TBX3通過Wnt/β-catenin信號通路影響胃癌細胞增殖、侵襲和遷移①

王紅山 解寒冰 余江濤

(鄭州人民醫(yī)院普通外科,鄭州 450000)

隨著生活水平的提高，胃癌發(fā)病率呈上升趨勢，雖然醫(yī)療水平不斷提高，但胃癌的死亡率仍居高不下，對患者的健康造成嚴重威脅。除手術(shù)治療、放化療等傳統(tǒng)療法外，分子靶向治療逐漸受到重視。胃癌的發(fā)生機制復雜，發(fā)病過程中伴隨癌基因的激活或抑癌基因的失活，以及各組信號通路的紊亂。TBX3是T-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，可通過Wnt等信號通路發(fā)揮作用[1]。TBX3在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用，在多種惡性腫瘤中高表達，扮演癌基因角色，參與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[2]。TBX3可通過Wnt信號通路發(fā)揮作用，Wnt信號通路在胃癌的增殖、侵襲及遷移過程中發(fā)揮重要作用[3，4]。因此本文對胃癌細胞中TBX3表達及沉默TBX3表達對胃癌細胞增殖、侵襲、遷移及Wnt/β-catenin信號通路的影響進行研究，探討TBX3在胃癌中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 胃癌細胞系MGC-803、正常胃黏膜細胞系GES-1購自美國ATCC公司。

1.1.2試劑和儀器 Lipofectamine 2000試劑盒(美國Santa Cruz公司)，TBX3 siRNA及陰性對照siRNA(德國Qigen公司)，TBX3的shRNA引物序列：F：5′-CCGGGCTGATGACTGTCGTTATAAACTCGAGTTTATAACGACAGTCATCAGCTTTTTG-3′，R：5′-AATTCAAAAAGCTGATGACTGTCGTTATAAACTCG-AGTTTATAACGACAGTCATCAGC-3′，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、Trizol試劑、結(jié)晶紫、ECL化學發(fā)光試劑盒(美國Sigma公司)，CCK8試劑、Wnt/β-catenin信號通路抑制劑XAV939、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國BPB公司)，兔抗人TBX3單克隆抗體、兔抗人神經(jīng)-鈣黏蛋白(N-cadherin)單克隆抗體、兔抗人上皮-鈣黏蛋白(E-cadherin)單克隆抗體、兔抗人Snail單克隆抗體、兔抗人Wnt3α單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人C-myc單克隆抗體(美國Invitrogen公司)。Transwell小室(美國TaKaRa公司)，酶標儀及流式細胞儀(美國Bio-Rad公司)，PCR擴增儀(美國Gibco公司)等。

1.2方法

1.2.1Western blot檢測MGC-803細胞和GES-1細胞中TBX3蛋白水平 取對數(shù)生長的MGC-803細胞和GES-1細胞，加入RIPA裂解液裂解細胞，12 000 g 離心15 min，取上清，Bradford法測定MGC-803細胞和GES-1細胞蛋白濃度，取30 μg蛋白加入SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜、脫脂牛奶封閉，加入兔抗人TBX3單克隆抗體(1∶1 000)孵育過夜，加入二抗(1∶3 000)孵育1 h，經(jīng)顯影、曝光、掃描圖像，Image J分析蛋白條帶灰度值。每組設(shè)7個復孔，以β-actin為內(nèi)參。TBX3蛋白水平以TBX3蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

1.2.2RT-PCR測定MGC-803細胞和GES-1細胞中TBX3 mRNA水平 取MGC-803細胞和GES-1細胞細胞加入Trizol裂解液，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR法測定TBX3 mRNA水平TBX3 F：5′-TTTGAAGACCATGGAGCCCG-3′，R：5′-ACATTCGCCTTCCCGACTTG-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95℃ 10 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共38個循環(huán)。每組設(shè)7個復孔。以β-actin為內(nèi)參。TBX3 mRNA水平以2-ΔΔCt表示。

1.2.3細胞分組和轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期MGC-803細胞分為空白對照組(BC組)、陰性對照組(NC組)、siR-TBX3組和siR-TBX3+XAV939組，接種于6孔板(5×105個/孔)，待細胞生長至85%以上融合時進行轉(zhuǎn)染，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行。NC組細胞轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA，siR-TBX3組細胞轉(zhuǎn)染TBX3-siRNAsiR-TBX3+XAV939，細胞轉(zhuǎn)染TBX3-siRNA的同時加入Wnt/β-catenin信號通路抑制劑XAV939(4 μmol/L)，BC組細胞不轉(zhuǎn)染[5]。轉(zhuǎn)染48 h后采用Western blot和RT-PCR測定細胞中TBX3蛋白和mRNA水平，方法同1.2.1和1.2.2。

