檀香醇對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300的抑制作用

谷可欣，張?zhí)煲恚螞苷?，袁中偉，范維，尹立子

檀香醇對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300的抑制作用

谷可欣，張?zhí)煲恚螞苷?，袁中偉，范維，尹立子*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130)

采用倍比稀釋法與菌落計數(shù)法，分別測定檀香醇對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant，MRSA)標準菌株USA300的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)；通過測定菌液電導(dǎo)率與DNA外滲量，探究檀香醇對USA300細胞膜和細胞壁的影響；通過SDS-PAGE試驗，探討檀香醇對USA300可溶性蛋白代謝的作用；采用掃描電鏡和透視電鏡，觀察經(jīng)檀香醇處理后的USA300的超微結(jié)構(gòu)；采用結(jié)晶紫染色法，研究檀香醇對USA300生物被膜的影響。結(jié)果表明：檀香醇能在一定程度上抑制USA300的生長繁殖，其MIC和MBC分別為32、64 μg/mL；與對照組相比，經(jīng)64 μg/mL檀香醇處理1 h后的USA300菌體電導(dǎo)率增加3.40%±0.54%，經(jīng)64、32 μg/mL檀香醇處理6 h后的菌體細胞內(nèi)的DNA質(zhì)量濃度顯著增加(<0.05)，經(jīng)64、32、16 μg/mL檀香醇處理2、6 h后的菌體的可溶性蛋白均極顯著降低(<0.01)；掃描電鏡和透射電鏡觀察結(jié)果顯示，檀香醇處理過的USA300菌體細胞膜和細胞壁變化不大，但是細胞的二分裂增殖出現(xiàn)明顯的異常；亞抑菌濃度的檀香醇能明顯抑制USA300生物被膜的形成。綜上可知，檀香醇主要通過干擾細菌蛋白質(zhì)代謝過程，可明顯降低菌體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)含量，進而影響細菌的生命活動，而對細胞膜和細胞壁的影響甚微。由此可見，檀香醇在新型抗MRSA藥物的開發(fā)過程中具有較大的潛力。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；檀香醇；DNA外滲量；可溶性蛋白質(zhì)；電導(dǎo)率；超微形態(tài)；生物被膜；抑菌作用

金黃色葡萄球菌()是一種常見的革蘭氏陽性菌，能導(dǎo)致人或動物的皮膚和軟組織感染、敗血癥和肺炎[1]。傳統(tǒng)抗生素主要通過抑制細菌生長和殺滅細菌來防治細菌感染。臨床上，由于抗生素的濫用，導(dǎo)致了耐藥菌株的出現(xiàn)[2]。據(jù)報道[3]，在醫(yī)院獲得性感染中，金黃色葡萄球菌是最為常見的革蘭氏陽性菌屬致病菌。金黃色葡萄球菌具有較高的感染率和較強的致病性，其耐藥性變化較快，這些特點成為臨床治療金黃色葡萄球菌的一大難題。金黃色葡萄球菌中危害最大的是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant，MRSA)。自1961年發(fā)現(xiàn)MRSA以來，MRSA以驚人的速度在世界范圍蔓延，該類菌株不僅能耐受β-內(nèi)酰胺類藥物，還能在一定程度上耐受四環(huán)素和紅霉素等抗生素[4]，其耐藥性與抗生素的應(yīng)用劑量呈正相關(guān)，尚無有效遏制這一趨勢的藥物[5]。臨床上將萬古霉素作為一線抗MRSA感染的藥物。由于萬古霉素有較大的毒性，部分金黃色葡萄球菌出現(xiàn)了中度耐受甚至完全耐受萬古霉素的現(xiàn)象[6]，萬古霉素的使用受到了一定的限制。

檀香醇是一種萜類化合物，是檀香精油的主要成分之一，可在一定程度上預(yù)防細菌感染，殺滅病毒等。研究[7]顯示，檀香醇還能有效抑制細菌感染、減緩細胞氧化、抑制腫瘤。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)檀香醇對耐藥性金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用，但其作用機制尚未明確。本研究中，以MRSA標準菌株USA300為研究對象，研究檀香醇對細菌生長、細菌細胞膜和細胞壁及細菌形態(tài)變化的影響，探究其具體作用及機制，旨在為后續(xù)開發(fā)高效低毒的抗MRSA藥物提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

