匹伐他汀對(duì)高尿酸血癥大鼠血尿酸、炎癥因子、血管內(nèi)皮功能的影響①

尤 楊 戚國(guó)慶 高宏陽 楊志瑜 李 柳 趙紅亮

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)三科，石家莊 050031)

隨著生活方式的改變，高尿酸血癥的發(fā)病率不斷升高，高尿酸血癥和高血壓、高血脂、肥胖、胰島素抵抗等傳統(tǒng)心血管疾病的危險(xiǎn)因素關(guān)系密切，近來研究發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥也是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，若高尿酸血癥未得到有效控制，則增加心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，因此探討如何防治高尿酸血癥具有重要意義。高尿酸血癥和其他相關(guān)疾病的病理機(jī)制復(fù)雜，其中炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮功能損傷在高尿酸血癥引起心血管疾病中發(fā)揮重要作用，尿酸進(jìn)入平滑肌細(xì)胞可導(dǎo)致細(xì)胞增殖，激活單核細(xì)胞趨化蛋白-1(VCAM-1)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子合成增多，造成組織損傷[1]；尿酸合成過程中產(chǎn)生的超氧陰離子可滅活內(nèi)皮舒張因子一氧化氮(NO)，從而損傷內(nèi)皮功能[2]。匹伐他汀為第三代他汀類藥物，具有較強(qiáng)的降低低密度脂蛋白和膽固醇的作用，在調(diào)節(jié)血脂、抑制炎癥反應(yīng)和改善內(nèi)皮功能中發(fā)揮重要作用[3-5]。本文對(duì)匹伐他汀對(duì)高尿酸血癥大鼠血尿酸、炎癥因子、血管內(nèi)皮功能的影響進(jìn)行研究，探討匹伐他汀是否通過抑制炎癥反應(yīng)和改善內(nèi)皮功能發(fā)揮對(duì)高尿酸血癥的防治作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康、清潔級(jí)、8周齡、體質(zhì)量190～210 g、SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK(滬)2009-3。

1.1.2藥品與試劑 匹伐他汀(北京雙鸛藥業(yè)公司，批號(hào)20180621)，鹽酸乙胺丁醇(四川天臺(tái)山制藥公司，批號(hào)20181005)，酵母膏(北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20170814)，尿酸、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6、NO ELISA試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，蘇木素、伊紅染液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，SP免疫組化染色試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)，兔抗鼠血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)單克隆抗體(美國(guó)Santa-Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 將60只大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(C組)、模型組(M組)、匹伐他汀低劑量組(LP組)、匹伐他汀高劑量組(HP組)，每組15只。

1.2.2建立高尿酸血癥大鼠模型 除C組外，其他各組均建立高尿酸血癥模型，具體方法為：將鹽酸乙胺丁醇12.5 mg/(kg·d)+酵母膏15 g/(kg·d)+適量蒸餾水配制成0.8 ml溶液，1次/d，灌胃，共6周，大鼠2次空腹血尿酸≥420 μmol/L表明高尿酸血癥模型建立成功[6]。C組大鼠每d給予等量生理鹽水灌胃，共6周。

1.2.3藥物干預(yù) 在建模的同時(shí)，即從建模第1天開始，LP組大鼠和HP組大鼠分別給予低劑量和高劑量匹伐他汀治療，根據(jù)文獻(xiàn)[7，8]，LP組大鼠給予0.21 mg/(kg·d)匹伐他汀、HP組大鼠給予0.42 mg/(kg·d)匹伐他汀，將各組匹伐他汀用生理鹽水配制成2 ml溶液，灌胃，共6周。C組和M組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，共6周。

1.2.4標(biāo)本采集 用藥結(jié)束后，乙醚麻醉大鼠，摘眼球取血，將血液標(biāo)本采用高速低溫離心(3 000 r/min) 5 min，留取血清進(jìn)行血清學(xué)檢查。取血后將大鼠仰臥位固定，沿大鼠左右腋前線剪開胸腔，暴露心臟，注射器抽取甲醛溶液和10%磷酸鹽緩沖液2 ml從心尖注入，分離周圍組織，充分暴露主動(dòng)脈弓和胸主動(dòng)脈，向下鈍性分離暴露腹主動(dòng)脈，截取主動(dòng)脈2.5 cm，將其放入含10%磷酸鹽緩沖液的甲醛溶液中固定，經(jīng)石蠟包埋，用于HE染色和免疫組化染色。

1.2.5血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 血尿酸、TNF-α、IL-6、NO采用ELISA法測(cè)定，CRP采用免疫透射比濁法測(cè)定，ET-1采用放射免疫法測(cè)定。

