaClO 消毒的雪里蕻種子20 粒，待幼苗長(zhǎng)出真葉后，間苗為5 株。每天給盆栽添加自來水（未檢測(cè)出Cd、Zn），維持土壤田間持水量的70%。經(jīng)55 d的生長(zhǎng)期，將成熟植物的莖葉和根系分別用自來水沖洗后再用去離子水洗凈，裝入信封105 ℃下殺青30 min，然后在70 ℃下烘至恒質(zhì)量，稱量干物質(zhì)質(zhì)量，研磨過20目篩，密封保存[5]。另外，采集盆栽土100 g左右，自然風(fēng)干，分別過100目和20目篩，用于測(cè)定土壤的理化性質(zhì)和重金屬含量。試驗(yàn)處理設(shè)計(jì)見表3。

若要滿足H(m,n)的點(diǎn)可區(qū)別邊染色,需引入種顏色對(duì)一些邊的顏色重新作調(diào)整,首先將邊u11u12染為k+2色,u0(2n+2)u1(2n+1)染為k+1色,um2um3染為色；其次,把邊us(2n+1)us(2n+2)(s=1,3,…,m-1)染為色,把邊us1us2(s=3,5,…,m-1)染為色。

表1 土壤部分基本理化性質(zhì)Table 1 Physical and chemical properties of the soil

表2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配方Table 2 The recipe of nutrient solution for potherb mustard

1.2.2 砂培試驗(yàn)

砂培試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，共計(jì)15 盆。砂培杯中采用20 目石英砂為基質(zhì)（石英砂經(jīng)過泡酸和水洗處理去除重金屬）。選大小一致的雪里蕻種子20 粒，經(jīng)5% NaClO 消毒、蒸餾水浸種后播種于砂培杯中，并在表面覆蓋60～100 目石英砂少許，以減少水分散失。砂培杯放置于人工氣候室，白天溫度25 ℃，光照16 h；晚上溫度18 ℃，黑暗8 h。每天稱質(zhì)量法交替補(bǔ)充1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液或設(shè)計(jì)濃度的Cd/Zn 復(fù)合溶液，觀察雪里蕻出苗和幼苗生長(zhǎng)情況，待長(zhǎng)出真葉后，每盆間苗為3 株[10]。經(jīng)55 d 的生長(zhǎng)期，將成熟植物的莖葉和根系分別用自來水沖洗后再用去離子水洗凈，取1 g左右莖葉鮮樣于3 d內(nèi)測(cè)定雪里蕻生理生化指標(biāo)，其余樣品裝入信封105 ℃下殺青30 min，然后在70 ℃下烘至恒質(zhì)量，稱量干物質(zhì)質(zhì)量，研磨過20 目篩，密封保存。綜合考慮前人研究[2，10]并結(jié)合先前雪里蕻砂培預(yù)試驗(yàn)的生長(zhǎng)狀況，本試驗(yàn)處理設(shè)計(jì)如表4。

表3 土培試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Experimental design of soil culture experiment

1.3 Cd、Zn脅迫下雪里蕻種子萌發(fā)試驗(yàn)

雪里蕻種子購(gòu)自安徽省淮南市玉良種子公司，發(fā)芽率≥85%。

表4 砂培試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 4 Experimental design of sand culture

表5 種子萌發(fā)試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 5 Experimental design of seed germination

統(tǒng)計(jì)發(fā)芽試驗(yàn)第4 d 雪里蕻種子的發(fā)芽率，即為發(fā)芽勢(shì)。

粉彩花鳥瓷繪畫中粉彩清雅的釉色與瓷器瑩潤(rùn)的玻璃白的結(jié)合與國(guó)畫中花鳥作品的線條和清雅的色彩有著異曲同工之妙。

統(tǒng)計(jì)發(fā)芽試驗(yàn)第7 d 雪里蕻種子的發(fā)芽率，即為發(fā)芽率。

1.4 指標(biāo)的測(cè)定

取0.500 g 新鮮雪里蕻葉片剪成0.2 cm 左右的小塊，在研缽中加入0.1 mol·L-1pH 7.0 的磷酸緩沖液（Na2HPO4-KH2PO4）進(jìn)行冰浴研磨（加入少量石英砂）。待磨成勻漿后，將其轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，在4 ℃下10 000 r·min-1離心15 min，然后用定性濾紙進(jìn)行過濾，得到的過濾液即為粗酶液。測(cè)定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）時(shí)，取1 mL 粗酶液于10 mL具塞試管中，加入5 mL 0.5% 硫代巴比妥酸溶液，搖勻。將試管放入沸水浴中煮沸10 min（自試管出現(xiàn)小氣泡開始計(jì)時(shí)），隨后立即取出并放入冷水浴中冷卻至室溫。將該溶液在3 000 r·min-1下離心15 min，取上清液分別于532、600、450 nm 下測(cè)定吸光度，計(jì)算公式見公式（3），式中Vt和Vs分別為測(cè)定時(shí)取用粗酶液的體積和粗酶液的定容體積，單位均為mL。