MRSA標準菌株USA300(ATCC?BAA-1717)購自美國標準菌種庫，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)實驗室保存。檀香醇(α-和β-同分異構(gòu)體的混合物)購自成都普利斯生物有限公司，用DMSO(Sigma- Aldrich，美國)溶解，配置成40.96 mg/mL的檀香醇母液。磷酸緩沖鹽粉劑(1×PBS，無鈣鎂，pH=7.0)購自北京萬佳首化生物科技有限公司。腦心浸出液肉湯、腦心浸出液瓊脂購自上海古朵生物科技有限公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2　檀香醇對USA300的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度及USA300生長曲線的測定

采用倍比稀釋法測定檀香醇對USA300的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)。以MIC數(shù)據(jù)為參考，從各澄清的試管中移取100 μL液體，均勻涂布于腦心浸出液瓊脂上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h，取少于5個菌落的平板對應(yīng)的檀香醇藥液質(zhì)量濃度定義為最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)[8]。試驗重復(fù)3次。

將USA300接種于腦心浸出液肉湯(BHI)液體培養(yǎng)基中，按照1∶100的體積比加入BHI液體培養(yǎng)基稀釋菌液；置于氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)(37 ℃，200 r/min)，直至菌液600 nm=0.3，加入檀香醇，使其終質(zhì)量濃度為0、2、4、8、16、32、64 μg/mL；置于氣浴恒溫振蕩器中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至0、1、2、4、6、8、16、24 h時，于600 nm波長測定菌液的吸光度值(600 nm)，繪制生長曲線[9]。

1.3　USA300菌液電導(dǎo)率的測定

通過測定USA300菌液在加入了檀香醇后的電導(dǎo)率，分析檀香醇對USA300細胞膜通透性的影響。將培養(yǎng)至對數(shù)期的USA300菌液(600 nm=1.8)，以2%的接種量接種于TSB培養(yǎng)基，置于氣浴恒溫振蕩器中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h后，加入檀香醇藥液，使其終質(zhì)量濃度為16、32、64 μg/mL；于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)0、1、2、4、6、8 h后，分別移取5 mL菌懸液，4 500 r/min離心10 min，取上清液，用5%葡萄糖溶液稀釋40倍后測定電導(dǎo)率[10]。用DMSO等體積替換上述試驗中的檀香醇藥液，其他試驗條件不變，設(shè)為對照組。試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4　USA300的DNA外滲量的測定

通過測定檀香醇對菌體細胞的DNA外滲量，間接分析檀香醇對USA300細胞膜通透性的影響。向培養(yǎng)至對數(shù)期的USA300菌液(600 nm=1.8)中加入適量PBS緩沖液洗滌，重復(fù)2次，制備成濃度為107cfu/mL的菌懸液[11]；加入檀香醇，使其終質(zhì)量濃度為16、32、64 μg/mL；于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)0、1、2、4、6、8 h后，4 500 r/min離心10 min，取上清液，用微量分光光度計測定DNA質(zhì)量濃度[12]。用DMSO等體積替換上述試驗中的檀香醇藥液，其他試驗條件不變，設(shè)為對照組。試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5　USA300可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

參照YUAN等[13]的研究方法，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE試驗，測定加入終質(zhì)量濃度為16、32、64 μg/mL的檀香醇處理2、6 h后的菌體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量。用DMSO等體積替換上述試驗中的檀香醇藥液，保持其他試驗條件不變，設(shè)為對照組。試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.6　USA300形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察

參照薛東芳[14]的研究方法，向USA300菌液(600 nm=1.8)中加入檀香醇，使其終質(zhì)量濃度為64μg/mL，培養(yǎng)至1、10、16 h時收集菌體。菌體中加入PBS緩沖液，洗滌3次，按照透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)樣品制備方法[15-16]制成電鏡樣品。參照文獻[17]的方法，觀察USA300菌體細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。用DMSO等體積替換上述試驗中的檀香醇藥液，保持其他條件不變，設(shè)為對照組。試驗重復(fù)3次，取其中變化最明顯的一次作為結(jié)果。

