細(xì)菌性根腐病對三七光合特性的影響*

武洪敏, 沙本才, 張金燕, 寸 竹, 陳軍文**

細(xì)菌性根腐病對三七光合特性的影響*

武洪敏1,2,3, 沙本才1,2, 張金燕1,2,3, 寸 竹1,2,3, 陳軍文1,2,3**

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)西南中藥材種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家地方聯(lián)合工程研究中心 昆明 650201; 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省藥用植物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明 650201; 3. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院 昆明 650201)

根腐病是嚴(yán)重威脅三七生產(chǎn)的重要因素之一, 常年發(fā)病率在5%~20%。其中, 由假單胞桿菌()引起的細(xì)菌性根腐病, 因葉片出現(xiàn)缺水萎蔫癥狀時(shí)才能發(fā)現(xiàn), 目前尚無有效的預(yù)防措施。為探究細(xì)菌性根腐病對三七光合生理特性的影響, 從而為三七病害生理學(xué)研究提供理論基礎(chǔ), 本文以2年生三七為材料, 設(shè)置2個處理[發(fā)病植株和健康對照植株(CK)], 研究細(xì)菌性根腐病對三七形態(tài)結(jié)構(gòu)、光合特性和光系統(tǒng)功能的影響。結(jié)果表明: 1)根腐病導(dǎo)致三七的主根褐變腐爛, 須根斷損, 莖基部腐爛中空, 葉片萎蔫, 各器官含水量比CK顯著降低(≤0.05); 而株高、葉面積和葉片解剖結(jié)構(gòu)(上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度和海綿組織厚度)在兩處理間均無顯著差異。2)發(fā)病植株葉片葉綠素含量、凈光合速率(n)、氣孔導(dǎo)度(s)、水分利用效率(WUE)和表觀葉肉導(dǎo)度(AMC)顯著低于CK(≤0.05), 且CK葉片胞間CO2濃度(i)與n呈反比。3)發(fā)病植株葉片的光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)反應(yīng)中心P700最大熒光信號(m)根腐病初期暫不受影響, 而葉片暗適應(yīng)下最大量子效率(vm)、光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)電子傳遞速率[ETR(Ⅱ)]、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量[(Ⅱ)]、PSⅠ電子傳遞速率[ETR(Ⅰ)]、PSⅠ周圍的環(huán)式電子流(CEF)和PSⅠ實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量[(Ⅰ)]均顯著低于CK(≤0.05); 參與調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量[(NO)]則顯著高于CK(≤0.05); 發(fā)病植株的快速葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線上出現(xiàn)K相, 且顯著高于CK(≤0.05)?？偟膩砜? 細(xì)菌性根腐病對三七發(fā)病植株各器官的損傷嚴(yán)重程度為根>莖>葉, 且根腐病導(dǎo)致發(fā)病植株葉片葉綠素降解, PSⅡ受到不可逆損傷, PSⅠ的電子傳遞被抑制, 且葉肉細(xì)胞CO2的同化能力降低, 根腐病限制三七正常進(jìn)行光合作用的條件。

三七; 細(xì)菌性根腐病; 缺水; 葉片解剖結(jié)構(gòu); 光合特性; 葉綠素?zé)晒?/p>

在自然環(huán)境中, 植物會受到各種生物或非生物因子的刺激, 影響植株新陳代謝過程, 進(jìn)而可能發(fā)生一系列形態(tài)、生理生化上的病理變化, 最終阻礙植物的正常生長發(fā)育。一般來說, 所有植物對生物因子侵染的反應(yīng)大致相似。當(dāng)病原物侵染植株后, 植物會通過降低光合作用、增強(qiáng)呼吸和蒸騰作用以及合成相關(guān)拮抗性酶類等策略來抵御病原物的侵入;隨著病原物與寄主植物相互作用的深入, 會使寄主組織內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目和體積發(fā)生變化以抵御病原物的進(jìn)一步擴(kuò)展; 病變加劇后, 植株最終會出現(xiàn)形態(tài)病變, 如變色、腐爛、萎蔫等癥狀[1]。

