探究miR-27與IL-10在晚期乳腺癌患者治療前后的表達及臨床意義①

呂慶福 過兆基 姜 敏

(蘇州大學附屬第一醫(yī)院普外科,蘇州 215006)

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤，全球癌癥統(tǒng)計顯示，2018年全球乳腺癌新增女性患者208.9萬例，占所有女性癌癥發(fā)病率的24.22%，而因乳腺癌死亡的女性患者高達62.67萬例，占所有女性癌癥死亡率的15.03%，如此高的發(fā)病率與死亡率給女性的生活質(zhì)量與健康安全帶來極大威脅[1]。目前臨床上關(guān)于乳腺癌的治療方案主要以手術(shù)治療為主，但多數(shù)患者入院就診時病程已達中晚期，錯過了最佳治療時機，臨床上需采用化療等方案進行治療[2]。雖然化療在改善乳腺癌患者生存與預(yù)后方面具有顯著效果，但臨床上關(guān)于晚期乳腺癌患者化療后療效評估的指標較少[3]。目前臨床上主要通過影像學檢測評估患者病情，但影像學檢測對患者身體具有一定損害，相對于影像學檢測，血清學檢測具有費用低、時間短的特點[4]。因此，尋找出一種特異度與靈敏度較高的血清學指標對患者預(yù)后的預(yù)測十分關(guān)鍵。

近年來miRNA受到眾多學者關(guān)注，其作為一類長度約為22 nt的非編碼短鏈RNA，主要作用是通過對其下游靶基因mRNA 3′端非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTR)進行完全或不完全結(jié)合互補從而影響mRNA的穩(wěn)定性或抑制其翻譯，起到調(diào)控蛋白表達的作用[5-7]。研究顯示，miRNA可調(diào)節(jié)人體中大部分的基因轉(zhuǎn)錄，在細胞生長、增殖、凋亡過程中具有重要作用[8]。有研究報道m(xù)iR-27在乳腺癌中存在差異表達，有望成為乳腺癌的潛在診斷指標[9]。IL-10作為一種抑炎因子，其抑制作用在多種細胞中皆有所效果，此類因子的主要功能是抑制由特異與非特異免疫反應(yīng)引起的組織損傷，增強患者免疫系統(tǒng)功能，具有“清道夫”的作用[10]。然而關(guān)于miR-27與IL-10能否作為晚期乳腺癌患者療效的預(yù)測指標尚不明確。本研究探究了miR-27與IL-10在晚期乳腺癌患者治療前后的表達及臨床意義，為臨床療效觀察提供參考。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1患者臨床資料 收集2014年5月～2015年9月于本院治療的晚期乳腺癌患者60例作為本次觀察組，另收集同期健康志愿者50例作為對照組，其中對照組志愿者年齡(50.2±7.2)歲，觀察組患者年齡(49.0±6.2)歲，臨床分期Ⅲ期18例，Ⅳ期42例；浸潤性導(dǎo)管癌32例，浸潤性小葉癌14例，髓樣癌9例，硬癌5例；TNM分期Ⅱb期40例，Ⅲa期12例，Ⅲb期8例；激素受體ER+/PR+33例，ER-/PR-27例，兩組患者年齡無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，具有可比性。納入標準：所有患者均通過病理及免疫組化檢測確診為乳腺癌；患者病灶可被測量；患者預(yù)計生存時間≥3個月；患者臨床資料齊全，配合治療與隨訪。排除標準：男性患者；患者存在先天性心、腎、肝、肺功能缺陷；患者存在免疫性缺陷疾病，不配合治療；患者治療前存在嚴重感染、創(chuàng)傷；患者合并其他惡性腫瘤。

1.1.2藥物與試劑 多西他賽(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)；吡柔比星(深圳萬樂藥業(yè)有限公司)；環(huán)磷酰胺(baxter oncology GmbH，進口藥品注冊證號：H20160467)；地塞米松(上海上藥信誼藥廠有限公司)；托烷司瓊(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，奧美拉唑(常州四藥制藥有限公司)；EasyPure miRNA Kit、TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix(北京TransGen Biotech公司，ER601-01，AQ202-01)；IL-10 ELISA試劑盒(中國上海Beyotime Biotechnology公司，PI528)。

1.2方法

1.2.1治療方案 患者治療前3 d口服地塞米松藥物5 mg，1次/d，化療前30 min采用托烷司瓊與奧美拉唑治療，托烷司瓊5 mg，1次/d，奧美拉唑20 mg，2次/d，口服，具體化療方案如下：第1天，靜脈注射多西他賽75 mg/m2，環(huán)磷酰胺600 mg/m2，吡柔比星40 mg/m2，3周為1個療程，治療2個療程后評估患者臨床療效。

1.2.2樣本收集 收集觀察組患者治療前后及健康志愿者空腹外周血靜脈5 ml，靜置30 min后，以3 000 r/min 離心10 min，收集上清，即刻進行后續(xù)實驗。

