反復著床失敗患者淋巴細胞主動免疫治療的臨床結局

賈婉璐 王海燕

近年，體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)周期的著床率始終徘徊在30%～40%，其中反復著床失敗(recurrent implantation failure，RIF)的發(fā)生率約在5%～11.1%[1]，這成為困擾臨床工作的一大難題。

胚胎的成功著床要求囊胚與子宮內膜同步發(fā)育且功能協(xié)調，它是母胎免疫耐受順利建立的結果。研究表明，子宮內膜中有許多免疫細胞，如T輔助細胞1型(Th1)、T輔助細胞2型(Th2)、樹突狀細胞、單核巨噬細胞、自然殺傷細胞，這些均是參與著床的重要細胞[2]。文獻表明，在IVF-ET失敗的患者中，血清抗磷脂抗體較無著床失敗的不孕患者也有所升高[3]。研究表明，抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)可干擾胚胎著床[4]。此外，許多細胞因子也都通過直接或間接作用調節(jié)妊娠過程，如白細胞介素-6家族[5]，包括白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、白細胞介素-6(interleukin，IL-6)和白細胞介素-11(interleukin-11，IL-11)。因此，從免疫方面治療反復著床失敗的方法應運而生，如宮腔灌注外周血單核細胞[6-7]、口服免疫制劑[8]、宮腔灌注人促絨毛膜性腺激素[9]及宮腔灌注粒細胞集落刺激因子[10]等，這些方法均取得一定療效。

早在1994年Carp等[11]應用患者丈夫的白細胞(淋巴細胞和單核細胞)免疫治療反復IVF失敗患者，該研究入組了10名年齡在20～40歲的患者且3次IVF助孕未獲得妊娠的患者，并檢測患者體內抗丈夫補體依賴抗體陰性。將從患者丈夫外周血中分離的白細胞注射至患者前臂皮下，4周后重復注射1次，2次注射后兩周檢測患者體內抗丈夫補體依賴抗體如為陽性可進行下次胚胎移植，如為陰性需進行第3次注射，結果10名患者共經(jīng)歷了30個IVF周期，6名患者獲得妊娠，周期臨床妊娠率為20%，并未有提高。之后鮮有報道應用免疫治療方法治療反復IVF失敗患者。

本研究回顧性總結因RIF行淋巴細胞主動免疫治療(lymphocyte immunotherapy，LIT)的62例患者的臨床資料，觀察其臨床療效及其影響因素。

資料與方法

1.一般資料：2012年1月—2016年12月在本院生殖中心助孕，且至少連續(xù)行3個胚胎移植周期(新鮮或解凍移植周期)且每周期移植1～2枚優(yōu)質胚胎未獲得臨床妊娠、并行LIT治療的患者，共62例。

2.方法：采用臨床觀察資料分析方法，研究資料采集自北京大學第三醫(yī)院生殖中心數(shù)據(jù)庫、門診病例及電話病史詢問。

3. 淋巴細胞主動免疫治療：常規(guī)消毒后，抽取供者上肢靜脈血20 ml，用適量肝素抗凝，37℃水浴30 min，取上清，置于5 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，混勻，將混勻液緩緩加入另一含10 ml淋巴分離液的離心管中；1 500 r/min離心10 min，收集淋巴細胞并置于5 ml PBS液中平衡，2 000 r/min離心10 min，去上清，加PBS液5 ml混勻；1 500 r/min離心5 min；去上清，將淋巴細胞團置于0.9%氯化鈉1 ml中混勻備用。取少許混懸液，計數(shù)淋巴細胞，調密度達(40～70)×106/ml，于女方前臂內側等份皮內注射4～9個點，每2周1次，行淋巴細胞免疫治療4次后行胚胎移植，確定妊娠后再行2次上述治療。

4. 主要分析指標：夫妻雙方行第一次IVF助孕時的年齡(即女方年齡和男方年齡)、夫妻雙方診斷為RIF時的年齡、不孕類型、不孕年限、免疫治療前共移植次數(shù)(既往移植次數(shù))、患者免疫治療前應用過的其他治療方法及治療效果、免疫治療后移植妊娠結局、移植前是否輔助藥物治療、此次移植周期為新鮮周期或解凍周期，此次移植周期的胚胎著床率和臨床妊娠率。

5.統(tǒng)計學處理：應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗分析；計數(shù)資料采用卡方檢驗分析；多因素分析采用Logistic回歸分析；檢驗結果以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1.資料總體構成：由表1可知，本次研究入組的62例RIF患者的女方平均年齡為(31.2±4.3)歲，男方平均年齡(33.0±5.4)歲，其診斷RIF時的女方和男方平均年齡分別為(32.6±4.3)歲和(34.3±5.4)歲，62例RIF患者的平均不孕年限為(4.7±2.9)年，其中原發(fā)不孕患者46例，繼發(fā)不孕患者16例。

62例RIF患者在行免疫治療前有57例曾行宮腔鏡檢查，6例曾行子宮內膜搔刮治療，15例曾行口服阿司匹林+潑尼松口服治療。其中有29例在LIT后首次移植獲得臨床妊娠，1例在免疫治療后自然妊娠，2例在免疫治療后第2次移植獲得妊娠。29例首次移植后妊娠的患者中有17例已成功分娩，其中一例分娩雙胎，其余均為單胎分娩，而4例在妊娠后發(fā)生胚胎停育。余8例仍在妊娠中，其中有3例為雙胎妊娠。而未獲得臨床妊娠的32例中有3例在LIT后首次移植后生化妊娠。