關(guān)于植物病害影響光合作用的研究表明, 植物病害的發(fā)生會導(dǎo)致罹病植株葉綠體結(jié)構(gòu)受損, 葉綠素(Chl)含量降低, 光合有效面積減小, 進(jìn)而引起光合速率顯著下降[2-3]。車前草()感染霜霉病(Downy mildew)后, 葉片中會積累大量淀粉, 氣孔被病原物阻塞, 氣孔導(dǎo)度(s)下降, 從而使凈光合速率(n)下降[4]。西葫蘆()感染銀葉病后, 葉綠體數(shù)目和CO2固定效率減小導(dǎo)致n下降[5]。這些研究表明, 病原菌抑制植物光合效率可能是由s下降導(dǎo)致的, 但也有可能是非氣孔限制因素所導(dǎo)致。另一方面, 葉綠素?zé)晒鈪?shù)也能在一定程度上體現(xiàn)病原侵染對植株光合作用的影響。受病原侵染的煙草()和甜瓜()葉片暗適應(yīng)下最大量子效率(vm)和光合電子傳遞速率下降, 使光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心暫時(shí)失活或受到不可逆的傷害, 導(dǎo)致同化力(NADPH、ATP)的合成受阻, 進(jìn)而影響暗反應(yīng)階段CO2的固定與同化[6-7]。因此, 研究病原侵染對植株光合生理活性的影響具有重要意義。

病原侵染和水分虧缺分別是植物在自然環(huán)境中最常遭受的生物與非生物脅迫, 同時(shí), 植物病害和水分之間關(guān)系密切, 病害的發(fā)生時(shí)常伴隨水分脅迫[8]。番茄()、小麥()在病原菌侵染后, 植株葉片因水分散失而萎蔫[9-10]。條銹菌()侵染小麥后使植株內(nèi)部水分虧缺, 水分利用率顯著降低, 光合效率也隨之降低[11]。這些研究表明, 病原物侵染植物后, 往往使寄主植物缺水而影響植株的正常生長。此外, 崔振華[12]研究表明, 葡萄卷葉病(grapevine leafroll disease)和水分虧缺能顯著降低葡萄()葉片的Chl含量及其光合效率。也就是說, 現(xiàn)有的研究主要聚焦于病原侵染和水分虧缺之間的關(guān)系, 關(guān)于病原侵染引起植株水分虧缺的光合生理還鮮有報(bào)道, 而研究罹病植株的光合生理狀況對于病害的早期防控具有重要意義。

三七()為五加科(Araliaceae)人參屬多年生宿根草本植物, 因其喜溫暖陰濕的栽培環(huán)境而有利于病原菌的繁殖, 導(dǎo)致三七根腐病問題十分嚴(yán)重[13]。王朝梁等[14]研究發(fā)現(xiàn), 溫度決定根腐病害出現(xiàn)的時(shí)間和擴(kuò)展的速度。官會林等[15]研究表明, 厭氧細(xì)菌、真菌和放線菌是三七根腐病的主要病原菌, 其中毀壞柱孢霉()和三七黃腐病菌()是三七根腐病的主要病原真菌[13]。羅文富等[16]認(rèn)為, 三七根腐病是一種復(fù)合侵染病害, 主要是細(xì)菌和真菌混合致病。其中, 由假單胞桿菌()引起的細(xì)菌性根腐病, 又被七農(nóng)稱為“綠臭”, 即急性青枯型根腐病, 表現(xiàn)為地上部葉片呈綠色但萎蔫下垂, 塊根有大量膿菌, 該病主要發(fā)生于種苗移栽田, 2、3年生三七整個生長期都有可能發(fā)生[13,16]。然而, 現(xiàn)有的研究大多集中在三七根腐病的病原菌和根腐病的發(fā)生規(guī)律上, 關(guān)于細(xì)菌性根腐病誘導(dǎo)的缺水對三七光合生理的研究尚鮮見報(bào)道。本研究通過盆栽試驗(yàn), 以發(fā)生細(xì)菌性根腐病的2年生三七為試驗(yàn)材料, 分別對植株形態(tài)、器官含水量、葉綠素含量、光合氣體交換參數(shù)及葉綠素?zé)晒鈪?shù)等進(jìn)行分析, 闡明細(xì)菌性根腐病對三七光合生理的影響機(jī)制, 以期為三七病害生理學(xué)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)設(shè)在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山教學(xué)農(nóng)場(位于昆明市盤龍區(qū), 25°08′N、102°45′E), 海拔1 966 m, 干濕季節(jié)分明, 屬亞熱帶季風(fēng)氣候。種植土壤為未栽種過三七的紅壤, 其土壤基本理化性狀: pH 6.84, 有機(jī)質(zhì)3.18 g×kg–1, 全氮0.17 g×kg–1, 全磷0.23 g×kg–1,全鉀0.24 g×kg–1, 速效磷11.04 mg×kg–1, 速效鉀127.32 mg×kg–1。