1.2.3指標檢測

1.2.3.1qRT-PCR檢測miR-27 試劑盒提取總RNA，紫外分光光度儀與瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA純度、濃度與完整性。按照試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴增，PCR反應(yīng)體系：cDNA 1 μl，上下游引物各0.4 μl，2×TransTaq?Tip Green qPCR SuperMix 10 μl，Passive Reference Dye(50×)0.4 μl，ddH2O補全體系至20 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，共進行40個循環(huán)。每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。本研究以U6為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt對本次數(shù)據(jù)進行分析。miR-27 F:5′-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3′，R:5′-AGGGCTTAGCTGCTTGTGA-GCA-3′，U6 F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3.2EILSA檢測IL-10 將收集到的血清分別加入50 μl不同濃度的標準品溶液并置于空白微孔；空白對照孔加入50 μl蒸餾水和50 μl抗體；其余微孔中先加入樣品40 μl，再加入生物素標記的抗體10 μl。封板后37℃溫育30 min，洗板時每孔洗滌液保證滿而不溢靜置30 s棄去洗滌液，拍干，重復(fù)5次，各孔加入50 μl酶標溶液，再次封板，37℃溫育60 min，洗板共5次，最后1次使用吸水紙徹底拍干，加入辣根過氧化物酶標記(100 μl/孔)后封板，37℃下避光溫育15 min，以100 μl/孔加入顯色底物TMB，室溫避光孵育20 min，最后加入終止液(50 μl/孔)，15 min內(nèi)酶標儀檢測，測定450 nm處最大吸收波長。實驗設(shè)置3組復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.2.4患者生存隨訪 對患者進行為期3年的生存隨訪，隨訪方式采用電話與門診復(fù)查的方式進行，隨訪時間為每3個月1次。

1.2.5療效評估標準 患者進行為期2個療程的治療后行臨床療效評估，根據(jù)MRI與CT結(jié)果計算患者腫瘤大小變化，根據(jù)RECIST實體瘤緩解評估標準進行療效分級：完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進展(PD)[11]。

1.2.6觀察指標 主要觀察指標：比較觀察組與對照組miR-27與IL-10表達情況，觀察患者治療前后miR-27與IL-10表達變化，根據(jù)患者生存情況繪制生存曲線，根據(jù)治療前miR-27與IL-10表達中位值分為高表達組和低表達組，觀察miR-27與IL-10高、低表達在患者生存中的價值。次要觀察指標：觀察患者臨床療效，根據(jù)臨床療效將患者分為療效優(yōu)秀組與療效較差組比較兩組患者治療前miR-27與IL-10表達，繪制受試者工作(ROC)曲線，分析治療前miR-27與IL-10的表達在療效中的預(yù)測價值。

2 結(jié)果

2.1miR-27與IL-10在兩組中表達 結(jié)果表明，對照組受試者血清中miR-27表達(1.027±0.08)明顯低于觀察組患者(1.475±0.178)(t≤16.379，P<0.001)，IL-10表達(12.432±1.978)pg/ml明顯高于觀察組患者(7.716±1.205)pg/ml(t≤15.356，P<0.001)。見圖1。

圖1 miR-27與IL-10在對照組與觀察組中的表達Fig.1 Expressions of miR-27 and IL-10 in control group and observation groupNote:***.P<0.001.

2.2觀察組患者治療后血清中miR-27與IL-10表達變化 觀察組患者治療后血清中miR-27表達(1.241±0.104)明顯低于治療前(1.475±0.178)(t=9.147，P<0.001)，IL-10表達(10.702±1.566)pg/ml明顯高于治療前(7.716±1.205)pg/ml(t=11.561，P<0.001)，見圖2。

圖2 觀察組患者治療前后血清中miR-27與IL-10表達比較Fig.2 Comparison of expressions of miR-27 and IL-10 in serum of patients in observation group before and after treatmentNote:***.P<0.001.

2.3治療前miR-27與IL-10表達在臨床療效中的預(yù)測價值 觀察組患者通過治療后，共有CR患者17例，PR患者21例，SD患者15例，PD患者7例，根據(jù)患者臨床療效將CR+PR患者分為療效優(yōu)秀組(EC group)(n=38)，SD+PD患者分為療效較差組(PC group)(n=22)，比較兩組患者治療前血清中miR-27與IL-10表達發(fā)現(xiàn)，療效優(yōu)秀組患者血清中miR-27表達(1.425±0.188)明顯低于療效較差組(1.562±0.120)患者(t≤3.082，P<0.003)，IL-10表達(8.001±1.171)明顯高于療效較差組(7.255±1.125)pg/ml(t≤2.509，P<0.015)。ROC曲線繪制發(fā)現(xiàn)miR-27與IL-10曲線下面積分別為0.719與0.685，存在預(yù)測價值，見表1、圖3。

圖3 治療前miR-27與IL-10表達在臨床療效中的預(yù)測價值Fig.3 Predictive values of miR-27 and IL-10 expressions in clinical efficacy before treatmentNote:*.P<0.05，**.P<0.01.