1.7　USA300生物被膜總量的測定

亞抑菌濃度為小于MIC的藥物濃度[18]。通過測定經(jīng)亞抑菌濃度的檀香醇作用的USA300生物被膜總量，分析亞抑菌濃度的檀香醇對USA300生物被膜形成的影響。將USA300菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)16 h后，分別加入到含檀香醇2、4、8、16 μg/mL的BHI液體培養(yǎng)基中，于氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)(37 ℃，200 r/min)至600 nm=0.6；從各BHI液體培養(yǎng)基中移取10 μL菌液于96孔板中，加入含3%蔗糖的BHI培養(yǎng)基290 μL，加入檀香醇，使檀香醇終質(zhì)量濃度仍為2、4、8、16 μg/mL，37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)18 h后，移取質(zhì)量分數(shù)為10%的甲醛溶液100 μL至平板中，固定生物膜，室溫過夜，移除甲醛溶液；加入質(zhì)量分數(shù)為0.1%的結(jié)晶紫溶液100 μL，室溫下染色0.5 h后，除去結(jié)晶紫溶液，加入雙蒸水進行漂洗，晾干；加入質(zhì)量分數(shù)為33%的乙酸200 μL至96孔板內(nèi)，反復(fù)吹吸孔內(nèi)液體，使生物膜在孔內(nèi)均勻分布；最后，將96孔板置于酶標儀下490 nm波長測量其吸光度值(490 nm)[19]。用DMSO等體積替換上述試驗中的檀香醇藥液，其他試驗條件不變，設(shè)為對照組。試驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.8　數(shù)據(jù)處理

運用Prism 7.0進行數(shù)據(jù)分析；組間兩兩比較采用檢驗法。

2　結(jié)果與分析

2.1　檀香醇對USA300在BHI液體培養(yǎng)基中生長的影響

檀香醇對USA300的MIC與MBC分別為32、度64 μg/mL。從圖1可知，USA300在檀香醇質(zhì)量濃為32、64 μg/mL時，生長受到抑制；檀香醇質(zhì)量濃度為16 μg/mL時，USA300生長受到一定影響；檀香醇質(zhì)量濃度為2、4、8 μg/mL時，USA300的生長無明顯變化。

時間/h

2.2　檀香醇對USA300菌液電導(dǎo)率的影響

如表1所示，整體電導(dǎo)率變化不明顯，加入檀香醇后，細菌菌液電導(dǎo)率呈現(xiàn)出小幅度的增加，但隨著培養(yǎng)時間的延長，差異逐漸縮小；與對照組相比，差異最大的是培養(yǎng)時間為1 h時，質(zhì)量濃度為64 μg/mL檀香醇組的電導(dǎo)率增加3.40%±0.54%。可見，檀香醇對細菌細胞膜的通透性影響不明顯。

表1　添加檀香醇后USA300菌液的電導(dǎo)率

2.3　檀香醇對USA300 DNA外滲量的影響

如表2所示，與對照組相比，64、32 μg/mL檀香醇作用于菌體6 h后，菌體細胞內(nèi)的DNA質(zhì)量濃度顯著增加(<0.05)，分別增加(3.17±1.07)、(1.94±0.32) μg/mL?？梢姡聪愦紝SA300的DNA外滲量有一定影響。

表2　添加檀香醇后USA300的DNA外滲量

“*”示與對照組相比差異顯著(<0.05)。

2.4　檀香醇對USA300可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

如圖2所示，檀香醇對多個可溶性蛋白的代謝過程造成影響。與對照組相比，經(jīng)64、32、16 μg/mL檀香醇處理2、6 h后，處理組的菌體可溶性蛋白均極顯著降低(<0.01)，分別降低17.08%±0.23%、26.95%±0.15%，15.74%±0.14%、26.79%±0.18%，13.49%±0.22%、14.78%±0.17%。可見，檀香醇對USA300菌體內(nèi)的可溶性蛋白的代謝過程有顯著影響。