1.2 試驗(yàn)材料及處理

于2019年1月, 將健壯且長勢一致的1年生三七種苗(購自文山苗鄉(xiāng)三七股份有限公司), 用百菌清和福滿雙消毒后, 移栽在裝有6 kg土的花盆中(花盆規(guī)格為口徑32 cm、底徑19 cm、高21 cm), 共種植40盆, 每盆3株。按正常生產(chǎn)水平15 kg×hm–2施肥, N∶P2O5∶K2O 施用比例為1∶1∶2。

于2019年7月, 三七自然發(fā)病時(shí), 選取癥狀一致的三七植株為研究材料。試驗(yàn)設(shè)2個處理, 參考相關(guān)研究[13], 選取土壤水分適宜(土壤水分60%左右)、地上部葉片呈綠色并萎蔫下垂及具有細(xì)菌性根腐病特征的三七, 作為發(fā)病植株(Diseased plants, DP); 選取土壤水分適宜(土壤水分60%左右), 無病害的正常三七, 作為健康對照植株(Healthy plants, CK), 如圖1A所示。此次試驗(yàn)中所選植株的長勢和葉片數(shù)一致。試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)重復(fù)數(shù)為7(=7)。

1.3 植株形態(tài)和各器官含水量測量

于2019年7月18日, 利用直尺(精確度為0.1 cm)測量株高; 摘下葉片, 使用Li-3000C葉面積儀(Li-Cor, USA)對葉長、葉寬、葉面積等參數(shù)進(jìn)行采集; 整株挖起三七后, 分別稱取根、莖、葉的鮮質(zhì)量, 之后將各部分放于70 ℃烘箱烘至恒重, 計(jì)算植株的各器官含水量[17]。試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)重復(fù)數(shù)為7(=7)。

含水量=(鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)/鮮質(zhì)量×100% (1)

1.4 葉片和莖基部解剖結(jié)構(gòu)測定

7月18日, 將不同處理的三七功能葉經(jīng)主脈與邊緣之間切取1~2 mm2的方形小塊, 后用刀片在莖基部切取長0.3~0.5 cm的橫切環(huán), 參考James等[18]的方法對其進(jìn)行石蠟切片的制作, 將制好的切片置于光學(xué)顯微鏡(DM2500)下觀測, 并測量三七葉片的上表皮、下表皮、葉片、柵欄組織和海綿組織的厚度。試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)重復(fù)數(shù)為7(=7)。

1.5 葉綠素含量測定

將1.4中所剩的三七功能葉洗凈擦干后, 用丙酮∶乙醇(1∶1)浸提葉片后得到提取液, 利用分光光度計(jì)測定浸提液在663 nm和645 nm下的吸光值, 按照趙世杰等[19]的方法計(jì)算葉綠素a(mg×g–1)和葉綠素b(mg×g–1)含量, 葉綠素(mg×g–1)以葉綠素a和葉綠素b的總和表示。試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)重復(fù)數(shù)為7(=7)。

1.6 光合相關(guān)參數(shù)測定

1.6.1 氣體交換參數(shù)測定

于2019年7月10—18日的晴天上午8:30— 11:30, 使用Li-6400XT光合-熒光記錄儀(Li-Cor, USA)對三七功能葉進(jìn)行光合作用參數(shù)測定。測定時(shí)空氣流速300 mL×min–1, 溫度25 ℃, 相對濕度(50±5)%。

1)光響應(yīng)曲線測定。設(shè)定CO2濃度為400 μmol(CO2)×mol–1, 夾上葉片后在500 μmol(photons)×m-2×s-1光強(qiáng)下誘導(dǎo)約8 min, 數(shù)據(jù)穩(wěn)定后啟動自動測量程序, 光強(qiáng)梯度 [μmol(photons)×m-2×s-1]設(shè)為: 500、300、200、150、100、80、60、40、20、10、0。每個光強(qiáng)下穩(wěn)定約3 min, 取n、s的參數(shù)值。根據(jù)Bassman等[20]的方法擬合光響應(yīng)曲線方程, 計(jì)算得到潛在水分利用效率(WUEinst)、內(nèi)稟水分利用效率(WUEi)[21]和表觀葉肉導(dǎo)度(AMC):

