尺澤穴位注射對慢阻肺大鼠氣道組織形態(tài)學(xué)和氧化水平的影響

黃培煒 林靜瑜 周凡 周春權(quán) 許金森

慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是以持續(xù)存在呼吸道癥狀和氣流受限為特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病[1]，致殘率和病死率居高不下，預(yù)計(jì)不久，慢阻肺在全球死亡病因中位居第三[2]。氧化還原失衡是慢阻肺重要的發(fā)病機(jī)制之一，香煙煙霧，空氣污染顆粒等氧化劑除了可直接造成氣道組織的損傷，還可誘發(fā)氣道組織的炎癥反應(yīng)、導(dǎo)致蛋白酶/抗蛋白酶失衡，加重慢阻肺的發(fā)生發(fā)展[3]。目前臨床上慢阻肺治療仍無特效藥，急性期以激素，擴(kuò)張支氣管、抗感染、機(jī)械通氣等對癥治療，穩(wěn)定期則以預(yù)防發(fā)作、延緩進(jìn)展為主要治療目標(biāo)，然而遠(yuǎn)期綜合療效評估仍欠佳、且長期用藥存在著副作用大的問題[4]。研究報(bào)道：針灸在改善慢阻肺患者臨床體征、肺部功能，血?dú)夥治鲋笜?biāo)、提高生活質(zhì)量等方面具有一定的效果[5-7]，且經(jīng)濟(jì)安全。本文建立脂多糖聯(lián)合煙熏慢阻肺大鼠，考察肺經(jīng)合穴尺澤穴注射生理鹽水，對慢阻肺大鼠氣道組織形態(tài)學(xué)及血清、肺組織SOD、MDA的影響，初步探討針刺治療慢阻肺的作用機(jī)理。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1 動物

SD大鼠，雄性21只，清潔級，體重240±20g，9周齡，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)有限責(zé)任公司提供。許可證號碼：SCXK(瀘)2017-0005；合格證號碼：20170005006824。

2 試劑與儀器

香煙(七匹狼，焦油量10mg，煙堿0.9mg，一氧化碳12mg)；脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)(中國生物檢驗(yàn)檢定所，規(guī)格：100mg，批號：S09M10I87813)；自制氣管插管；有機(jī)玻璃煙熏箱(大小為100cm×60cm×30cm)；SOD檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20191211)；MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20191010)：BCA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20191203)；酶標(biāo)儀(Therom，Varioskan Flash)；低溫高速離心機(jī)(Therom，ST16R)；DNP-9162型恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1 大鼠慢阻肺模型制備

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5d，隨機(jī)分為正常組、模型組、尺澤組，每組7只。除正常外，其余兩組均采用LPS氣管內(nèi)滴注+煙熏進(jìn)行造模[8]，造模方法：大鼠分別于造模第1d、第35d，麻醉，固定于仰臥懸吊位，開口器張開口腔，拉出舌頭，在探燈下，采用自制氣管插管套針，氣管內(nèi)滴注1mg/mL的LPS溶液，0.2mg/200ul/鼠，滴注后休息6d，次日將大鼠置于體積0.18m3煙熏缸中進(jìn)行煙熏(10支香煙，點(diǎn)燃放入熏煙箱內(nèi)，關(guān)閉煙熏箱)，30mim/次/d，連續(xù)3w，第2次滴注后，休息6d，繼續(xù)煙熏(15支香煙)3w。造模共8w，正常對照組大鼠于相同時(shí)間點(diǎn)暴露于空氣中。

2 分組干預(yù)

于造模第6w開始，尺澤組進(jìn)行干預(yù)治療。大鼠以特制黑色彈性鼠套固定，輕撫至安靜，拉出大鼠前肢，定位尺澤穴[9]，針尖沿前肢肺經(jīng)方向，微斜刺(75℃)進(jìn)針2-3mm，注射生理鹽水0.1mL/鼠，1次/1d，左右穴位每日輪換，連續(xù)3w。模型組大鼠每日同等固定1min。

3 樣本采集及觀察指標(biāo)

干預(yù)結(jié)束次日，大鼠麻醉，腹主動脈采血(盡量采盡血液)、離心，取血清；打開胸腔，暴露肺、氣管，拍照；取氣管及右肺第一葉固定位置肺組織1塊，4%多聚甲醛固定，包埋、切片、光鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)；另取1塊肺組織，按1：9比例加入生理鹽水，冰浴勻漿，稀釋成不同比例，按南京建成試劑盒說明書檢測血清、肺組織勻漿SOD活力、MDA水平。