M　標準分子量蛋白；1　2 h對照組；2　2 h處理組；3　6 h對照組；4　6 h處理組。a、b、c分別示64、32、16 μg/mL檀香醇處理后的USA300可溶性蛋白的含量。

2.5　檀香醇對USA300形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

64 μg/mL檀香醇作用于USA300 1 h后，菌體表面細胞膜無明顯皺縮變形(圖3-a1)；1 h對照組的細胞膜、細胞壁形狀飽滿，表觀形態(tài)正常(圖3-a2)；64 μg/mL檀香醇處理10 h后，細菌菌體細胞膜與細胞壁未呈現(xiàn)出明顯的損傷變形現(xiàn)象，但菌體在進行二分裂時卻出現(xiàn)了異常，不均等分裂替代了原先的均等分裂，分裂時物質(zhì)分配出現(xiàn)不平衡(圖3-b1)；10 h的對照組中的菌體具有較為完整的細胞結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)正常的均等分裂，出現(xiàn)了清晰的分裂縊痕(圖3-b2)；64 μg/mL檀香醇處理16 h后，菌體二分裂異常更加明顯，而細胞膜結(jié)構(gòu)無明顯變化(圖3-c1)；16 h對照組的菌體二分裂正常，細胞膜完整，具有清晰的二分裂期分裂縊痕(圖3-c2)。可見，檀香醇不能對USA300的細胞膜或細胞壁結(jié)構(gòu)造成明顯的破壞，但可以破壞細菌的分裂繁殖。

a1　1 h檀香醇處理組；a2　1 h對照組；b1　10 h檀香醇處理組；b2　10 h對照組；c1　16 h檀香醇處理組；c2　16 h對照組。

2.6　檀香醇亞抑菌濃度對USA300生物被膜形成的影響

對照組和16、8、4、2 μg/mL檀香醇處理組的490 nm分別為1.33±0.18、0.79±0.08、0.92±0.13、0.98±0.15、0.97±0.08，對照組吸光度值極顯著高于其他組的(<0.01)；經(jīng)16、8、4、2 μg/mL檀香醇處理后，USA300生物被膜總量比對照組分別減少40.60%±10.25%、30.83%±7.75%、26.32%±8.12%、27.07%±10.75%。可見，檀香醇對USA300生物被膜的形成呈現(xiàn)出顯著的抑制作用。當檀香醇質(zhì)量濃度為16 μg/mL時，其抑制作用最為明顯。

3　結(jié)論與討論

本研究中，MIC、MBC的結(jié)果顯示，檀香醇能明顯抑制并殺滅USA300，表明檀香醇可應(yīng)用于抗MRSA感染藥物的開發(fā)。

細胞膜作為保障細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、維持正常代謝活動的屏障結(jié)構(gòu)，其被破壞后往往會給菌體的生命活動造成很大障礙[20]。本研究中，檀香醇對USA300菌液的電導(dǎo)率影響不明顯，說明其對細菌的細胞膜的影響較小。DNA外滲量可間接地反映細胞膜、細胞壁的破損情況[21]。本研究中，64、32 μg/mL檀香醇作用于菌體6 h后，菌體細胞內(nèi)的DNA質(zhì)量濃度較對照組的顯著增加(<0.05)，這可能是由于檀香醇在一定程度上影響了細菌細胞膜的通透性。采用掃描電鏡和透射電鏡對細胞形態(tài)進行觀察，發(fā)現(xiàn)細菌的細胞膜、細胞壁無萎縮變形等明顯的變化，但細菌增殖出現(xiàn)異常的不均等分裂，這說明檀香醇可破壞細菌二分裂的增殖，而對細菌細胞膜、細胞壁幾乎沒有影響。這可能是因為檀香醇干擾了細菌增殖所需要的酶或蛋白，從而導(dǎo)致細菌二分裂無法正常完成，其具體的作用機制還有待進一步的研究。

