麥冬皂苷B通過調(diào)控Notch1信號通路增加前列腺癌細(xì)胞的放療敏感性

李挺云 梁培育 王聲興 周治彥 陳金火

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，海南 ?？?570102)

前列腺癌(PC)是男性中發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，研究顯示我國PC發(fā)病率及致死率呈逐年增加的趨勢〔1〕。PC具有強侵襲性且嚴(yán)重威脅男性生命安全，目前放療是治療PC的有效手段，可提高患者生存質(zhì)量并改善患者預(yù)后，由于PC細(xì)胞及個體差異等因素導(dǎo)致不同前列腺癌患者對射線的反應(yīng)不同進(jìn)而導(dǎo)致治療效果不佳〔2〕。因而放射治療PC患者過程中提高放療敏感性對提高治療效果及改善患者預(yù)后均具有重要意義。有研究表明麥冬皂苷(OP)D作為麥冬提取物可通過蛋白激酶-1/混合系激酶域樣蛋白(RIP1/MLKL)信號通路進(jìn)而抑制PC細(xì)胞增殖，具有較強的抗腫瘤作用〔3〕；還有研究顯示OP可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖以及調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白等作用〔4，5〕。OP-D、OP-B均是從麥冬中分離出的單體，但是目前關(guān)于麥冬提取物OP-B是否可抑制PC細(xì)胞增殖尚不明確。因此本研究主要探討OP-B對前列腺癌細(xì)胞放療敏感性的影響，并分析其是否通過抑制Notch1信號通路發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1實驗細(xì)胞 PC-3細(xì)胞(貨號：BNCC100267)購自美國ATCC公司。

1.2方法

1.2.1主要試劑與儀器 OP-B(批號：20160908)購自南京普怡生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基(批號：20160306)、胎牛血清(批號：20161109)均購自美國Gibco公司；胰酶(批號：20170907)購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；Notch1信號通路特異性阻斷劑(DAPT，批號：20170321)購自深圳市浩博世紀(jì)生物有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，批號：20161207)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；四甲基偶唑氮鹽(MTT，批號：20161003)、二甲基亞砜(DMSO，批號：20160908)均購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒(批號：20170803)購自上海信裕生物技術(shù)有限公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號：20160903)購自上海博谷生物科技有限公司；兔抗人Notch1(批號：20170305)、Hes1抗體(批號：20170403)購自北京義翹神州科技有限公司；兔抗人Bcl-2相關(guān)蛋白(Bax批號：20170201)、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl-2，批號：20170405)抗體均購自美國Abcam公司；兔抗人裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cleaved Caspase-3，批號：20161105)、裂解的多聚ADP核糖聚合酶(cleaved PARP)抗體(批號：20170105)均購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G(批號：20170406)購自美國CST公司；蛋白裂解液(RIPA，批號：20170503)購自青島捷世康生物科技有限公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)液(批號：20170613)購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；結(jié)晶紫染料(批號：20170728)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；F20型透射電鏡購自美國FEI公司；DxFLEX型流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；Trans-Blot Turbo transfer system快速轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自美國伯樂公司；Smart View Pro2000型凝膠成像系統(tǒng)購自Major Science公司；Synergy2多功能酶標(biāo)儀購自美國伯騰儀器有限公司；TEM-SN型透射電鏡購自上海納騰儀器有限公司。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)、處理及分組 PC-3細(xì)胞放入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱(37℃ 5%CO2、95%濕度)內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度至80%～90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將PC-3細(xì)胞分為5組：空白對照組：X射線照射后不進(jìn)行任何處理的PC-3細(xì)胞；陽性對照組：以DAPT處理PC-3細(xì)胞；低劑量組：PC-3細(xì)胞中加入2.5 μmol/L OP-B；中劑量組：PC-3細(xì)胞中加入5 μmol/L OP-B；高劑量組：PC-3細(xì)胞中加入10 μmol/L OP-B〔6〕。所有細(xì)胞采用X射線照射，放射劑量率為2.0 Gy/min，每組細(xì)胞平均分成5份，每份只經(jīng)0、2、4、6、8 Gy其中一種輻射處理〔7〕，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)研究。

