清氣化痰丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

倪 琳，魏學(xué)冰，李若綺

（甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070）

清氣化痰丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

倪 琳，魏學(xué)冰，李若綺

（甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，甘肅 蘭州 730070）

目的 提高清氣化痰丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中半夏、陳皮、茯苓、苦杏仁進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定制劑中橙皮苷、黃芩苷和苦杏仁苷的含量，色譜柱：CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.4%磷酸（B）溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，流速 1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 222 nm，柱溫 30℃，進(jìn)樣量為 10 μl。結(jié)果 半夏、陳皮、茯苓、苦杏仁的TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度較好，陰性對(duì)照無干擾。橙皮苷、黃芩苷、苦杏仁苷檢測(cè)質(zhì)量控制線性范圍分別為 10.68～53.40 μg/min（r=0.999 3），43.60～218.00 μg/min（r=0.999 9），23.02～115.10 μg/min（r=0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜1.00%，加樣回收率分別為96.62%～103.42%（RSD=2.86%，n=6），95.58%～101.51%（RSD=2.03%，n=6），96.14%～102.72%（RSD=2.89%，n=6）。結(jié)論 該標(biāo)準(zhǔn)可用于清氣化痰丸的質(zhì)量控制。

清氣化痰丸；橙皮苷；黃芩苷；苦杏仁苷；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

清氣化痰丸由黃芩（酒炒）、瓜蔞仁霜、半夏（制）、陳皮、膽南星、生姜、苦杏仁、枳實(shí)、茯苓九味中藥材組成，具有清肺化痰功效，臨床上用于治療肺熱咳嗽，痰多黃稠、胸脘滿悶等癥[1]。該制劑現(xiàn)執(zhí)行《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑（第七冊(cè)）》中的標(biāo)準(zhǔn)，原標(biāo)準(zhǔn)僅有鑒別及常規(guī)檢查項(xiàng)，不利于藥品質(zhì)量控制，為了更好地控制其質(zhì)量，有必要對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂。本研究采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中半夏、陳皮、茯苓、苦杏仁四味藥材進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)制劑中的主要有效成分橙皮苷、黃芩苷、苦杏仁苷進(jìn)行定量分析，為提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Waters Alliance e2695型HPLC儀，包括二極管陣列檢測(cè)器（Waters 2998）；KQ3200DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，200 W，40 kHz）；Mettler AE240電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

清氣化痰丸（蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號(hào)：15C1-1、15J2-1、15J3-1，規(guī)格：每6丸相當(dāng)于原生藥3 g）。橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110721-201316，純度：93.3%），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201318，純度：93.3%），苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)：110820-201508，純度：93.4%），半夏對(duì)照藥材（批號(hào)：121272-200401），陳皮對(duì)照藥材（批號(hào)：120969-201109），枳實(shí)對(duì)照藥材（批號(hào)：120936-201005），茯苓對(duì)照藥材（批號(hào)：121090-201002），苦杏仁對(duì)照藥材（批號(hào)：121554-200702）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 半夏 取樣品5 g，研細(xì)，加乙醇25 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖? ml使溶解，作為供試品溶液。取半夏對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按清氣化痰丸處方和工藝制備半夏的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按TLC法[2]試驗(yàn)，取上述3種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯-丙酮- 甲酸（30∶60∶4∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以 10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

2.1.2 陳皮、枳實(shí) 取樣品3 g，研細(xì)，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。取陳皮、枳實(shí)對(duì)照藥材各1 g，分別同法制成對(duì)照藥材溶液；再取橙皮苷對(duì)照品，加甲醇制成飽和溶液，作為對(duì)照品溶液。按清氣化痰丸處方和工藝制備陳皮、枳實(shí)的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按TLC法[2]試驗(yàn)，取上述4種溶液各3 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇 - 水（40∶7∶4）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

2.1.3 茯苓 取樣品5 g，研細(xì)，加乙醚50 ml，超聲處理10 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。取茯苓對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按清氣化痰丸處方和工藝制備茯苓的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。按TLC法[2]試驗(yàn)，取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液5 μl，對(duì)照藥材溶液10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯 - 乙酸乙酯 - 甲酸（20∶5∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸試液-乙醇（4∶1）混合溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

2.1.4 苦杏仁 取樣品5 g，研細(xì)，加甲醇50 ml，加熱回流30 min，放冷，濾過，濾液作為供試品溶液。取苦杏仁對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按清氣化痰丸處方和工藝制備苦杏仁的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。按TLC法[2]試驗(yàn)，取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液5 μl、對(duì)照藥材溶液10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯 - 甲醇 - 水（15∶40∶22∶10）5～10℃放置 12 h 的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，立即用含0.8%磷鉬酸的15%硫酸乙醇溶液浸板，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外燈（254 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。

2.2 橙皮苷、黃芩苷、苦杏仁苷的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱選用CAPCELL PAK C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.4%磷酸（B）梯度洗脫，0～10 min，A 為 15%，B為 85%；11～50 min，A 為25%，B為75%；51～80 min，A為15%，B為85%；檢測(cè)波長(zhǎng)為222 nm；柱溫 30℃，流速：1.0 ml/min，進(jìn)樣量：10 μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以苦杏仁苷峰、橙皮苷峰、黃芩苷峰計(jì)算均不低于4 000。供試品中的苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷與其他雜質(zhì)峰均能很好地分離，分離度＞1.5。結(jié)果見圖1～2。