4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié) 果

1 各組大鼠氣管、肺組織外觀形態(tài)

(見圖1)，從外觀看：正常組大鼠氣管外觀清白透亮，觸之韌性好；模型組大鼠氣管外觀蒼白渾濁，見有較多粘液，觸之質(zhì)軟爛；與模型組相比，尺澤組大鼠氣管外觀較透亮，顏色較鮮白，觸之韌性較好；正常組大鼠肺顏色粉嫩，質(zhì)地柔軟，模型組大鼠肺顏色蒼白，組織明顯皺縮塌陷，質(zhì)地較僵硬，部分呈現(xiàn)纖維化；尺澤組大鼠肺顏色鮮紅，無明顯皺縮，質(zhì)地較模型組柔軟，少部分見纖維化傾向。

圖1 各組大鼠氣管、肺典型外觀形態(tài)學(xué)照片

2 各組大鼠氣管、肺組織病理形態(tài)學(xué)

(見圖2)正常組大鼠氣管黏膜上皮完整，管腔內(nèi)無脫落細(xì)胞，間質(zhì)內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤；與正常組相比，模型組大鼠氣管黏膜上皮細(xì)胞損傷，纖毛粘連、脫落，管壁充血水腫，腺體增生肥大。與模型組相比，尺澤組大鼠氣管壁輕微增厚，少量杯狀細(xì)胞增生，間質(zhì)內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤；正常組大鼠的肺組織肺泡大小均一，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂肺泡高度擴(kuò)張，肺泡間隔變窄甚至斷裂合成肺大皰，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤。與模型相比，尺澤組肺泡局?jǐn)U張融合程度明顯改善，局部有輕度間質(zhì)性炎癥，間質(zhì)增生，毛細(xì)血管增粗，少量炎癥細(xì)胞浸潤；與正常組相比，模型組支氣管肺內(nèi)出現(xiàn)以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管壁杯狀細(xì)胞數(shù)目增多，腺體增生肥大；與模型組相比，尺澤組支氣管壁輕微增厚，少量杯狀細(xì)胞增生。

圖2 各組大鼠氣管、肺組織病理圖

3 各組大鼠血清、肺組織SOD、MDA

(見表1)與正常組比，模型組血清、肺組織SOD活力降低(血清SOD活力，P<0.05；肺組織SOD活力，P=0.1)；與模型組比，尺澤組血清、肺組織SOD活力升高(血清SOD活力，P<0.05；肺組織勻漿SOD活力，P=0.1)；與正常組比，模型組血清、肺組織MDA含量均有升高的趨勢，但未有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與模型組比，尺澤組肺組織MDA含量明顯降低(肺組織MDA含量，P<0.05)。

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠血清、肺勻漿液中的SOD活力和MDA含量

討 論

慢阻肺在中醫(yī)學(xué)上屬“喘證"、“肺脹”、“痰飲”等范疇，急性期病機(jī)以“標(biāo)實(shí)”為主，穩(wěn)定期病機(jī)以“本虛”為主，病位主要在肺、脾、腎。目前中、西藥物在治療慢阻肺仍面臨著許多困難，針灸是中醫(yī)學(xué)率先走向世界的療法，被稱為“復(fù)興的體表醫(yī)學(xué)”，以其綠色健康的特色越來越受到國內(nèi)外專家的關(guān)注。

經(jīng)絡(luò)學(xué)說是針灸發(fā)揮作用的理論基礎(chǔ)，經(jīng)絡(luò)是以十二正經(jīng)為主，運(yùn)行氣血，溝通人體表里內(nèi)外的通道。《靈柩·海論》曰：“夫十二經(jīng)脈者，內(nèi)屬于臟腑，外絡(luò)于肢節(jié)”，表明經(jīng)絡(luò)和臟腑之間存在雙向聯(lián)系，“經(jīng)脈-臟腑”功能相關(guān)[10]。手太陰肺經(jīng)循行 “屬肺，絡(luò)大腸”，《靈樞·經(jīng)脈》記載手太陰肺經(jīng)的“是動則病”為“肺脹滿、膨膨而喘咳”，明確提出肺經(jīng)主治 “肺脹”、“喘”、“咳”這三種慢阻肺的典型癥狀。尺澤為手太陰肺經(jīng)合穴，《難經(jīng)·六十八》道：“合主逆氣而泄”，《針灸甲乙經(jīng)》中提到“主咳逆上氣……咳嗽、唾濁、氣膈、善嘔”表明尺澤穴可治療肺部相關(guān)疾病。研究發(fā)現(xiàn)：針灸肺經(jīng)穴位對慢阻肺有一定的輔助作用[11,12]。