1.2.3MTT實驗檢測PC-3細(xì)胞增殖 放射處理后的各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，接種至96孔板(2.5×104個/孔)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，采用MTT實驗檢測PC-3細(xì)胞增殖，分別加入5 g/L MTT(20 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，分別加入DMSO(150 μl/孔)，放入搖床上振蕩5 min，使用多功能酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm處的吸光度值，計算細(xì)胞增殖率=實驗組/空白組×100%。

1.2.4檢測LDH漏出率〔8〕收集各組PC-3細(xì)胞，接種于96孔板(2.5×104/孔)，同時以DMEM培養(yǎng)基為細(xì)胞自然釋放對照組，以0.8% Triton X-100為最大釋放對照組，每組5個生物學(xué)重復(fù)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，其中最大釋放孔需在培養(yǎng)結(jié)束前加入0.8% Triton X-100(時間45 min)，分別向酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)板內(nèi)加入100 μl上清，室溫孵育10 min，分別加入LDH底物溶液(100 μl)，避光孵育15 min，分別加入30 μl檸檬酸終止液(1 mol/L)，采用多功能酶標(biāo)儀檢測各孔在490 nm處的吸光度值，LDH漏出率(%)=(實驗組吸光度值-自然釋放對照組吸光度值)/(最大釋放對照組吸光度值-自然釋放對照組吸光度值)×100%。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測PC-3細(xì)胞凋亡 綜合1.2.3實驗結(jié)果選取PC-3細(xì)胞增殖率為50%左右的輻射劑量進(jìn)行后續(xù)研究。收集各組PC-3細(xì)胞，胰酶消化后接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，5 Gy輻射處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后棄培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，胰酶〔不含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化，收集細(xì)胞，加入PBS制備細(xì)胞懸液，加入結(jié)合緩沖液(500 μl)重懸細(xì)胞，分別加入FITC標(biāo)記的Annexin V(5 μl)、PI(5 μl)，室溫孵育15 min，置于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡并計算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)目/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6Western印跡法檢測Notch1、Hes1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白表達(dá) 收集各組PC-3細(xì)胞，胰酶消化，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后收集細(xì)胞，加入RIPA重懸細(xì)胞，12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，參照BCA試劑盒說明書操作檢測蛋白濃度與純度，取30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，10%)反應(yīng)，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入脫脂牛奶(5%)封閉室溫孵育2 h，分別加入Notch1、Hes1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP一抗，稀釋比均為1∶500，置于4℃冰箱內(nèi)保存過夜，次日加入稀釋比為1∶5 000的二抗，ECL顯影，各蛋白均以β-actin為內(nèi)參基因，并采用Image J軟件檢測條帶灰度值，蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白積分吸光度值/β-actin積分吸光度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1OP-B對PC-3細(xì)胞增殖的影響 隨著輻射劑量的增加PC-3細(xì)胞增殖逐漸降低，同一輻射條件下，與空白對照組相比，陽性對照組及OP-B中、高劑量組PC-3細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05)；與低劑量組、中劑量組相比，高劑量組與陽性對照組均顯著降低(P<0.05)，高劑量組與陽性對照組相比無明顯差異(P>0.05)，見表1。

表1 OP-B對PC-3細(xì)胞增殖的影響

2.2OP-B對PC-3細(xì)胞LDH漏出率的影響 隨著輻射劑量的增加PC-3細(xì)胞中LDH漏出率逐漸降低，同一條件下，與空白對照組相比，OP-B不同劑量組及陽性對照組PC-3細(xì)胞經(jīng)不同劑量電離輻射后LDH漏出率顯著降低(P<0.05)，與低劑量組、中劑量組相比，高劑量組與陽性對照組均顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 OP-B對PC-3細(xì)胞 LDH 漏出率的影響

2.3OP-B對PC-3細(xì)胞凋亡的影響 由于照射劑量為5 Gy時PC-3細(xì)胞增殖率為50%左右，因此選用5 Gy照射劑量處理各組PC-3細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗研究。與空白對照組〔(16.13±2.15)%〕相比，低、中、高劑量組及陽性對照組PC-3細(xì)胞凋亡率顯著升高〔(41.51±2.37)%、(43.45±3.16)%、(79.75±2.24)%、(80.28±1.32)%，P<0.05〕，與低劑量組、中劑量組相比，高劑量組與陽性對照組PC-3細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)，見圖1。