可溶性蛋白作為關(guān)鍵的營養(yǎng)物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)細胞滲透，增強細胞的保水能力，有效保護細胞的生物膜[22]。本研究中，經(jīng)64、32、16 μg/mL檀香醇處理過的細菌菌體，可溶性蛋白總量較正常細胞極顯著降低(<0.01)，這說明檀香醇能有效抑制細菌可溶性蛋白的新陳代謝，破壞細菌的生命活動。生物被膜是細菌細胞外聚合物包裹形成的聚合體，可減弱細菌對抗菌藥物的敏感性[21]，是MRSA對醫(yī)療器械進行感染的主要毒力因子[23]。本研究中，亞抑菌濃度的檀香醇顯著抑制MRSA生物被膜的形成，說明檀香醇可降低MRSA的黏附能力并增強MRSA對抗生素的敏感性，具有開發(fā)為抗毒力因子藥物的潛能。

冬凌草甲素[13]、百里香酚[24]、松蘿酸[18]等主要是通過抑制和破壞細菌的細胞膜、細胞壁來達到殺滅和抑制細菌。與上述傳統(tǒng)中藥單體相比，檀香醇能明顯破壞MRSA菌體蛋白質(zhì)的新陳代謝和生長繁殖，而對菌體的細胞膜、細胞壁結(jié)構(gòu)影響甚微，表明在新型抗毒力因子藥物開發(fā)過程中檀香醇具有較大的潛力。

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Antibacterial effect of santalol on methicillin-resistant

GU Kexin, ZHANG Tianyi, HE Jingzheng, YUAN Zhongwei, FAN Wei, YIN Lizi*

(College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan 611130, China)

The minimal inhibitory concentration(MIC) and minimal bactericidal concentration(MBC) of santalol to methicillin-resistant(MRSA) standard strain USA300 were determined by colony counting and broth dilution methods, respectively. The effect of santalol on USA300 cell membrane and cell wall was measured by conductivity and DNA content in liquid. The effect of santalol in the process of soluble protein metabolism of USA300 was studied by SDS-PAGE. The ultrastructure of USA300 treated with santalol was observed by scanning electron microscope and transmission electron microscope. The effect of santalol in the formation of USA300 biofilm was determined by crystal violet staining. The results showed that santalol could inhibit the growth and reproduction of USA300. The corresponding MIC and MBC were 32 and 64 μg/mL, respectively. Compared with the control group, the electrical conductivity of the bacteria treated with 64 μg/mL santalol for 1 hour increased 3.40%±0.54%; the intracellular DNA mass concentration of bacteria treated with 64 and 32 μg/mL santalol for 6 h increased significantly, while the soluble protein decreased significantly after 2 h and 6 h of treatment with 64, 32 and 16 μg/mL santalol(<0 01). The micrographs of scanning electron microscope and transmission electron microscope showed that the cell proliferation had obvious abnormality with no changes on the USA300 cell membrane and cell wall. The results showed that the formation of USA300 biofilm could be inhibited significantly by giving santalol with subinhibitory concentration. In summary, santalol could significantly reduce the soluble protein content in the bacteria by interfering with the protein metabolism process, and affecting the life activities of bacteria. Santalol has great potential in the development of new anti-MRSA drugs.

methicillin-resistant;santalol; DNA exosmosis; soluble protein; conductivity; ultrastructure; biofilm; bacteriostatic effect

S853.74

A

1007-1032(2020)05-0594-07

谷可欣，張?zhí)煲?，何涇正，袁中偉，范維，尹立子．檀香醇對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌USA300的抑制作用[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2020，46(5)：594-600．

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http://xb.hunau.edu.cn

2019-11-06

2019-11-28

國家自然科學(xué)基金項目(31702284)；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“雙支”計劃項目(03571444)

谷可欣(1983—)，女，河北宣化人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)研究，gukexin_sicau@163.com；*通信作者，尹立子，博士，副教授，主要從事中藥抗細菌毒力因子及其應(yīng)用研究，yinlizi@sicau.edu.cn

責(zé)任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正