LPS誘導(dǎo)聯(lián)合煙熏是經(jīng)典的慢阻肺動物造模方法，該方法耗時(shí)較長，但是經(jīng)氣道、肺組織病理檢測結(jié)果提示造模較成功，且該模型更能進(jìn)一步模擬疾病的發(fā)生、發(fā)展的過程。本研究在造模中段進(jìn)行單純穴位注射生理鹽水干預(yù)，主要側(cè)重考察大鼠暴露于煙熏環(huán)境下，針刺對慢阻肺的防治作用。本文形態(tài)學(xué)方面的結(jié)果表明：經(jīng)過尺澤穴注射生理鹽水治療后，慢阻肺大鼠氣管、肺組織大體外觀形態(tài)及病理形態(tài)學(xué)的病變均得到減輕，說明尺澤穴確實(shí)具有一定治療慢阻肺的作用。

氧化-抗氧化失衡是慢阻肺重要的發(fā)病機(jī)制之一。正常機(jī)體內(nèi)氧化物和抗氧化物處在平衡的狀態(tài)。假如過多的外源性、內(nèi)源性氧化物消耗大量的抗氧化物，那會導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)原本平衡的氧化物和抗氧化物被打破[13]。吸煙是誘發(fā)慢阻肺的首要環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素，香煙煙霧中含有的羥自由基、一氧化氮、過氧化氫等和空氣污染顆粒物都屬于外源性氧化物。這些外源性氧化物除可對肺部和氣道直接產(chǎn)生損害，還通過不同途徑刺激氣道、肺組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，釋放各種內(nèi)源性氧化物，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起DNA損傷、蛋白質(zhì)修飾改變、脂質(zhì)過氧化等。長期的氧化負(fù)荷消耗大量內(nèi)源性抗氧化劑，進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體氧化-抗氧化失衡，促進(jìn)了慢阻肺的發(fā)病和急性加重等。許多研究發(fā)現(xiàn)：抗氧化的藥物治療，如N-乙酰半胱氨酸、氨溴索、維生素、多酚等，可在一定程度上影響慢阻肺的氣道重塑[14,15]，延緩肺功能下降等[16-18]。研究顯示：針刺(穴位注射)療法具有抗氧化應(yīng)激，減少氧自由基損傷[19]，對多種組織病變具有保護(hù)作用[20,21]。因此，本研究從氧化應(yīng)激機(jī)制的角度，探討針刺防治慢阻肺的機(jī)理。SOD屬于代謝過程中的自由基消除劑，具有阻止細(xì)胞核氧化裂解的作用。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物之一，其濃度間接反映了機(jī)體受到氧自由基損害程度。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示：慢阻肺模型大鼠血清、肺組織SOD活力下降、MDA含量上升，存在明顯的氧化-抗氧化失衡，尺澤穴位注射能夠在一定程度糾正這種失衡狀態(tài)，表現(xiàn)在干預(yù)后慢阻肺大鼠的血清、肺SOD活力升高，MDA含量降低。表明尺澤穴位注射治療慢阻肺的作用機(jī)制可能與糾正氧化-抗氧化失衡有關(guān)。

慢阻肺的發(fā)病機(jī)制，除了公認(rèn)的慢性炎癥、氧化-抗氧化失衡及蛋白酶-抗蛋白酶失衡這三種學(xué)說[3]，還包括基因易感-環(huán)境相互作用[22]、肺部和腸道微生物群落失衡[23]、自身免疫疾病[24]、損傷與修復(fù)異常[25]等新學(xué)說。其典型的病理學(xué)特征為：終末細(xì)支氣管和過度細(xì)支氣管的數(shù)量減少、肺氣腫、肺部血管的破壞[26]。我們后續(xù)將從觀察肺功能、血氧飽和度等多方面，繼續(xù)考察尺澤穴位注射防治慢阻肺的作用，并從抗炎、糾正蛋白酶-抗蛋白酶失衡、調(diào)節(jié)免疫功能等方面探討其機(jī)理，為臨床針灸治療慢阻肺提供依據(jù)。