稱取0.500 g 充分烘干、磨碎的植物樣品于100 mL 錐形瓶中，加入10 mL HNO3-HClO4（3∶1）混酸，置于不斷升溫的電熱板上消解。在消解過程中，不斷補(bǔ)充HNO3溶液以防止煮干。待溶液消解至無(wú)色透明，將最終溶液在室溫下定容至50 mL，經(jīng)過濾后，用火焰原子分光光度計(jì)（Z-5000，日立，日本）測(cè)定溶液中Cd、Zn的含量[11]。

1.4.2 丙二醛及植物酶的含量

1.4.1 植物中Cd、Zn的含量

傳統(tǒng)的通過徑向振動(dòng)信號(hào)診斷轉(zhuǎn)軸裂紋的方法中，最有效的就是監(jiān)測(cè)對(duì)比轉(zhuǎn)子過1/2、1/3等臨界轉(zhuǎn)速時(shí)的1、2、3倍頻信號(hào)幅值改變程度和觀察對(duì)比轉(zhuǎn)子臨界轉(zhuǎn)速的改變量，也就是軸裂紋的徑向振動(dòng)信號(hào)特征，只有在機(jī)組啟停機(jī)轉(zhuǎn)子升降速時(shí)才有明顯的表現(xiàn)，但是石化等流程企業(yè)中運(yùn)行的大型機(jī)組，通常運(yùn)行周期多在一年以上，中途不會(huì)為了檢查轉(zhuǎn)子裂紋而做停機(jī)升降速試驗(yàn)，這樣對(duì)企業(yè)來說少則是幾百萬(wàn)元、多則是數(shù)千萬(wàn)元的損失，而轉(zhuǎn)子軸的裂紋從生成到擴(kuò)展斷裂，時(shí)間就短得多，因此就需要有一個(gè)新的方法，在轉(zhuǎn)速變化不大的正常運(yùn)轉(zhuǎn)中，監(jiān)測(cè)診斷轉(zhuǎn)子軸裂紋的生成與擴(kuò)展。

植物葉片中多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）和葉綠素含量根據(jù)Guo 等[5]的方法利用紫外分光光度計(jì)（UVmini-1240，島津，日本）進(jìn)行吸收測(cè)定?？扇苄缘鞍椎臏y(cè)定遵照Z(yǔ)heng 等[12]的方法：取植物提取液0.2 mL，加入0.9 mL 蒸餾水和5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250 試劑，充分混合，放置2 min 后在595 nm下比色。

1.4.3 土壤中Cd、Zn的含量

稱取0.500 g 過100 目篩（0.149 mm）的土壤于100 mL 錐形瓶中，加入10 mL HCl-HNO3-HClO4混酸（V/V/V，5∶5∶1），放置過夜。次日，將錐形瓶置于電熱板上190 ℃消解，過程中補(bǔ)充HNO3溶液以防止燒干。待土壤消解至灰白色，取下錐形瓶冷卻至室溫。用蒸餾水定容至50 mL，定性濾紙過濾。濾液用火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定溶液中Cd、Zn的含量，即為全量Cd、Zn[13]。

1.5 植物提取指數(shù)計(jì)算

植物重金屬耐性系數(shù)（Tolerance index，TI）和植物提取指數(shù)，即生物富集系數(shù)（Biological concentration factor，BCF）、轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（Translocation factor，TF）和金屬提取量（Metal extraction factor，MEA）計(jì)算公式[5]分別為：

植物生理代謝活動(dòng)中，在葉綠體中進(jìn)行的光合作用是一重要反應(yīng)。單位質(zhì)量植物葉綠素的含量可以用來表示植物光合作用的強(qiáng)弱，從而指示植物的生理活性[20]。由圖3可知，隨著Cd、Zn濃度的增大，土培和砂培雪里蕻的葉綠素含量均呈不斷下降趨勢(shì)，這與劉亮[21]和李元等[22]研究結(jié)果一致，表明Cd會(huì)降低雪里蕻葉綠素含量，抑制雪里蕻光合作用。這可能是由于Cd 抑制了與葉綠素前體合成相關(guān)酶的作用，導(dǎo)致葉綠素分解，破壞了葉綠體微結(jié)構(gòu)[23]。Zn參與植物葉綠素的形成，但當(dāng)Zn 濃度超過一定臨界值后會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用，減弱植物光合作用，抑制植物的生長(zhǎng)[