圖1 OP-B對PC-3細(xì)胞凋亡的影響

2.4各組PC-3細(xì)胞Notch1、Hes1蛋白表達(dá)比較 與空白對照組相比，OP-B不同劑量組及陽性對照組PC-3細(xì)胞中Notch1、Hes1蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，高劑量組與陽性對照組均顯著低于低劑量組、中劑量組(P<0.05)，高劑量組與陽性對照組相比無明顯差異性(P>0.05)，見圖2、表3。

2.5OP-B對PC-3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組相比，OP-B不同劑量組及陽性對照組PC-3細(xì)胞中Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP蛋白表達(dá)均顯著升高(均P<0.05)，高劑量組與陽性對照組均顯著高于低劑量組、中劑量組(均P<0.05)；與空白對照組相比，OP-B不同劑量組及陽性對照組PC-3細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，高劑量組與陽性對照組均顯著低于低劑量組、中劑量組(P<0.05)，高劑量組與陽性對照組相比無明顯差異性(P>0.05)，見表3、圖3。

1～5：空白對照組、陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，下圖同圖2 各組PC-3細(xì)胞Notch1、Hes1蛋白表達(dá)

表3 各組PC-3細(xì)胞Notch1、Hes1蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖3 OP-B對PC-3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

Notch通路可參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多種生物學(xué)過程，通過抑制Notch通路及其受體表達(dá)可抑制PC細(xì)胞增殖、侵襲，同時可抑制PC細(xì)胞中蛋白激酶B(AKT)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等細(xì)胞通路〔9，10〕。推測針對Notch信號通路的靶向藥物可增強PC患者放療敏感性。

OP-B可通過抑制AKT/mTOR信號通路進(jìn)而促使肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬進(jìn)而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，通過激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)/c-Jun信號通路進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞自噬及凋亡〔11～13〕。OP-B可通過激活肺癌細(xì)胞自噬進(jìn)而增強腫瘤細(xì)胞凋亡敏感性〔14〕，影響不同信號通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但對Notch1/Hes信號通路在PC細(xì)胞中的研究卻未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報道。研究表明二甲雙胍可通過抑制Notch1/Hes信號通路進(jìn)而抑制PC-3細(xì)胞增殖并促使其凋亡〔15〕。本研究說明OP-B可抑制PC-3細(xì)胞增殖。LDH漏出率與癌細(xì)胞增殖密切相關(guān)，LDH漏出率降低時表明宮頸癌細(xì)胞增殖受到抑制，宮頸癌細(xì)胞對電離輻射的敏感性增加〔7〕。本研究說明OP-B可抑制PC-3細(xì)胞增殖并提高PC-3細(xì)胞對電離輻射的敏感性。高劑量OP-B可增強電離輻射介導(dǎo)的PC-3細(xì)胞凋亡并增強其放療敏感性。Notch信號通路可調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞分化及遷移等過程，其中Notch受體Notch1與配體結(jié)合后可激活Notch信號通路進(jìn)而激活下游靶基因Hes1表達(dá)〔16，17〕。Notch1及其下游靶基因Hes1在前列腺癌中呈高表達(dá)，抑制其表達(dá)可明顯抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，研究發(fā)現(xiàn)抑制Notch1信號通路可增強乳腺癌放療敏感性〔18，19〕。本研究提示OP-B與Notch1信號通路抑制劑的作用相同。電離輻射可殺死腫瘤細(xì)胞，其可能作用機制為激活細(xì)胞凋亡通路進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，若凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)異?；蛉笔Э纱偈蛊鋵ν饨绱碳さ拿舾行越档瓦M(jìn)而產(chǎn)生抗性〔20〕。Caspase家族在細(xì)胞凋亡等信號通路中發(fā)揮重要作用，其中抗凋亡蛋白Bcl-2與促細(xì)胞凋亡蛋白Bax比例失衡可引起聯(lián)級反應(yīng)并激活Caspase通路促進(jìn)Caspase-3、PARP表達(dá)進(jìn)而促使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔21〕。本研究提示高劑量OP-B可通過激活細(xì)胞凋亡通路并促使細(xì)胞凋亡進(jìn)而增強PC-3細(xì)胞對放療的敏感性。