1.2.4CCK8測定MGC-803細胞增殖 將轉(zhuǎn)染48 h 后各組MGC-803細胞接種于96孔板(1×103個/孔)，分別于培養(yǎng)24、48、72 h加入10 μl CCK8，每組設(shè)7個復孔，加入CCK8后培養(yǎng)2 h，酶標儀測定各孔吸光度。

1.2.5Transwell實驗檢測MGC-803細胞侵襲和遷移能力 將轉(zhuǎn)染48 h后的MGC-803細胞用無血清培養(yǎng)基重懸，稀釋至5×105個/ml，取200 μl加入Transwell小室上室，下室加入含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h取出小室，多聚甲醛固定30 min，棉簽擦去上室細胞，結(jié)晶紫染色30 min，鏡下拍照計算遷移細胞數(shù)。侵襲實驗在實驗前用100 μl Matrigel膠包被小室上室，其余步驟與遷移實驗相同。

1.2.6Western blot檢測MGC-803細胞N-cadherin、E-cadherin、Snail、Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平 取各組轉(zhuǎn)染48 h MGC-803細胞加入蛋白裂解液提取總蛋白，Western blot測定MGC-803細胞各蛋白水平。方法同1.2.1。

2 結(jié)果

2.1胃癌細胞MGC-803中TBX3表達情況 胃癌細胞MGC-803中TBX3蛋白和mRNA水平高于正常胃黏膜細胞GES-1(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 Western blot測定 MGC-803細胞和GES-1細胞中TBX3蛋白水平Fig.1 Western blot analysis of TBX3 protein levels in MGC-803 cells and GES-1 cells

表1 MGC-803細胞和GES-1細胞中TBX3蛋白及mRNA水平Tab.1 TBX3 protein and mRNA levels in MGC-803 cells and GES-1

2.2轉(zhuǎn)染后各組MGC-803細胞中TBX3蛋白和mRNA水平比較 與BC組和NC組相比，siR-TBX3組MGC-803細胞中TBX3蛋白和mRNA水平降低(P<0.05)，BC組和NC組MGC-803細胞中TBX3蛋白和mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖2。

圖2 Western blot測定MGC-803細胞和GES-1細胞中TBX3蛋白水平Fig.2 Western blot analysis of TBX3 protein levels in MGC-803 cells and GES-1 cells

表2 各組MGC-803細胞中TBX3蛋白和mRNA水平Tab.2 TBX3 protein and mRNA levels in each group of MGC-803

2.3各組MGC-803細胞增殖能力比較 24 h時，各組MGC-803細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；42、72 h時，與BC組和NC組相比，siR-TBX3組和siR-TBX3+XAV939組MGC-803細胞增殖能力降低(P<0.05)，與siR-TBX3組相比，siR-TBX3+XAV939組MGC-803細胞增殖能力降低(P<0.05)，BC組和NC組MGC-803細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組MGC-803細胞增殖能力Fig.3 Proliferation ability of each group of MGC-803 cellsNote:Compared with BC group,*.P<0.05；compared with NC group,#.P<0.05；compared with siR-TBX3 group,△.P<0.05.

2.4各組MGC-803細胞侵襲和遷移能力比較 與BC組和NC組相比，siR-TBX3組和siR-TBX3+XAV939組MGC-803細胞侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)減少(P<0.05)，與siR-TBX3組相比，siR-TBX3+XAV939組MGC-803細胞侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)減少(P<0.05)，BC組和NC組MGC-803細胞侵襲細胞數(shù)和遷移細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組MGC-803細胞侵襲和遷移細胞數(shù)比較Fig.4 Comparison of number of invasion and migration cells of each group of MGC-803 cellsNote:A.BC group;B.NC group;C.siR-TBX3 group;D.siR-TBX3+XAV939 group.Compared with BC group,*.P<0.05；compared with NC group,#.P<0.05；compared with siR-TBX3 group,△.P<0.05.

2.5各組MGC-803細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化情況比較 與BC組和NC組相比，siR-TBX3組和siR-TBX3+XAV939組MGC-803細胞N-cadherin、Snail蛋白水平降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)；與siR-TBX3組相比，siR-TBX3+XAV939組MGC-803細胞N-cadherin、Snail蛋白水平降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，BC組和NC組MGC-803細胞N-cadherin、E-cadherin、Snail蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 Western blot測定各組MGC-803細胞N-cadherin、E-cadherin、Snail蛋白水平Fig.5 Western blot analysis of N-cadherin,E-cadherin and Snail protein levels in each group of MGC-803 cellsNote:A.BC group;B.NC group;C.siR-TBX3 group;D.siR-TBX3+XAV939 group.Compared with BC group,*.P<0.05；compared with NC group,#.P<0.05；compared with siR-TBX3 group,△.P<0.05.