表1 ROC參數(shù)(%)Tab.1 ROC parameters(%)

2.4miR-27與IL-10在患者生存中的價值 通過對60例患者進行為期3年的隨訪，存活患者為30例，3年存活率為50%，根據(jù)miR-27與IL-10中位值將其分為高、低表達組，比較miR-27與IL-10高、低表達組患者生存情況發(fā)現(xiàn)，miR-27低表達組患者3年存活率明顯高于高表達組患者，而IL-10低表達患者3年生存率明顯低于高表達組患者(P<0.05)，見圖4。

圖4 miR-27與IL-10高、低表達與患者3年生存情況的關(guān)系Fig.4 Relationship between high and low expressions of miR-27 and IL-10 and survival of patients in 3 yearsNote:A.Total survival rate of patients in 3 years;B.Survival rate of patients in miR-27 high and low expression groups in 3 years;C.Survival rate of patients of IL-10 in high and low expression group in 3 years.

3 討論

乳腺癌作為女性常見惡性腫瘤，在2012年全球新增患者約168萬例，而死亡患者超過52萬人，并且有向年輕化發(fā)展的趨勢，嚴重威脅人們的生命健康與生活質(zhì)量[12]。臨床上關(guān)于乳腺癌的治療方案主要以手術(shù)為主，但乳腺癌發(fā)病初期較為隱匿，入院治療基本已進入中晚期，錯過了最佳治療時機，因此化療就成為這類患者治療的首選方案[13]。雖然患者通過化療后可顯著改善病情，但臨床上關(guān)于乳腺癌化療后的療效預(yù)測指標較少[14]。若能提前通過檢測相關(guān)指標來判定患者預(yù)后情況，勢必可以更好地改善患者病情。

miRNA是一類長約19-22 nt的非編碼短鏈RNA，具有高度保守性，可通過完全或不完全互補配對的方式與靶基因3′-UTRs結(jié)合，參與靶基因調(diào)控，研究顯示，miRNA與腫瘤及心血管疾病等密切相關(guān)[15,16]。miR-27是miR家族中的重要成員，也稱為miR-27a，位于染色體19p13.12，Tang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-27可作為乳腺癌進展和患者生存的預(yù)后標志物。IL-10是一類多功能的細胞因子，對細胞的生長分化起調(diào)節(jié)作用，并參與炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)[18]。Ahmad等[19]研究發(fā)現(xiàn)IL-10與浸潤性乳腺癌患者的良好預(yù)后相關(guān)，但miR-27與IL-10能否作為晚期乳腺癌患者化療療效的潛在預(yù)測指標目前尚未明確。本研究通過探究miR-27與IL-10在晚期乳腺癌患者中的表達及療效預(yù)測價值，為臨床醫(yī)生提供潛在觀察指標。

本研究首先檢測了患者血清中miR-27與IL-10的表達。組織樣本收集對患者存在入侵性傷害，而本研究通過檢測患者血清中目的基因表達，對患者損傷較小。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)觀察組患者血清中miR-27表達明顯高于對照組，而IL-10的表達明顯低于對照組，提示miR-27與IL-10在晚期乳腺癌患者中存在差異表達，與既往的研究結(jié)果相符[20，21]。進一步檢測了患者化療后miR-27與IL-10的表達發(fā)現(xiàn)，患者治療后miR-27表達明顯降低，IL-10的表達明顯升高，提示miR-27與IL-10有望成為乳腺癌化療后的潛在觀察指標。推測其機制可能是由于化療提升了miR-27表達，從而靶向調(diào)節(jié)IL-10表達，但具體原因尚不明確[22]。

課題組根據(jù)患者治療后的臨床療效分組進一步觀察療效優(yōu)秀組患者與療效較差組患者治療前血清中miR-27及IL-10表達發(fā)現(xiàn)，療效優(yōu)秀組患者治療前miR-27表達明顯低于療效較差組，而IL-10與其相反，說明miR-27和IL-10可能成為乳腺癌患者化療后療效的觀察指標。ROC曲線結(jié)果顯示，miR-27與IL-10曲線下面積分別為0.719、0.685，提示化療前通過觀察miR-27與IL-10的表達對療效預(yù)測存在一定價值。隨訪結(jié)果顯示患者3年生存率為50%，與國內(nèi)文獻結(jié)果相符[23]。根據(jù)患者治療后兩指標中位值將其分為高表達組和低表達組觀察各組生存情況發(fā)現(xiàn)，miR-27低表達組與IL-10高表達組患者生存率明顯高于其對應(yīng)組，提示通過觀察化療后乳腺癌患者miR-27與IL-10的表達水平對評估患者生存情況存在一定價值。

本研究還存在一定的局限性，首先，作為臨床研究，關(guān)于化療后miR-27與IL-10表達發(fā)生變化的機制尚不清楚；其次，miR-27與IL-10雖然對化療后臨床療效預(yù)測價值具有較高的敏感度，但其特異度較低，是否能通過聯(lián)合腫瘤標志物提升特異度目前尚不明確；最后，由于樣本及時間原因，并未進行5年甚至更長時間的隨訪，課題組將在今后的研究中開展基礎(chǔ)實驗，聯(lián)合更多臨床指標，延長隨訪時間，補充本次研究結(jié)果。

綜上所述，晚期乳腺癌患者治療前后的miR-27與IL-10可作為晚期乳腺癌患臨床療效與生存的觀察指標。