WUEinstnr(2)

WUEin/s(3)

AMCni(4)

式中:i為胞間CO2濃度。AMC常用于估測1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(RuBP case)的活性[22]。

2)CO2響應(yīng)曲線測定。將光照強(qiáng)度控制為500 μmol(photons)×m-2×s-1, 夾上葉片后于400 μmol(CO2)×mol–1濃度下穩(wěn)定8 min, 數(shù)據(jù)穩(wěn)定后啟動自動測量程序, CO2濃度[μmol(CO2)×mol–1]依次為400、350、300、250、200、150、100、50、400、600、800和1 000, 每個濃度下穩(wěn)定3 min后采集各參數(shù)值。以i為橫軸,n為縱軸, 繪制CO2響應(yīng)曲線(i-n曲線), 根據(jù)Bassman等[20]的方法進(jìn)行擬合。

1.6.2 PSⅡ和PSⅠ葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

參考Zhang等[23]的方法, 用Dual-PAM-100 (Walz, Germany)對測完氣體交換參數(shù)的三七功能葉進(jìn)行葉綠素?zé)晒獾臏y量。

1)凌晨熒光測定。于凌晨3:00, 采用Dual-PAM-100的“SP-Analysis”模式對熒光參數(shù)進(jìn)行采集, 測量暗適應(yīng)下PSⅡ最小熒光(o)、最大熒光(m)和PSⅠ反應(yīng)中心P700最大熒光信號(m)。

2)葉綠素?zé)晒忭憫?yīng)曲線測定。在“SP-Analysis”模式下, 設(shè)置光強(qiáng)[μmol(photons)×m-2×s-1]梯度為: 0、18、36、59、94、132、172、214、272、330、421、501和611, 同時(shí)記錄光適應(yīng)下PSⅡ最小熒光(o)、最大熒光(m)和PSⅠ反應(yīng)中心P700最大熒光信號(m)。參考Miyake等[24]和Huang等[25]的方法對熒光參數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

3)快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動力學(xué)曲線(O-J-I-P曲線)的測定。于凌晨3:00, “Fast Acquisition”模式下對PSⅡ葉綠素?zé)晒膺M(jìn)行測定。先用3 000 μmol×m–2×s–1的飽和光誘導(dǎo)葉片, 葉綠素?zé)晒庑盘栍涗洀?0 ms開始, 至1 s結(jié)束。根據(jù)Strasser等[26]的方法對O-J-I-P曲線進(jìn)行分析。

k(k-o)/(j-o) (5)

j=(j-o)/(m-o) (6)

式中:o、k、j和m分別代表時(shí)間為20 μs、300 μs、2 ms和300 ms的熒光值,k為相的相對可變熒光,j為可變熒光j占o(jì)-p振幅比例。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所測量的數(shù)據(jù)通過Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì); 用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 20.0進(jìn)行配對檢驗(yàn)(Paired-Samplestest)及差異顯著性分析, 所有參數(shù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=7)表示,≤0.05為差異顯著; 用Sigmaplot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 根腐病對三七形態(tài)結(jié)構(gòu)和器官含水量的影響

在根腐病的侵染下, 三七的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化(圖1)。與CK相比, DP的葉片萎蔫下垂(圖1A); 莖的外部形態(tài)無明顯差異(圖1A, 1B); DP根系表皮有破損, 主根變褐腐爛, 須根斷損(圖1C, 1D); 此外, DP橫截面顯示韌皮部出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)(圖1D)。這些結(jié)果表明假單胞桿菌侵染三七根系后, 導(dǎo)致三七根系受損嚴(yán)重, 葉片萎蔫下垂。

圖1 細(xì)菌性根腐病對三七植株形態(tài)的影響

A: 正常植株(CK)和發(fā)病植株(DP)盆栽圖; B: CK和DP的表型性狀; C: CK和DP的根系形態(tài)性狀; D: CK和DP的主根橫截面。A: potted healthy plants (CK) and diseased plants (DP); B: plant phenotypic traits of CK and DP; C: root traits of CK and DP; D: cross sections of taproots of CK and DP.

DP萎蔫下垂可能是由于葉片蒸騰失水而導(dǎo)致, 而植物器官的含水量是反映植物組織水分生理狀況的重要指標(biāo)。圖2表明, 根腐病影響三七各器官的含水量。DP植株的根、莖和葉含水量均顯著低于CK(≤0.05), 說明根腐病使得三七植株缺水。

圖2 細(xì)菌性根腐病對三七器官含水量的影響

CK: 對照植株; DP: 發(fā)病植株。*表示差異顯著(≤0.05)。CK: healthy plant; DP: diseased plant. * indicates significant difference between CK and DP (≤0.05).

