乳腺癌患者唾液中轉(zhuǎn)鐵蛋白、間-α胰蛋白酶抑制因子重鏈H1、α2巨球蛋白及鋅指同源框蛋白4水平測定及臨床意義

孫寧寧，范大華，孫珂煥，曹美群

(深圳市第二人民醫(yī)院、深圳市老年醫(yī)學(xué)研究所，廣東 深圳 518035)

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，臨床常見，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[1]。目前，對乳腺癌的診斷主要依據(jù)病理結(jié)果，確診時(shí)通常已經(jīng)處于晚期，而錯(cuò)過最佳手術(shù)時(shí)間。因此，早期診斷對于乳腺癌患者的救治十分關(guān)鍵。唾液檢測目前已成為一種可行的、優(yōu)勢明顯的檢測方法。唾液作為提供生物標(biāo)志物的體液，其中獨(dú)特、豐富的蛋白質(zhì)成分毫無疑問是潛在和理想的疾病診斷與藥物篩選的無創(chuàng)傷性生物靶標(biāo)，可為臨床疾病診斷提供重要的參考依據(jù)，這提示唾液可能為今后的臨床診斷提供一種新的檢測樣品來源[2]。本研究采集18例乳腺癌患者唾液，檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin, TF)、間-α胰蛋白酶抑制因子重鏈H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1, ITIH1)、α2巨球蛋白(alpha-2-macroglobulin，α2M)及鋅指同源框蛋白4(zinc finger homeobox protein 4, ZFHX4)4個(gè)腫瘤相關(guān)蛋白的水平，并與18例健康女性作為對照，分析這些蛋白在乳腺癌患者唾液中的水平變化規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2016年8月至2017年12月就診于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的18例女性乳腺癌患者和18例健康女性作為研究對象。18例乳腺癌患者均通過2位及以上病理科專家確診。18例健康女性均無乳腺癌及其他系統(tǒng)惡性腫瘤病史。乳腺癌患者年齡(51.38±1.97)歲，對照組患者年齡(48.61±2.40)歲，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.894，P=0.377)。本研究已經(jīng)通過醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且獲得受試者的知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒：TF(批號：ab108902)和α2M(批號：ab108883)均購自美國abcam公司；ITIH1(批號：abx250565)和ZFHX4(批號：abx153533)購自英國abbexa公司。

1.3 方法

1.3.1 唾液標(biāo)本的采集和處理 采用非刺激性唾液采集方式收集唾液樣品，具體操作方法如下[3]：前1天晚上臨睡前清水漱口3次(不再進(jìn)食任何食物或藥物)，當(dāng)天起床后漱口前空腹收集唾液，患者將已消毒的無菌棉球放入口中，唾液積聚至一定量后，將棉球吐入10 mL唾液離心管內(nèi)。4 ℃條件下，3 000 r/min離心5 min，將唾液分裝于1.5 mL EP管中，并加入蛋白酶抑制劑，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 ELISA檢測唾液中4個(gè)腫瘤相關(guān)蛋白 按照ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行TF、ITIH1、α2M及ZFHX4等4個(gè)腫瘤相關(guān)蛋白的濃度。將樣品稀釋至合適濃度，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品依次加入已包被抗體的96孔板中，每個(gè)樣品和標(biāo)品均3個(gè)重復(fù)孔。根據(jù)試劑盒說明書目的蛋白與包被抗體結(jié)合后，去除未結(jié)合樣品；加入生物素修飾的抗體，孵育完成后洗滌去除多余的生物素化抗體；然后利用生物素與親和素結(jié)合原理加入親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，按說明書要求去除多余的辣根過氧化物酶；最后加入四甲基聯(lián)苯胺底物顯色,終止液終止，酶標(biāo)儀在450 nm波長下讀取各孔吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品中目的蛋白水平。

1.4 生物信息學(xué)分析應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用生物信息學(xué)分析工具KEGG數(shù)據(jù)庫對蛋白所涉及的通路進(jìn)行分類和富集分析。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌患者和健康女性唾液中TF、ITIH1、α2M及ZFHX4水平比較乳腺癌患者唾液中TF、ZFHX4水平分別為(3.092±0.309)mg/L、(0.546±0.084)μg/L，均高于健康女性的(2.231±0.217)mg/L、(0.207±0.059)μg/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.281，P=0.030；t=3.310，P=0.003)。乳腺癌患者唾液中ITIH1、α2M水平分別為(0.162±0.105)μg/L、(2.448±0.218)mg/L，均低于健康女性的(1.709±0.384)μg/L、(3.568±0.258)mg/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.891，P=0.001；t=3.318，P=0.003)。

2.2 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 STRING數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果 通過STRING數(shù)據(jù)庫對TF、ITIH1、α2M及ZFHX4等4種蛋白進(jìn)行蛋白相互作用分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TF和α2M具有相互作用。TF是一個(gè)核心蛋白，還與表皮生長因子(EGF)、血色素沉著癥蛋白(HFE)、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TFRC)、載脂蛋白B(APOB)、人絲氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子1(SERPINA1)等多個(gè)蛋白具有相互作用，可能在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用。見圖1。

2.2.2 KEGG數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果 通過KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，TF存在于缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)信號通路上，該通路在細(xì)胞生長發(fā)育和生理應(yīng)激以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。見圖2。