2.6各組MGC-803細胞Wnt/β-catenin信號通路比較 與BC組和NC組相比，siR-TBX3組和siR-TBX3+XAV939組MGC-803細胞Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平降低(P<0.05)，與siR-TBX3組相比，siR-TBX3+XAV939組MGC-803細胞Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平降低(P<0.05)，BC組和NC組MGC-803細胞Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖6。

圖6 Western blot測定各組MGC-803細胞Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平Fig.6 Western blot analysis of Wnt3α，β-catenin and C-myc protein levels in each group of MGC-803 cellsNote:A.BC group;B.NC group;C.siR-TBX3 group;D.siR-TBX3+XAV939 group.Compared with BC group,*.P<0.05；compared with NC group,#.P<0.05；compared with siR-TBX3 group,△.P<0.05.

3 討論

T-box基因在多細胞生物的胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，可通過與DNA結(jié)合參與并調(diào)節(jié)胚胎組織和形態(tài)發(fā)育。TBX3是T-box家族成員之一，在胚胎發(fā)育、肝細胞和惡性腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用，TBX3缺失可誘導胚胎干細胞分化，可通過Wnt 信號通路調(diào)控肝細胞分化，TBX3通過對胚胎干細胞的調(diào)控作用促進肝臟、心臟、四肢及乳腺等發(fā)育[6]。TBX3在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用[7]。如TBX3參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，可促進非侵襲性乳腺癌向浸潤性乳腺癌進展，在腎癌組織中高表達，與腎癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，參與腎癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程，在非小細胞肺癌中高表達，與非小細胞肺癌的預(yù)后不良有關(guān)[8-11]。本文對胃癌MGC-803細胞中TBX3水平進行研究，發(fā)現(xiàn)胃癌MGC-803細胞中TBX3蛋白和mRNA水平升高，沉默TBX3表達可抑制胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移，表明TBX3可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可提高惡性腫瘤細胞的抗凋亡能力，促進腫瘤干細胞形成，降解細胞外基質(zhì)，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用，賦予惡性腫瘤細胞侵襲和遷移潛能[12,13]。N-cadherin為間質(zhì)性蛋白，E-cadherin為上皮標志蛋白，N-cadherin表達水平升高的同時E-cadherin表達下降或缺失為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標志[14,15]。Snail為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程的重要轉(zhuǎn)錄因子，可抑制E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄，降低細胞間的黏附作用，從而調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程[16]。本研究發(fā)現(xiàn)沉默胃癌細胞中TBX3可降低細胞中N-cadherin、Snail蛋白水平，上調(diào)細胞中E-cadherin蛋白水平。表明沉默TBX3可通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制胃癌細胞的侵襲和遷移。

Wnt/β-catenin信號通路為惡性腫瘤增殖、侵襲和遷移的關(guān)鍵通路，在胃癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抑制該信號通路可逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程[17]。Wnt/β-catenin信號通路關(guān)閉時，β-catenin與絲蘇氨酸蛋白激酶3、腺瘤結(jié)腸息肉蛋白和軸蛋白及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子形成降解復合物，通過誘導β-catenin泛素化修飾終止信號通路傳導，激活Wnt/β-catenin信號通路，β-catenin大量累積并轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)，與T細胞因子/淋巴增強因子形成轉(zhuǎn)錄復合物，啟動下游C-myc、CyclinD1等靶基因轉(zhuǎn)錄，并調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化基因轉(zhuǎn)錄，從而促進胃癌的增殖和侵襲遷移過程[18-20]。C-myc和腫瘤細胞的增殖關(guān)系密切，可促進細胞分裂，導致細胞無限增殖。TBX3可通過Wnt信號通路發(fā)揮作用，在S期發(fā)揮重要作用，通過C-myc調(diào)節(jié)細胞生長過程[21]。本文沉默胃癌細胞TBX3表達，可抑制細胞中Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平；給予Wnt/β-catenin信號通路抑制劑也可抑制胃癌細胞增殖、侵襲遷移，并降低細胞中N-cadherin、Snail、Wnt3α、β-catenin、C-myc蛋白水平，升高細胞中E-cadherin蛋白水平，提示沉默細胞TBX3及給予Wnt/β-catenin信號通路抑制劑均可調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，抑制胃癌細胞增殖、侵襲和遷移，抑制細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，表明沉默TBX3可能通過Wnt/β-catenin信號通路抑制胃癌細胞增殖和侵襲遷移。

綜上所述，胃癌MGC-803細胞中TBX3水平升高，沉默TBX3可通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而抑制胃癌細胞的生長和侵襲遷移，有望成為胃癌治療的潛在靶點。