缺水的DP和CK地上部的莖、葉外形差異不明顯, 但解剖結(jié)構(gòu)差異較大。如圖3所示, DP的株高和葉面積雖有減小, 但與CK相比并無顯著性差異。莖基部的解剖結(jié)構(gòu)表明, DP莖基部中空腐爛, 同時(shí), CK的莖呈橢圓形, 而DP的莖明顯內(nèi)陷, 呈現(xiàn)不規(guī)則形狀(圖4)。此外, 葉片組織解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)表明, 與CK相比, DP葉片上、下表皮和葉片厚度雖有所減少, 但沒有差異; 柵欄組織厚度和海綿組織厚度與CK相比略有增加, 但無顯著性差異(表1)?？傊? DP植株的莖因缺水而收縮, 莖基部內(nèi)部腐爛中空, 而葉片未對脅迫做出響應(yīng)。

圖3 細(xì)菌性根腐病對三七株高和葉面積的影響

CK: 對照植株; DP: 發(fā)病植株。CK: healthy plant; DP: diseased plant.

2.2 根腐病對三七葉綠素含量的影響

植物葉片的葉綠素含量是反映其光合性能的重要指標(biāo)。比較CK與DP葉片的葉綠素含量發(fā)現(xiàn)(圖5), CK葉片的葉綠素a和葉綠素含量顯著高于DK(≤0.05), 而葉綠素b含量及葉綠素a∶葉綠素b值差異不顯著。DP葉片葉綠素含量和葉綠素a含量較CK均下降26%, 表明DP導(dǎo)致葉片葉綠素降解, 進(jìn)而造成光能吸收和捕獲光能的能力下降。

2.3 根腐病對三七光合特性的影響

2.3.1 根腐病對三七光合氣體交換參數(shù)的影響

光合氣體交換參數(shù)的變化可直接反映脅迫對植株的傷害程度。由圖6可知, CK和DP葉片的響應(yīng)曲線表現(xiàn)出明顯的差異。CK的n隨著光照的增強(qiáng), 先上升后趨于飽和; 而DP整體呈現(xiàn)為一個波動狀態(tài)(圖6A), 不同光照強(qiáng)度下的n基本為負(fù)值。CK的ni響應(yīng)曲線(圖6B)呈正相關(guān)關(guān)系,n隨著i的升高而逐漸升高; 而DP的CO2響應(yīng)曲線則呈負(fù)相關(guān),i在450 μmol(CO2)×mol–1后,n均為負(fù)值, 說明DP葉片光合作用同化的CO2量小于呼吸作用釋放的CO2量, 只進(jìn)行呼吸作用。與CK相比, DP的s顯著降低(圖6C)。這些結(jié)果表明, DP葉肉細(xì)胞的光合能力下降, 內(nèi)部的胞間CO2濃度出現(xiàn)紊亂, 導(dǎo)致CO2過剩, 碳同化受到抑制。

圖4 細(xì)菌性根腐病對三七莖基部顯微結(jié)構(gòu)的影響

CK: 對照植株; DP: 發(fā)病植株; Ep: 表皮; Co: 皮層; VC: 維管束; Pi: 髓。CK: healthy plant; DP: diseased plant; Ep: epidermis; Co: cortex; VC: vascular bundle; Pi: pith.

表1 細(xì)菌性根腐病對三七葉片組織解剖結(jié)構(gòu)參數(shù)的影響

圖5 細(xì)菌性根腐病對三七葉片葉綠素含量的影響

CK: 對照植株; DP: 發(fā)病植株。*表示差異顯著(≤0.05)。CK: healthy plant; DP: diseased plant. * indicates significant difference between CK and DP (≤0.05).