1.2.6HE染色測(cè)定大鼠主動(dòng)脈病理學(xué)變化 將主動(dòng)脈石蠟切片脫蠟至水，放入蘇木素染液中染色7 min，蒸餾水沖洗1 min，鹽酸乙醇分色20 s，蒸餾水沖洗1 min，淡氨水返藍(lán)10 s，蒸餾水沖洗，將切片放入伊紅染液中染色5 min，蒸餾水沖洗1 min，梯度酒精脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.7免疫組化染色測(cè)定主動(dòng)脈中VCAM-1蛋白表達(dá) 將主動(dòng)脈石蠟切片脫蠟至水，枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù)，蒸餾水沖洗，加入過氧化氫孵育10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，加入一抗(1∶100)過夜孵育，加入二抗孵育2 h，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木液染核5 min，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，透明，封片，OLYMPUS BX60顯微鏡觀察染色情況，ImagePlus5.1圖像分析軟件測(cè)定陽性表達(dá)區(qū)域的積分吸光度，計(jì)算平均吸光度(積分吸光度/主動(dòng)脈橫截面積)，以平均吸光度表示VCAM-1在主動(dòng)脈中的表達(dá)強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠血尿酸水平比較 與C組比較，M組、LP組和HP組血尿酸水平升高(P<0.05)；與M組比較，LP組和HP組血尿酸水平降低(P<0.05)，HP組血尿酸降低更為顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血尿酸水平比較Tab.1 Comparison of blood uric acid levels in each group of

2.2各組血清炎癥因子水平比較 與C組比較，M組、LP組和HP組血清TNF-α、IL-6、CRP水平升高(P<0.05)；與M組比較，LP組和HP組血清TNF-α、IL-6、CRP水平降低(P<0.05)，HP組血清TNF-α、IL-6、CRP水平降低更為顯著(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平比較Tab.2 Comparison of serum TNF-α，IL-6 and CRP levels in each group of

2.3各組NO、ET-1水平比較 與C組比較，M組、LP組和HP組NO水平降低(P<0.05)，ET-1水平升高(P<0.05)；與M組比較，LP組和HP組NO水平升高(P<0.05)，ET-1水平降低(P<0.05)，其中HP組NO水平升高、ET-1水平降低更為顯著(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠NO、ET-1水平比較Tab.3 Comparison of NO and ET-1 levels in each group of

2.4各組主動(dòng)脈HE染色比較 C組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮完整，結(jié)構(gòu)正常；M組大鼠主動(dòng)脈見內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，向動(dòng)脈腔凸起；LP組和HP組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞腫脹明顯減輕，其中HP組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞腫脹減輕更為顯著。見圖1。

圖1 各組主動(dòng)脈HE染色(×400)Fig.1 HE staining of aorta in each group(×400)

2.5各組主動(dòng)脈中VCAM-1表達(dá)比較 C組大鼠主動(dòng)脈VCAM-1呈陰性；M組大鼠主動(dòng)脈VCAM-1呈陽性表達(dá)；LP組和HP組大鼠主動(dòng)脈VCAM-1表達(dá)較M組降低，其中HP組減弱更顯著。見圖2。與M組比較，LP組和HP組主動(dòng)脈VCAM-1平均吸光度值降低(P<0.05)，其中HP組主動(dòng)脈VCAM-1平均吸光度值降低更為顯著(P<0.05)。見表4。

圖2 各組主動(dòng)脈VCAM-1免疫組化染色(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of aortic VCAM-1 in each group(×400)

表4 各組大鼠主動(dòng)脈VCAM-1平均吸光度值比較Tab.4 Comparison of mean absorbance values of VCAM-1 in aorta of each group of

3 討論

高尿酸血癥可引起體內(nèi)代謝紊亂，包括糖代謝紊亂、氨基酸代謝紊亂、脂肪代謝紊亂等，高尿酸血癥引起的機(jī)體代謝紊亂是高尿酸血癥發(fā)生發(fā)展以及腎臟疾病和心腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制。他汀類藥物在高膽固醇血癥的治療以及心血管疾病發(fā)病的預(yù)防中被廣泛應(yīng)用，具有良好效果。他汀類藥物對(duì)高尿酸血癥也有防治作用，如溫淼等[9]研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可降低缺血性卒中患者高尿酸血癥發(fā)生率。匹伐他汀作為第三代他汀類藥物，是否對(duì)高尿酸血癥也有防治作用？本文對(duì)其進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥模型大鼠血尿酸水平顯著升高，匹伐他汀可顯著降低血尿酸水平，高劑量匹伐他汀降低血尿酸水平的效果優(yōu)于低劑量匹伐他汀組，表明匹伐他汀對(duì)高尿酸血癥具有防治作用。匹伐他汀降低血尿酸水平的機(jī)制尚不清楚，分析可能為：高尿酸血癥患者常存在腎臟損傷，匹伐他汀具有保護(hù)腎臟的作用，故匹伐他汀可能通過保護(hù)腎臟功能降低血尿酸水平。因篇幅有限，本研究未對(duì)匹伐他汀降低血尿酸的機(jī)制進(jìn)行探討，后續(xù)將對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)研究。

