長鏈非編碼RNA PCAT19通過負(fù)調(diào)控p53水平促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖

劉艷紅 賈金廣 王富霞

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)在所有肺癌中占80%[1-2]。在男性和女性的癌癥相關(guān)死亡率中，肺癌分別占26%和25%[3]。經(jīng)過積極的手術(shù)切除、化學(xué)和放射治療后I期肺癌中不到50%的患者和Ⅳ期癌癥中不足5%的患者在初診后的生存時間超過五年[4]。在過去的幾十年中，肺癌患者的總生存率并未顯著提高，這主要由于早期就診率低，大多數(shù)肺癌患者確診時已處于晚期階段[5]。p53為一種抑癌基因，經(jīng)過基因組測序發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中失活，導(dǎo)致細(xì)胞失去控制無限增殖[6]。p53參與癌癥的發(fā)展受特定的長鏈非編碼(lnc)RNA的調(diào)控[7]，lncRNA家族不可編碼蛋白質(zhì)，可通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)參與許多細(xì)胞過程[8]。前列腺癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄物19(PCAT19)已被證明可以激活與前列腺癌進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞周期基因，從而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[9]，另外還發(fā)現(xiàn)PCAT19也可以促進(jìn)喉癌的發(fā)展[10]。本研究主要檢測lncRNA PCAT19在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平及對非小細(xì)胞肺癌進(jìn)展的影響。

資料與方法

一、一般資料

選取2013年1月至2015年1月在鄭州市人民醫(yī)院接受手術(shù)治療的NSCLC患者78例，男性52例，女性26例，年齡37～71歲，術(shù)后進(jìn)行常規(guī)化療。收集患者的腫瘤組織和對應(yīng)癌旁組織(距離腫瘤邊緣≥5cm)。收集患者的一般臨床資料包括：性別、年齡、病理類型、分化程度、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后5年生存率。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者同意并簽署知情同意書。

二、實(shí)驗(yàn)材料

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549購于上海細(xì)胞生物學(xué)研究所；RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、MTT粉末等購于北京鼎國有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司；PCAT19和p53一抗和二抗購于美國Cell Signaling Technology公司；PCAT19質(zhì)粒、PCAT19干擾質(zhì)粒(PCAT19-siRNA)和p53質(zhì)粒由北京華大基因合成。

三、方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

A549細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞密增生長到80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。A549細(xì)胞以104個/孔的密度接種于6孔細(xì)胞板，常規(guī)培養(yǎng)24h，細(xì)胞融合度約為70%時，將對數(shù)生長期的A549細(xì)胞隨機(jī)分為PCAT19組(轉(zhuǎn)染PCAT19質(zhì)粒)、siRNA組(轉(zhuǎn)染PCAT19-siRNA質(zhì)粒)、NC組(轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒)、對照組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)、PCAT19+p53組(轉(zhuǎn)染PCAT19和p53質(zhì)粒)，按照脂質(zhì)體lipofeetamine 2000說明書步驟操作，轉(zhuǎn)染6h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集各組細(xì)胞，qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果。

2 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

收集組織和細(xì)胞樣品根據(jù)試劑盒說明書提取組織和細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說明進(jìn)行實(shí)時定量PCR。以管家基因GAPDH的mRNA水平作為內(nèi)參照。引物設(shè)計(jì)如下：PCAT19上游引物序列5′-TCAGAAC AGGGAACCATTGG-3′，下游引物序列5′-CAAG AAGATTCTTATCAGC T-3′，野生型p53上游引物序列5′-GCCCAACAACACCAGCTCCT-3′，下游引物序列5′-CCTGGGCATCCTTGAGTT CCT-3′，GAPDH上游引物序列5′-AGAAAAACCTGCCAAAT ATGATGAC-3′，下游引物序列5′-TGGGTGTCGCTGTT GA AGTC-3′。采用ΔΔCt 法計(jì)算mRNA水平。NSCLS組織中PCAT19 mRNA的表達(dá)水平高于癌旁組織中的水平定義為PCAT19高表達(dá)，低于癌旁組織中的水平定義為PCAT19低表達(dá)。

3 Western blot實(shí)驗(yàn)

收集PCAT19組、siRNA組、NC組、對照組細(xì)胞中的總蛋白。用BCA蛋白定量取30μg的蛋白，并配置5 %的濃縮膠15 %的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用1% BSA室溫封閉2 h、之后經(jīng)過一抗孵育(1 ∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜)、TBST洗滌3次、二抗孵育(1 ∶4 000稀釋，室溫孵育1 h)、TBST洗滌3次后，在膜上滴加適量化學(xué)發(fā)光顯色液并置于Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

收集PCAT19組、siRNA組、NC組、對照組、PCAT19+p53組細(xì)胞以每孔5×103的密度接種于96孔板中，分別設(shè)置的培養(yǎng)檢測時間為12h、24h、36h、48h、60h和72h，每個檢測時間點(diǎn)設(shè)置6個平行孔，20μL MTT溶液加入檢測孔中，繼續(xù)孵育4h。然后去除上清，每孔加入150μL二甲基亞砜溶液，震蕩5min然后用酶標(biāo)儀檢測570nm處的吸光度值(OD)，OD值與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、PCAT19在NSCLC組織中表達(dá)水平增加且降低患者的5年生存率