由表2可知, DP葉片WUEinst顯著低于CK(≤0.05), 且WUEi降低85%, 表明DP的水分利用效率低, 植株水分消耗過度。AMC常用于估測RuBP case的活性, 表中DP的AMC也顯著低于CK(≤0.05)。這些結(jié)果表明DP的RuBP case活性下降、水分代謝受抑, 降低了CO2同化率, 進(jìn)而限制DP葉片的暗反應(yīng)階段。

2.3.2 根腐病對光系統(tǒng)的影響

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化常用于檢測光合機(jī)構(gòu)對環(huán)境脅迫的響應(yīng), 其中,m反映的是PSⅡ的電子傳遞情況;v/m主要反映植物葉片光合器官的生理狀態(tài), 在未受脅迫時(shí), 一般在0.80左右, 受到脅迫后該值明顯下降;m值是反映PSⅠ活性的一個指標(biāo), 可用于反映PSⅠ反應(yīng)中心復(fù)合體的數(shù)量[6,27]。由表3可知, DP葉片PSⅡ活性受到抑制, 較CK相比下降7%, 而PSⅠ活性不受影響。DP的m、m受脅迫后雖有所下降, 但無顯著性差異, 這表明DP葉片PSⅡ反應(yīng)中心發(fā)生光抑制, 能量轉(zhuǎn)換受到影響。

圖6 細(xì)菌性根腐病對三七葉片氣體交換參數(shù)的影響

CK: 對照植株; DP: 發(fā)病植株。CK: healthy plant; DP: diseased plant.

表2 細(xì)菌性根腐病對三七光合相關(guān)參數(shù)的影響

*表示差異顯著(≤0.05), 數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=7)。* indicates significant difference between CK and DP (≤0.05). Values are means ± SD (=7).

表3 三七對照植株與發(fā)病植株的PSⅡ和PSⅠ活性變化

*表示差異顯著(≤0.05), 數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(=7)。* indicates significant difference between CK and DP (≤0.05). Values are means ± SD (=7).

2.3.3 根腐病對光能分配的影響

一般來說, 葉綠體吸收的光能主要用于光合電子傳遞、熱能耗散和以葉綠素?zé)晒庑问胶纳⑦^剩的光能, 三者間存在此消彼長的關(guān)系, 因此, 可通過解析相關(guān)熒光動力學(xué)參數(shù)的變化來闡明光能利用途徑的信息[6]。

2.3.3.1 根腐病對光合電子傳遞的影響

CK和DP葉片對光合電子傳遞的響應(yīng)差異顯著(圖7)(≤0.05)CK和DP的ETR隨著光強(qiáng)的增高而升高, 172 μmol(photons)×m-2×s-1飽和之后ETR增長減緩, 其中, DP的ETR(Ⅱ)和ETR(Ⅰ)均下降70%左右。PSⅠ周圍的CEF隨著光照的增強(qiáng)被強(qiáng)烈激發(fā), 但DP的CEF激發(fā)被抑制; CEF/ETR(Ⅱ)隨PPFD逐步升高, DP顯著高于CK(≤0.05)。這些結(jié)果表明, DP抑制線性電子的傳遞(LEF), 激發(fā)CEF。

圖7 細(xì)菌性根腐病對三七葉片PSⅡ和PSⅠ光合電子傳遞的影響

CK: 對照植株; DP: 發(fā)病植株。CK: healthy plant; DP: diseased plant.

2.3.3.2 根腐病對葉綠素?zé)晒忖鐒恿W(xué)的影響

v′/m′表示PSⅡ反應(yīng)中心原初光能捕獲效率; 1-反映的是PSⅡ反應(yīng)中心的關(guān)閉程度。如圖8A、8B所示, DP的PSⅡ反應(yīng)中心大量關(guān)閉, 光能捕獲效率顯著降低。葉綠素?zé)晒忖绶譃楣饣瘜W(xué)猝滅()和非光化學(xué)猝滅(NPQ)兩個過程,表示PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額, NPQ反映PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的部分。由圖8C可知, 隨著光強(qiáng)的增加, CK的逐漸減少, 而DP的值穩(wěn)定在0.4左右; 圖8D中, DP在100 μmol(photons)×m-2×s-1光強(qiáng)后NPQ明顯低于CK(≤0.05), 表明DP的熱耗散能力被抑制。

圖8 細(xì)菌性根腐病對三七葉片熒光猝滅動力學(xué)的影響

CK: 對照植株; DP: 發(fā)病植株。CK: healthy plant; DP: diseased plant.