圖1 對(duì)照品高效液相色譜圖

圖2 供試品高效液相色譜圖

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含苦杏仁苷對(duì)照品0.115 1 mg、橙皮苷對(duì)照品0.053 4 mg、黃芩苷對(duì)照品0.218 0 mg的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品約1 g，研細(xì)，精密稱定，精密加入甲醇100 ml，密塞，稱定重量，加熱回流3 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取混合對(duì)照品溶液2、4、6、8、10 ml，分別置于10 ml量瓶中，加甲醇定容，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各10 μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定峰面積積分值，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，分別得到回歸方程：苦杏仁苷y=9.759 0×105x+2.820 3×104（r=0.999 9），橙皮苷y=1.855 4×106x+7.760 8×104（r=0.999 3），黃芩苷y=3.706 7×106x-6.931 6×104（r=0.999 6）。結(jié)果表明，苦杏仁苷在23.02～115.10 μg/ml范圍內(nèi)、橙皮苷在 10.68～53.40 μg/ml范圍內(nèi)、黃芩苷在43.62～218.00 μg/ml范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 按處方比例及制備工藝，配制不含黃芩、陳皮、枳實(shí)、苦杏仁的陰性樣品，并按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果本品在苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷混合對(duì)照品相應(yīng)位置處無色譜峰出現(xiàn)，說明本品陰性無干擾。結(jié)果見圖3。

圖3 陰性對(duì)照高效液相色譜圖

2.2.6 儀器精密度試驗(yàn) 取清氣化痰丸（批號(hào)：15C1-1），按“2.2.3”項(xiàng)下方法提取，重復(fù)進(jìn)樣6次，結(jié)果苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為1.29%、0.44%、0.23%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取清氣化痰丸（批號(hào)：15C1-1），按“2.2.3”項(xiàng)下方法提取供試品6份，測(cè)定苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷RSD分別為0.39%、1.22%、0.60%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取已知苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷含量的供試品（批號(hào)：15C1-1）6份，每份約0.12 g，精密稱定，分別精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液（苦杏仁苷0.107 5 mg/ml、橙皮苷0.051 8 mg/ml、黃芩苷0.107 4 mg/ml），用氮吹儀將溶媒吹干，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定供試品中苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.7”項(xiàng)下樣品，分別在 0、5、10、15、20、25、32 h測(cè)定峰面積，苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷峰面積穩(wěn)定，RSD分別為0.95%、0.44%、1.12%，表明供試品溶液在室溫下放置32 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 樣品的測(cè)定 取清氣化痰丸3批，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定苦杏仁苷、橙皮苷、黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 不同溶媒及提取方法的比較

分別以甲醇加熱回流3 h、70%乙醇回流3 h、甲醇超聲3 h提取樣品（批號(hào)：15C1-1）中黃芩苷、橙皮苷的含量[3]，結(jié)果：甲醇加熱回流3 h，黃芩苷6.052 mg/g、橙皮苷0.763 mg/g、苦杏仁苷0.772 mg/g）；70%乙醇回流3 h，黃芩苷13.892 mg/g、橙皮苷2.064 mg/g、苦杏仁苷1.029 mg/g；甲醇超聲3 h，黃芩苷0.064 mg/g、橙皮苷1.432 mg/g、苦杏仁苷0.672 mg/g。故以70%乙醇作為溶媒提取樣品，黃芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷的含量較高。

3.2 考察以70%乙醇作為溶媒，不同提取時(shí)間的比較

分別以70%乙醇回流2 h、70%乙醇回流3 h、70%乙醇回流4 h提取樣品（批號(hào)：15C1-1）中黃芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷的含量，結(jié)果：70%乙醇回流2 h，黃芩苷5.022 mg/g、橙皮苷1.221 mg/g、、苦杏仁苷1.002 mg/g；70%乙醇回流3 h，黃芩苷13.894 mg/g、橙皮苷2.062 mg/g、苦杏仁苷1.029 mg/g；70%乙醇回流4 h，黃芩苷 5.072 mg/g、橙皮苷 2.273 mg/g、苦杏仁苷 1.013 mg/g。由結(jié)果看出，70%乙醇回流4 h，橙皮苷的含量較回流3 h高，但黃芩苷的含量不到回流3 h的1/2，故選取以70%乙醇回流提取3 h。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在200～400 nm處分別測(cè)定黃芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷的最大吸收波長(zhǎng)，測(cè)得黃芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷均在222 nm處有最大吸收，故選擇在222 nm處同時(shí)測(cè)定樣品中黃芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷的含量[4～6]。

3.4 耐用性考察

本研究比較了不同類型的色譜柱（Agilent Zorbax SB C18、Waters SunFire C18、CAPCELL PAK C18），不同生產(chǎn)廠家（Waters、Agilent、島津公司）的儀器，不同柱溫（25℃、30℃、35℃、40℃）以及不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）的影響，均得到滿意結(jié)果，說明該方法耐用性良好。

3.5 流動(dòng)相的選擇

對(duì)流動(dòng)相的使用起初參考相關(guān)文獻(xiàn)提出的甲醇-0.2%磷酸溶液（47∶53）[7]，由于甲醇在 205 nm處存在末端吸收，故使用乙腈作為流動(dòng)相。參考相關(guān)文獻(xiàn)[8～11]，采用乙腈（A）-0.4%磷酸（B）梯度洗脫，黃芩苷、橙皮苷、苦杏仁苷峰分離度較好、基線噪音小。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、耐用性均符合要求，可作為清氣化痰丸質(zhì)量控制的方法。

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑（第七冊(cè)）[S]．1998．

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（四部）[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015．

[3]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015．

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R284

A

1671-1246（2017）23-0081-03