急性胰腺炎患者外周血淋巴細(xì)胞亞群的改變及其與自噬、凋亡的關(guān)系①

潘 靜 覃月秋 梁運(yùn)軒 宋嗣恩 季 科 徐晨陽(yáng) 楊復(fù)鏘 尹毅霞 王 超

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，百色 533000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見(jiàn)的急腹癥，發(fā)病率逐年升高，約20%～30%AP患者為以全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能衰竭為主要特點(diǎn)的重癥AP(SAP)，并發(fā)感染及膿毒癥，提高AP患者的死亡率。研究表明，AP患者機(jī)體免疫功能紊亂，表現(xiàn)為早期機(jī)體免疫反應(yīng)過(guò)激及后期機(jī)體免疫抑制，而淋巴細(xì)胞亞群減少是AP患者機(jī)體免疫功能受損的重要原因，但具體機(jī)制尚不明確[1-3]。研究表明AP患者機(jī)體淋巴細(xì)胞自噬、凋亡異常可能是導(dǎo)致淋巴細(xì)胞改變的重要原因之一[4,5]。自噬對(duì)機(jī)體的調(diào)節(jié)作用具有雙面性，正常情況下自噬可以清除、降解多余或損壞的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，維持細(xì)胞正常功能。但在炎癥及異常氧化應(yīng)激狀態(tài)下，自噬被異常激活，過(guò)度自噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)是自噬相關(guān)基因Atg8的同源蛋白，是自噬信號(hào)通路中的主要調(diào)節(jié)蛋白之一，其水平升高直接反映自噬系統(tǒng)的異常激活[6,7]。在細(xì)胞凋亡即Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡過(guò)程中，體內(nèi)的衰老細(xì)胞及異常細(xì)胞被機(jī)體清除，對(duì)多種細(xì)胞功能的維持具有重要作用。凋亡相關(guān)因子半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶3(cysteinylaspartate specific proteinase，Caspase-3)是調(diào)控細(xì)胞凋亡的最重要因子，參與細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的殺傷過(guò)程，是細(xì)胞凋亡的終末段端剪切酶。研究認(rèn)為，LC3、Caspase-3水平升高提示自噬、凋亡系統(tǒng)異常激活，與AP發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6,8,9]。本研究對(duì)AP患者淋巴細(xì)胞亞群、LC3、Caspase-3水平及自噬率、凋亡率進(jìn)行測(cè)定，初步探討其淋巴細(xì)胞亞群的改變及其與自噬、凋亡的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對(duì)象 收集2017年1月至2018年12月我院收治診斷的AP患者73例，其中MAP 25例，男性15例，女性10例，平均年齡(48.56±14.16)歲；MSAP 25例，男性14例，女性11例，平均年齡(48.60±12.65)歲；SAP 23例，男性15例，女性8例，平均年齡(49.52±16.47)歲；選擇同期健康志愿者25例作為對(duì)照組，男性12例，女性13例，平均年齡(44.32±4.99)歲。記錄AP患者年齡、性別、影像學(xué)資料、APACHE-Ⅱ評(píng)分等信息。AP各組與對(duì)照組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AP診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)2013 年制訂的《中國(guó)急性胰腺炎診治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]。入選患者均無(wú)腫瘤、肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病、自身免疫性疾病等疾病，無(wú)妊娠或哺乳期婦女?；颊呷朐?4 h內(nèi)采集外周血。

1.1.2試劑與儀器 淋巴細(xì)胞亞群4色直接免疫熒光標(biāo)記抗體為FITC標(biāo)記的CD3抗體(85-11-0037-42)、APC標(biāo)記的CD8 抗體(85-17-0086-42)、Per CP標(biāo)記的CD19抗體(85-45-0199-42)、PE標(biāo)記的CD4抗體(85-12-0047-42)，購(gòu)自eBioscience公司；淋巴細(xì)胞凋亡FITC Annexin V Apoptosis Detection KitⅠ(Annexin-V FITC/PI)熒光雙染試劑、自噬試劑Autophagy Assay Kit、溶血素均購(gòu)自美國(guó)BD公司；人LC3(m1062954.96)試劑檢測(cè)盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；人Caspase-3(CSB-E08856h-96T)試劑檢測(cè)盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自上海碧云天公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2方法

1.2.1淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 取EDTA抗凝外周血100 μl，分別加入5 μl CD3 FITC/CD8 APC/CD19Per CP/CD4PE，避光室溫孵育15 min；加入1∶9 稀釋的紅細(xì)胞裂解液2 ml，輕微振蕩混勻，避光靜置15 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌1次，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μl PBS重懸細(xì)胞，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.2淋巴細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106～ 5×106個(gè)/ml；加入Annexin-V FITC、PI各5 μl，避光孵育15 min，加入1×buffer 400 μl重懸細(xì)胞，1 h內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.2.3淋巴細(xì)胞自噬率檢測(cè) 淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，用1×Wash buffer清洗細(xì)胞1次，離心棄上清；加入適量的1×Wash buffer重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/ml；加入MDC Stain 100 μl 輕輕混勻，37℃避光孵育15 min，加入Collection buffer 400 μl重懸細(xì)胞，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4血清LC3、Caspase-3水平檢測(cè) ELISA試劑盒檢測(cè)血清LC3、Caspase-3水平，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求解回歸方程，根據(jù)樣品吸光度值及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品細(xì)胞因子濃度。