圖1 蛋白相互作用圖

3 討論

無創(chuàng)診斷是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的目標(biāo)，近年來國外正在嘗試以唾液代替血液建立全新的無創(chuàng)性唾液診斷學(xué)[4-7]。唾液是機(jī)體不可缺少的一種重要體液，血液中多種成分均可通過毛細(xì)血管壁進(jìn)入唾液，體內(nèi)各種病理生理變化會(huì)間接影響唾液組成[8]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在研究以唾液代替血液用于臨床疾病診斷的價(jià)值中取得了不少研究成果，發(fā)現(xiàn)唾液可以作為疾病診斷及治療過程中病情檢測的重要參考指標(biāo)[9-11]。因此，本研究采集乳腺癌患者唾液，檢測與乳腺癌相關(guān)的TF、ZFHX4、ITIH1和α2M等4個(gè)蛋白水平，探索乳腺癌患者唾液中蛋白水平變化規(guī)律。

TF是由肝臟合成的一種單鏈糖蛋白家族，廣泛存在于體液中，不僅參與鐵的運(yùn)輸與代謝，同時(shí)還具有抗菌活性、促細(xì)胞生長分化及細(xì)胞保護(hù)等許多生理生化功能，是一類多功能蛋白[12]。已有研究[13]顯示，TF在結(jié)直腸癌患者血清中表達(dá)水平升高，通過對血清TF及癌胚抗原聯(lián)合檢測，提高了結(jié)直腸癌篩查敏感性。而且血清TF作為腫瘤標(biāo)志物，其輔助檢測價(jià)值已得到大家的認(rèn)可[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者唾液中TF水平較健康女性明顯升高，從而推測唾液TF可能會(huì)成為乳腺癌輔助診斷指標(biāo)。

α2M是一種四聚體，富含二硫化物的蛋白酶抑制劑，廣泛存在于動(dòng)物血液中，在動(dòng)物防御系統(tǒng)中扮演著重要角色[15-16]。α2M在輻射防護(hù)機(jī)制中的作用可以從以下5個(gè)方面概括：抗氧化、抗纖維化、抗炎癥、維持體內(nèi)平衡、增強(qiáng)DNA修復(fù)和細(xì)胞恢復(fù)過程[16]。α2M與多種腫瘤有密切聯(lián)系。研究[17]表明，血清α2M在乳腺癌被診斷之前表達(dá)水平顯著低于正常組，可用于乳腺癌早期篩查，而且在乳腺癌化療過程中，血清α2M水平的變化較為明顯，α2M還可以用于乳腺癌的治療監(jiān)測。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者唾液中α2M水平較健康女性顯著下降。因此，唾液中α2M可能對于乳腺癌的早期診斷及預(yù)后判斷具有重要的參考意義。

圖2 HIF-1信號通路圖

ITIH1是ITIH家族成員之一，該家族成員作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，在炎癥和癌變過程中扮演著重要的角色[18]。已有文獻(xiàn)[19]報(bào)道，ITIH1在體外可以增強(qiáng)細(xì)胞附著，在小鼠模型體內(nèi)可以減少腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)量。此外，ITIH1已被證明在炎癥和癌變中發(fā)揮著特別重要的作用，在乳腺癌、結(jié)腸癌和肺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程中ITIH1基因表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)現(xiàn)象[18]。本研究結(jié)果也表明，乳腺癌患者唾液中ITIH1水平較健康女性顯著下降，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。因此，ITIH1可以作為乳腺癌診斷的輔助檢測指標(biāo)。

ZFHX4蛋白是一個(gè)相對分子質(zhì)量397 000的轉(zhuǎn)錄因子[20]。已有文獻(xiàn)報(bào)道該蛋白在肌肉和大腦中高度表達(dá)，且在胚胎時(shí)期表達(dá)水平最高，隨著年齡的增加該蛋白表達(dá)量逐漸降低，直至幾乎無法檢測到的水平[21]。但研究者發(fā)現(xiàn)ZFHX4蛋在食管鱗癌組織中過量表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)ZFHX4蛋白在體外可以顯著抑制細(xì)胞遷移和入侵[22]。研究發(fā)現(xiàn)，ZFHX4基因不僅在食管鱗癌組織中表達(dá)上調(diào)，在乳腺癌組織中也存在lncRNA ZFHX4-AS1的表達(dá)上調(diào),而且后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)lncRNA ZFHX4-AS1通過Hippo信號通路在乳腺癌中發(fā)揮致癌基因的作用[23-24]。本研究結(jié)果表明，乳腺癌患者唾液中ZFHX4蛋白水平顯著上升，說明唾液ZFHX4蛋白與lncRNA ZFHX4-AS1表達(dá)趨勢一致，推測唾液ZFHX4蛋白可以作為乳腺癌潛在預(yù)測因子。

進(jìn)一步的生物信息學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，TF和α2M具有相互作用，還與多個(gè)蛋白具有相互作用。STRING數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，TF和α2M具有相互作用，TF是一個(gè)核心蛋白，還與多個(gè)蛋白具有相互作用。KEGG數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，TF存在于HIF-1信號通路上，該通路在細(xì)胞生長發(fā)育和生理應(yīng)激以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。這提示唾液中TF、ZFHX4、ITIH1和α2M等4個(gè)蛋白均有可能成為乳腺癌潛在生物標(biāo)志物，為乳腺癌的檢測提供更簡單快速的檢測方法。

總之，本研究預(yù)示著唾液檢測有可能成為一種可行的、優(yōu)勢明顯的檢測方法。但目前唾液檢測尚處于初步階段，唾液成分的穩(wěn)定性以及受哪些因素的影響等尚不十分清楚，怎樣控制唾液標(biāo)本的穩(wěn)定性以及怎樣取材等需進(jìn)一步探索研究。同時(shí)本研究結(jié)果需要進(jìn)一步在大樣本研究中驗(yàn)證，并對差異蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)制加以深入研究。