2.3.3.3 根腐病對PSⅡ和PSⅠ光能分配的影響

(Ⅱ)表示PSⅡ有效光化學(xué)量子產(chǎn)量, 是v′m′和共同作用的結(jié)果;(NPQ)反映葉片通過調(diào)節(jié)性的非光化學(xué)猝滅機(jī)制耗散為熱能量份額的高低, 而(NO)與植物光損傷程度有關(guān)。三七染病后, DP植株葉綠體捕獲的光能用于(Ⅱ)的能量減少(圖9A); 而用于(NPQ)的能量在快速升高后緩慢上升并逐漸達(dá)到飽和(圖9B),(NO)也在緩慢上升并趨于穩(wěn)定(圖9C)。由此表明, DP使葉片PSⅡ受到嚴(yán)重光損傷后進(jìn)而通過維持較高的熱耗散能力, 以保護(hù)和修復(fù)PSⅡ產(chǎn)生的光氧化損傷。

(ND)為PSⅠ供體側(cè)限制引起的非光化學(xué)量子產(chǎn)量, 也表示氧化態(tài)P700占全部P700的比例;(NA)表示PSⅠ受體側(cè)限制引起的非光化學(xué)量子產(chǎn)量, 即不能被氧化的處于還原態(tài)的P700所占的比例[25]。如圖9D-F所示, DP與CK在PSⅠ能量分配上有明顯的差異(≤0.05)。DP葉片(Ⅰ)隨著光照強(qiáng)度的降低而減小(圖9D);(ND)快速升高并提前飽和; 而(NA)維持在較低的水平, 但在200 μmol(photons)×m-2×s-1后,(NA)趨于穩(wěn)定且高于CK。這些參數(shù)表明, DP葉片(Ⅰ)降低是由于PSⅠ供體端電子被還原, 受體端受到限制引起的。

2.4 根腐病對快速葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線(O-J-I-P曲線)的影響

O-J-I-P曲線可提供有關(guān)PSⅡ的光化學(xué)信息, 能準(zhǔn)確反映各類脅迫對光合機(jī)構(gòu)的影響。k能反映PSⅡ供體側(cè)放氧復(fù)合體(OEC)的狀況,k越大, OEC受到的傷害越嚴(yán)重[27]。曲線上J相的變化常反映反應(yīng)中心電子從QA傳遞到QB的能力大小。DP的快速葉綠素?zé)晒馇€與CK相比, 差異顯著(≤0.05)。DP的OJIP曲線顯著高于CK(≤0.05)(圖10), 同時(shí), DP的K點(diǎn)(300 μs)相對熒光與J點(diǎn)(2 ms)相對熒光的比例(k)也顯著高于CK(≤0.05)(圖11A), 增幅為22%, 說明OEC受到損傷; J點(diǎn)相對可變熒光強(qiáng)度(j)上升48%(圖11B)。這些結(jié)果表明DP葉片PSⅡ的供體側(cè)(k)和受體側(cè)(j)均受到損傷[28]。

圖9 細(xì)菌性根腐病對三七葉片中光能分配的影響

CK: 對照植株; DP: 發(fā)病植株。CK: Healthy plant; DP: Diseased plant.

3 討論

3.1 三七植株形態(tài)結(jié)構(gòu)對細(xì)菌性根腐病的響應(yīng)

病原侵染導(dǎo)致植株內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 進(jìn)而使植物的外部和內(nèi)部表現(xiàn)出病態(tài)[1]。受到根腐病脅迫的大豆(), 根和莖變褐腐爛, 下部葉片脈間變黃, 上部葉片褪綠, 嚴(yán)重時(shí)植株萎蔫死亡[29]。本研究中, DP主根腐爛, 須根斷損, 韌皮部變褐(圖1), 說明假單胞桿菌侵染三七植株后, 三七根系受損, 根毛無法正常吸收水分, 導(dǎo)致植株內(nèi)部水分供應(yīng)不足。而DP的株高、葉片大小(圖3)和葉片解剖結(jié)構(gòu)(表1)與CK相比, 均無顯著性差異, 這一結(jié)果與先前研究大豆根腐病會使地上部生長發(fā)育受抑、葉片組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的結(jié)論有所差異[29], 這是因?yàn)榧?xì)菌性萎蔫發(fā)展快, 植株死亡也快, 對株高、葉片大小及解剖結(jié)構(gòu)還未造成影響。但是, 細(xì)菌性根腐病會影響三七莖基部結(jié)構(gòu)。本研究中, DP莖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)顯示植株莖稈內(nèi)陷(圖4), 這與王曉森等[30]發(fā)現(xiàn)棉花()在干旱脅迫下莖稈收縮的研究結(jié)果類似, 表明DP的莖因根系吸水無法滿足蒸騰而產(chǎn)生失水收縮, 這可能與病原菌有關(guān), 因?yàn)楦≡鷱母康膫谇秩胫燎o, 導(dǎo)致莖的導(dǎo)管變黑, 進(jìn)而使水分運(yùn)輸受阻。這一結(jié)果與前人研究報(bào)道的細(xì)菌性根腐病會造成三七莖基部腐爛中空的結(jié)論一致[14]。因此, 根腐病對三七各器官的損傷程度為: 根>莖>葉, 這種差異一方面與病原菌的侵染有關(guān), 另一方面與植物吸收、運(yùn)輸水分過程有關(guān)。