2.影響臨床結局的因素：根據(jù)62例患者免疫治療后有1例患者自然妊娠，61例患者行胚胎移植，移植胚胎共103枚，其中獲得臨床妊娠周期29個，共著床胚胎34枚。進而得出免疫治療后RIF患者首次移植周期的胚胎著床率和移植周期臨床妊娠率分別為33.0%(34/103)、47.5%(29/61)。根據(jù)免疫治療后的是否獲得臨床妊娠將61例患者分為成功組(29例)和失敗組(32例)。61 例患者中有40例患者在免疫治療后首次移植周期輔助口服阿司匹林聯(lián)合/不聯(lián)合潑尼松，其中有21例患者獲得臨床妊娠。此外，成功組患者新鮮周期移植的有9例，解凍周期移植的20例。而失敗組患者新鮮周期移植的有15例，解凍周期移植的17例。見表2。

分析兩組患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)RIF患者經(jīng)LIT治療后首次IVF周期移植的臨床結局與患者不孕年限、不孕類型、既往IVF失敗次數(shù)、新鮮或解凍移植及此次移植周期是否輔助藥物治療無相關性，只有女方年齡、女方RIF年齡在兩組間差異有統(tǒng)計學意義，見表2。將所有變量經(jīng)多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)只有女方RIF年齡為免疫治療后IVF結局的獨立影響因素(P=0.011，OR=1.21，95%CI=1.04～1.39)。

表1 RIF患者經(jīng)LIT治療后首次移植周期時的基本資料構成

表2 RIF患者免疫治療后妊娠結局相關的單因素分析

討論

本研究入組的62例RIF患者在行免疫治療后29例患者成功獲得臨床妊娠。除去免疫治療后有1例患者自然妊娠，免疫治療后首次移植周期共61個，免疫治療后RIF患者的胚胎著床率和移植周期臨床妊娠率分別為33.0%、47.5%。本研究與黃向紅等[12]的研究結果基本相符，該研究前瞻性隨機對照研究入組RIF患者在免疫治療后新的移植周期的胚胎著床率和移植周期臨床妊娠率分別為25.3%和54.8%，較未治療組明顯提高?？梢奟IF患者再移植周期輔助免疫治療可改善移植周期妊娠結局。

許多研究已表明免疫穩(wěn)態(tài)的失衡可引起RIF，Liang等[13]和Nakagawa等[8]的研究均表明輔助型T1細胞、輔助型T2細胞在RIF的發(fā)生中發(fā)揮一定作用。此外，Miko等[14]研究還發(fā)現(xiàn)IVF助孕失敗的患者外周血中NK細胞及NKT細胞亞群中的1類細胞增多。Fukui等[15]也做了一項關于外周血清NK細胞的研究，發(fā)現(xiàn)分泌腫瘤壞死因子-γ和腫瘤壞死因子-α的CD56brightNK細胞的比例在反復自發(fā)性流產(chǎn)和RIF的女性中顯著高于健康婦女，而分泌白細胞介素-4和白細胞介素-10的CD56brighNK細胞的比例在反復自發(fā)性流產(chǎn)和RIF的女性中顯著低于健康婦女。由此可見，淋巴細胞在RIF的發(fā)病機制中起著至關重要的作用，而淋巴細胞免疫治療也基于此。

不僅細胞的數(shù)量變化可影響胚胎著床，細胞分泌的細胞因子也參與調節(jié)著床過程，許多細胞因子也都通過直接或間接作用調節(jié)妊娠過程，如白細胞介素-6家族[5]，包括白血病抑制因子(LIF)、白細胞介素-6和白細胞介素-11。已有研究表明，對于不明原因復發(fā)性流產(chǎn)的患者行LIT治療后T淋巴細胞亞型數(shù)量和比例發(fā)生改變，且有些改變利于妊娠的維持[16-17]。因此，淋巴細胞主動免疫治療或可通過改變細胞因子的種類和數(shù)量來調節(jié)妊娠。

此外，本研究根據(jù)其首次移植的妊娠結局將患者分為兩組，即移植成功組29例和移植失敗組32例。分析兩組患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)RIF患者經(jīng)LIT治療后首次IVF周期移植的臨床結局與患者不孕年限、不孕類型、既往IVF失敗次數(shù)、新鮮或解凍移植及此次移植周期是否輔助藥物治療無相關性，而患者診斷RIF時的年齡是LIT后首次移植臨床結局的獨立影響因素，失敗組患者診斷RIF時的年齡偏大，LIT治療后首次移植的成功幾率低。年齡不僅是女性生育力下降的因素，也是胚胎著床失敗的因素。Ocal等[18]的研究表明，RIF患者的平均年齡較非RIF患者平均年齡高，且差異具有統(tǒng)計學意義。Tan等[19]研究也發(fā)現(xiàn)，年齡是影響IVF結局的獨立影響因素，年齡<30歲的不孕患者有較好的IVF結局。