PCAT19在NSCLC組織中的平均表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.001)，其中55例患者NSCLC組織中PCAT19的表達(dá)水平高于癌旁組織(見圖1A)。PCAT19高表達(dá)組與PCAT19低表達(dá)組患者在性別、年齡、病理類型和分化程度之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間有差異(見表1)，且PCAT19高表達(dá)組患者的5年生存率顯著低于PCAT19低表達(dá)組(見圖1B)。

表1 PCAT19高表達(dá)與PCAT19低表達(dá)患者的臨床資料比較[例(%)]

圖1 PCAT19在NSCLC組織中表達(dá)水平增加且降低患者的5年生存率

二、PCAT19的表達(dá)水平與p53成負(fù)相關(guān)

NSCLC組織中p53 mRNA相對表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示NSCLC組織中PCAT19的表達(dá)水平與p53 mRNA呈負(fù)相關(guān)r=-0.279,P=0.014(見圖2)。

圖2 PCAT19的表達(dá)水平與p53成負(fù)相關(guān)

三、PCAT19負(fù)調(diào)控p53的表達(dá)

PCAT19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中其表達(dá)水平顯著高于對照組和陰性對照組(見圖3A)，PCAT19高表達(dá)組中p53 mRNA相對表達(dá)水平低于對照組和陰性對照組(見圖3B)，PCAT19高表達(dá)組細(xì)胞中PCAT19蛋白水平高于對照組和陰性對照組，而p53蛋白水平低于對照組和陰性對照組(見圖3C)。PCAT19-siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中其表達(dá)水平降低(見圖3D)，PCAT19低表達(dá)組中p53 mRNA相對表達(dá)水平高于對照組和陰性對照組(見圖3E)，PCAT19低表達(dá)組細(xì)胞中PCAT19蛋白水平低于對照組和陰性對照組，而p53蛋白水平高于對照組和陰性對照組(見圖3F)。

圖3 PCAT19負(fù)調(diào)控p53的表達(dá)

四、PCA19T通過調(diào)節(jié)p53的水平影響A549細(xì)胞的增殖能力

經(jīng)過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測顯示，PCAT19高表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)于對照組和陰性對照組，PCAT19-siRNA組細(xì)胞的增殖能力弱于對照組和陰性對照組，PCAT19+p53組細(xì)胞的能力與對照組和陰性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與PCAT19高表達(dá)組相比有所減弱(見圖4)。

圖4 PCAT19通過調(diào)節(jié)p53的水平影響A549細(xì)胞的增殖能力

討 論

LncRNA 發(fā)揮作用的方式多種多樣，不僅可與DNA相互作用，還可與蛋白質(zhì)、RNA 或蛋白復(fù)合體結(jié)合相互作用，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及蛋白質(zhì)水平發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。lncRNA 作為主要的調(diào)節(jié)性RNA，在表觀遺傳或遺傳水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。lncRNA的作用在多種病理生理過程中均有研究，包括自閉癥譜系障礙、癌癥、心血管疾病、阿爾茨海默氏病和生殖發(fā)育等[11-15]。相同的lncRNA在不同類型的癌癥中可能發(fā)揮相似的功能，例如HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA在大多數(shù)癌癥中被上調(diào)，其過表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和遷移，并抑制細(xì)胞凋亡[16]。但是，不同類型癌癥的發(fā)病機(jī)理是不同的，因此在一種癌癥中使用特定lncRNA的功能來推測或預(yù)測其在另一種癌癥中的作用機(jī)制是不合理的。例如，lncRNA牛磺酸上調(diào)的基因1(TUG1)在許多惡性腫瘤中均被上調(diào)，并促進(jìn)細(xì)胞侵襲和增殖[17]，然而，在最近的一項(xiàng)研究顯示TUG1在進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，表明其在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中發(fā)揮腫瘤抑制功能[18]。

現(xiàn)已研究顯示PCAT19在前列腺癌和喉癌中促進(jìn)癌癥的進(jìn)展，在喉癌中l(wèi)ncRNA PCAT19通過調(diào)節(jié)miR-182/PDK4軸促進(jìn)喉癌細(xì)胞的增殖[9]。在前列腺癌中l(wèi)ncRNA PCAT19通過調(diào)控細(xì)胞周期基因子集，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[10]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)PCAT19在NSCLC組織中的表達(dá)上調(diào)，有可能成為NSCLC早期診斷的腫瘤標(biāo)記物，提高NSCLC的早期診斷率。PCAT19與NSCLC患者的病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，PCAT19高表達(dá)組II-III期患者比例較高，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者較多，且顯著降低患者的5年生存率，有望成為NSCLC不良預(yù)后的檢測指標(biāo)。癌癥生物學(xué)中的p53信號傳導(dǎo)可以通過某些特定的lncRNA來調(diào)節(jié)，在本研究中結(jié)果顯示PCAT19是p53的負(fù)調(diào)節(jié)劑，可影響NSCLC細(xì)胞的增殖。綜上所述，PCAT19在NSCLC組織中上調(diào)，通過下調(diào)p53促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖，有望成為NSCLC早期診斷或不良預(yù)后的指標(biāo)。