2 結(jié)果

2.1外周血T淋巴細(xì)胞亞群及CD19+B淋巴細(xì)胞改變 SAP組、MSAP組CD3+T淋巴細(xì)胞比率、CD4+T淋巴細(xì)胞比率、CD19+B淋巴細(xì)胞比率均較對(duì)照組、MAP組下降(P<0.05)，SAP組較MSAP組下降(P<0.05)，MAP組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AP各組CD4+/CD8+比值均較對(duì)照組下降(P<0.05)，SAP組較MSAP、MAP組下降(P<0.05)，MSAP組較MAP組下降(P<0.05)。AP各組CD8+T淋巴細(xì)胞比率與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 外周血淋巴細(xì)胞亞群Tab.1 Lymphocyte subsets in peripheral

2.2外周血淋巴細(xì)胞自噬、凋亡 SAP患者淋巴細(xì)胞自噬率較MSAP、MAP組及對(duì)照組升高(P<0.05)，MSAP組較MAP組、對(duì)照組升高(P<0.05)，MAP組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表2、圖1)。 以二維散點(diǎn)圖記錄淋巴細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示對(duì)照組外周血中有少量淋巴細(xì)胞凋亡，MAP組外周血淋巴細(xì)胞凋亡與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，SAP組外周血淋巴細(xì)胞凋亡較對(duì)照組及MAP、MSAP組升高(P<0.05)，MSAP組較MAP及對(duì)照組升高(P<0.05，表2、圖2)。

表2 外周血淋巴細(xì)胞自噬率及凋亡率Tab.2 Lymphocytes autophagy and apoptosis rates in peripheral blood

圖1 外周血淋巴細(xì)胞自噬情況Fig.1 Autophagy of lymphocytes in peripheral blood

圖2 外周血淋巴細(xì)胞凋亡情況Fig.2 Apoptosis of lymphocytes in peripheral blood

2.3血清LC3、Caspase-3水平 SAP患者入院24 h血清LC3水平較MSAP、MAP組及對(duì)照組升高(P<0.05)，MSAP組較MAP組及對(duì)照組升高(P<0.05)，MAP組與照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。血清Caspase-3水平較MSAP、MAP及對(duì)照組升高(P<0.05)，MSAP較MAP及對(duì)照組升高(P<0.05)，MAP組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖3 血清LC3、Caspase-3水平Fig.3 Serum of LC3 and Caspase-3 levelsNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs MAP group;△.P<0.05 vs MSAP group.

2.4外周血LC3、Caspase-3水平與淋巴細(xì)胞自噬率、凋亡率及CD4+T細(xì)胞比率、CD4+/CD8+比值的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MSAP、SAP患者入院24 h外周血 LC3水平與淋巴細(xì)胞自噬率呈正相關(guān)(P<0.05)。LC3水平與CD4+T細(xì)胞比率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，LC3水平與CD4+/CD8+比值呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，隨血清LC3水平升高，淋巴細(xì)胞自噬率升高，而CD4+T細(xì)胞比率、CD4+/CD8+比值降低(圖4)。MSAP、SAP患者入院24 h外周血Caspase-3水平與淋巴細(xì)胞凋亡率呈正相關(guān)(P<0.05)。Caspase-3水平與CD4+T細(xì)胞比率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)；Caspase-3水平與CD4+/CD8+比值呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。隨著血清Caspase-3水平升高，淋巴細(xì)胞凋亡率升高，而CD4+T細(xì)胞比率、CD4+/CD8+比值降低(圖5)。

圖4 外周血LC3水平與淋巴細(xì)胞自噬率以及CD4+ T細(xì)胞比率、CD4+/CD8+比值的相關(guān)性Fig.4 Correlation between level of LC3 with autophagy rate of lymphocyte,CD4+ T cell ratio and CD4+/CD8+ ratio in peripheral blood

圖5 外周血Caspase-3水平與淋巴細(xì)胞凋亡率、CD4+ T細(xì)胞比率、CD4+/CD8+比值的相關(guān)性Fig.5 Correlation between level of Caspase-3 with apoptosis rate of lymphocytes,CD4+ T cell ratio and CD4+/CD8+ ratio in peripheral blood

2.5外周血LC3、Caspase-3水平與CD19+B淋巴細(xì)胞比率的相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MSAP、SAP患者入院24 h外周血LC3、Caspase-3水平與CD19+B淋巴細(xì)胞比率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，隨血清LC3、Caspase-3水平升高，CD19+B淋巴細(xì)胞比率降低(圖6)。