高尿酸血癥和血清炎癥因子關(guān)系密切，研究發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥患者血清炎癥細(xì)胞因子水平升高。血尿酸水平升高時(shí)，析出尿酸鹽結(jié)晶，尿酸鹽結(jié)晶在血管壁沉積，對(duì)血管內(nèi)膜造成損傷，引起血管內(nèi)膜的慢性炎癥損傷，損傷的內(nèi)膜上黏附大量單核細(xì)胞，單核細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6等炎癥因子，導(dǎo)致血清中TNF-α、IL-6水平升高；血尿酸水平升高可激活單核細(xì)胞NF-κB，單核細(xì)胞NF-κB釋放TNF-α、IL-6等炎癥因子，也導(dǎo)致血清TNF-α、IL-6等炎癥因子水平升高；尿酸鹽本身也是白細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6等炎癥因子的使動(dòng)因素[10，11]。CRP為急性相性蛋白，在巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞激活時(shí)在TNF-α、IL-6等炎癥因子刺激下，由肝細(xì)胞合成，故高尿酸血癥也可引起血清CRP水平升高[12]。血清炎癥因子水平的升高可引起血管內(nèi)膜增厚，引起動(dòng)脈硬化斑塊形成，從而導(dǎo)致心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生。匹伐他汀具有抑制炎癥反應(yīng)的作用，如Iqbal等[13]研究發(fā)現(xiàn)匹伐他汀通過抑制炎癥反應(yīng)減輕心肌損傷；Mao等[14]研究發(fā)現(xiàn)匹伐他汀通過抑制單核細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)抑制急性心肌梗死后左心室重構(gòu)；Nakagomi等[15]研究發(fā)現(xiàn)匹伐他汀可抑制血脂異?；颊唧w內(nèi)的炎癥反應(yīng)。本文對(duì)匹伐他汀對(duì)高尿酸血癥的炎癥反應(yīng)的影響進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平升高，匹伐他汀可顯著降低高尿酸血癥大鼠血清TNF-α、IL-6、CRP水平。表明匹伐他汀對(duì)高尿酸血癥患者體內(nèi)的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，匹伐他汀通過抑制高尿酸血癥的炎癥反應(yīng)改善血管功能，從而降低心腦血管疾病的發(fā)生。

血管內(nèi)皮損傷后體內(nèi)一些物質(zhì)濃度發(fā)生變化，這些可反映細(xì)胞內(nèi)皮損傷和內(nèi)皮功能的物質(zhì)稱為內(nèi)皮損傷標(biāo)志物。NO和ET為常用的內(nèi)皮損傷標(biāo)志物。NO為主要的血管舒張因子，可引起血管平滑肌松弛，導(dǎo)致血管擴(kuò)張；NO進(jìn)入血液后可抑制血小板聚集，對(duì)抗血小板激活，具有防止血栓形成的作用，NO同時(shí)具有增加血管致密性的作用[16]。ET為作用最強(qiáng)的縮血管活性多肽，具有促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用，正常情況下，血清ET水平極低，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后ET大量釋放，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增生，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[17]。高尿酸血癥可引起血管內(nèi)皮損傷；血尿酸水平升高可引起NO水平降低，ET水平升高，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成，在冠心病、高血壓等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用；高尿酸時(shí)析出的尿酸鹽結(jié)晶在血管壁沉積，損傷血管內(nèi)膜，促進(jìn)血小板黏附聚集，造成血栓形成；血尿酸鹽結(jié)晶也可導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。血管內(nèi)皮損傷時(shí)可釋放VCAM-1等細(xì)胞分子，VCAM-1為內(nèi)皮細(xì)胞活化和損傷的標(biāo)志物，正常情況下動(dòng)脈內(nèi)皮VCAM-1幾乎沒有表達(dá)，內(nèi)皮細(xì)胞活化或損傷的情況下，VCAM-1表達(dá)量顯著增加[18]。匹伐他汀具有改善血管內(nèi)皮功能的作用，如趙子粼等[19]研究發(fā)現(xiàn)匹伐他汀可改善急性冠脈綜合征血管內(nèi)皮功能；Zhao等[20]研究發(fā)現(xiàn)匹伐他汀鈣可改善高膽固醇血癥患者的內(nèi)皮功能，延緩其動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展；詹小娜等[21]研究發(fā)現(xiàn)匹伐他汀具有改善中青年高脂血癥合并頸動(dòng)脈斑塊患者血管內(nèi)皮功能的作用。本文對(duì)匹伐他汀對(duì)高尿酸血癥大鼠內(nèi)皮功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥大鼠血清NO水平降低，ET-1水平升高，主動(dòng)脈中VCAM-1表達(dá)量增加；匹伐他汀可升高高尿酸血癥大鼠血清NO水平，降低ET-1水平，降低主動(dòng)脈中VCAM-1表達(dá)量，表明匹伐他汀可改善高尿酸血癥大鼠血管內(nèi)皮功能，從而防止動(dòng)脈粥樣硬化斑塊發(fā)生，降低心腦血管疾病發(fā)生率。

綜上所述，匹伐他汀干預(yù)可降低高尿酸血癥大鼠的血尿酸水平，抑制炎癥反應(yīng)，改善血管內(nèi)皮功能。