圖6 外周血LC3、Caspase-3水平與CD19+ B淋巴細(xì)胞比率的相關(guān)性Fig.6 Correlation between levels of LC3 and Caspase-3 with CD19+ B lymphocytes ratio in periphe-ral blood

3 討論

淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)中最重要的細(xì)胞群之一，維持機(jī)體正常免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞參與AP炎癥反應(yīng)，通過(guò)對(duì)其亞群的檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞亞群的改變與AP病情發(fā)展密切相關(guān)[11-13]。研究表明，AP患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群明顯減少，主要是CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞的減少及CD4+/CD8+比值下降，上述變化與機(jī)體免疫抑制和繼發(fā)感染密切相關(guān)[14,15]。CD19代表外周血總B淋巴細(xì)胞，在機(jī)體體液免疫調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮重要作用，檢測(cè)其表達(dá)有助于評(píng)估AP患者機(jī)體B淋巴細(xì)胞活性情況及機(jī)體體液免疫功能[16]。Ueda等[17]研究發(fā)現(xiàn)，SAP患者早期存在CD19+B淋巴細(xì)胞減少，說(shuō)明SAP患者體液免疫亦受到損害。本研究顯示，SAP組、MSAP組CD3+T淋巴細(xì)胞比率、CD4+T淋巴細(xì)胞比率、CD19+B淋巴細(xì)胞比率均較對(duì)照組、MAP組下降，SAP組較MSAP組下降；MAP組較對(duì)照組僅輕度下降；AP各組CD4+/CD8+比值均較對(duì)照組下降，SAP組較MSAP、MAP組下降，MSAP組較MAP組下降。提示MSAP患者機(jī)體存在免疫功能受損，隨著病情進(jìn)一步發(fā)展為SAP時(shí)，各淋巴細(xì)胞亞群比率及CD4+/CD8+比值進(jìn)一步降低，細(xì)胞免疫及體液免疫功能損害進(jìn)一步加重，與既往研究結(jié)論一致。

目前，AP患者外周血淋巴細(xì)胞亞群減少的發(fā)生機(jī)制尚未明確，淋巴細(xì)胞自噬、凋亡異?？赡苁菍?dǎo)致其改變的重要原因之一[4,5]。研究認(rèn)為，低水平自噬對(duì)維持淋巴細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用，但在炎癥及各種氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，過(guò)度自噬可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18，19]。另有研究報(bào)道SAP患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞大量凋亡，淋巴細(xì)胞亞群減少，機(jī)體出現(xiàn)免疫功能障礙，提高感染等并發(fā)癥發(fā)生率，提示淋巴細(xì)胞凋亡與AP患者免疫抑制密切相關(guān)[9,20]。因此，正常自噬、凋亡對(duì)維持機(jī)體淋巴細(xì)胞數(shù)目在正常水平發(fā)揮重要作用。本研究檢測(cè)AP患者及對(duì)照組血清LC3、Caspase-3水平、淋巴細(xì)胞自噬率及凋亡率，結(jié)果顯示SAP患者血清LC3、Caspase-3水平、淋巴細(xì)胞自噬率及凋亡率較對(duì)照組、MAP組及MSAP組升高，MSAP組較MAP及對(duì)照組升高，而MAP組較對(duì)照組僅輕度升高，與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示在MSAP及SAP中存在LC3、Caspase-3水平異常升高，自噬率、凋亡率提高，淋巴細(xì)胞過(guò)度自噬及凋亡導(dǎo)致機(jī)體淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，免疫功能受損，加快AP進(jìn)展。

為進(jìn)一步探討淋巴細(xì)胞亞群改變與自噬、凋亡的關(guān)系，課題組將LC3、Caspase-3表達(dá)水平與淋巴細(xì)胞自噬率、凋亡率及CD4+T淋巴細(xì)胞比率、CD4+/CD8+比值、CD19+B淋巴細(xì)胞比率分別進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，MSAP及SAP組LC3、Caspase-3水平與CD4+T淋巴細(xì)胞比率、CD4+/CD8+比值、CD19+B淋巴細(xì)胞比率均呈顯著負(fù)相關(guān)，隨LC3、Caspase-3水平升高，CD4+T淋巴細(xì)胞比率、CD4+/CD8+比值、CD19+B淋巴細(xì)胞比率下降。提示MSAP、SAP患者LC3、Caspase-3表達(dá)上升，而作為自噬及凋亡過(guò)程中最重要的調(diào)控蛋白，二者表達(dá)升高可導(dǎo)致自噬、凋亡過(guò)度激活，淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，CD4+/CD8+比值、CD19+B淋巴細(xì)胞比率下降，機(jī)體免疫功能受損，病情加重。因此，抑制LC3、Caspase-3表達(dá)，從而抑制AP患者異常激活的自噬與凋亡可改善AP患者機(jī)體免疫功能，緩解患者病情。