圖10 細(xì)菌性根腐病對三七葉片快速葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)曲線(O-K-J-I-P曲線)的影響

CK: 對照植株; DP: 發(fā)病植株。O、K、J、I 和P分別代表時(shí)間為20 μs、300 μs、2 ms、30 ms和300 ms的熒光。O, K, J, I and P represent the fluorescence at time=20 μs, 300 μs, 2 ms, 30 ms, and 300 ms, respectively. CK: healthy plant; DP: diseased plant.

圖11 細(xì)菌性根腐病對三七葉綠素可變熒光Fk占Fo-Fj振幅的比例(Wk, A)與可變熒光Fj占Fo-Fp振幅比例(Vj, B)的影響

*表示差異顯著(≤0.05)。* indicates significant difference between CK and DP (≤0.05).

3.2 細(xì)菌性根腐病誘導(dǎo)植株缺水

植物組織含水量是反映植物水分狀況的重要參數(shù)之一。孫冬梅等[31]研究發(fā)現(xiàn), 小麥葉枯性病害使得小麥病葉水分運(yùn)轉(zhuǎn)受阻而缺水。本研究結(jié)果中, DP的根、莖和葉含水量均顯著低于CK, 表明根腐病誘發(fā)三七各器官缺水(圖2)。另一方面, 水分利用效率(WUE)也可用于反映植物的水分狀況。WUE是指水分產(chǎn)出與消耗的比率, 是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要指標(biāo)[32]。在葉片中, 水分利用效率分為內(nèi)稟水分利用效率(WUEi)和瞬時(shí)水分利用效率(WUEinst), 其中WUEinst用于評估環(huán)境因素對植物的影響, 但易受外界因素影響, 無法真實(shí)地反映作物本身的水分利用特性; 為剔除大氣干濕條件的影響, WUEi被提出可用于估算不同物種或基因?qū)χ参锼掷锰匦缘挠绊慬21]。因此, 結(jié)合WUEi與WUEinst可更加全面地反映出根腐三七的水分利用效率情況。本研究中, DP的WUEi和WUEinst均顯著低于CK(表2), 排除土壤水分(土壤相對含水量60%左右)對三七的影響, 說明根腐三七因根系吸水受到限制, 進(jìn)而影響植株內(nèi)部的水分利用。由此說明, 根腐使得三七植株的根、莖和葉失水, 且抑制葉片的水分利用。

3.3 細(xì)菌性根腐病使三七光合能力下降

植物光合能力與葉片葉綠素、s、i等因素密切相關(guān)。葉綠素是植物葉綠體中捕獲光能的主要功能分子, 其含量的多少直接影響著植物吸收光能的量[33]。大量研究表明, 病原物侵染能引起植物葉片葉綠素降解, 本研究結(jié)果(圖5)與染病的煙草和大豆葉片的研究結(jié)果相同[29,34], 表明假單胞桿菌侵染導(dǎo)致三七葉片光合色素含量降低, 有效光合面積減少, 從而抑制光合能力。一般來說, 植物受到脅迫時(shí), 導(dǎo)致光合作用下降的因素包括氣孔限制和非氣孔限制[35]。如果s和i同時(shí)下降, 說明氣孔因素是引起n下降的主要原因; 若是s下降, 而i上升, 則認(rèn)為n下降主要是由非氣孔因素引起[36]。前人研究表明, 煙草和空心蓮子草()在受到病原物侵染后, 葉綠體結(jié)構(gòu)受到破壞, 非氣孔限制阻礙了CO2的利用, 從而造成細(xì)胞間隙CO2積累, 導(dǎo)致n降低[34,37]。在本研究中, DP的n和i呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,sAMC顯著下降(圖6, 表2), 表明n下降是由RuBP case活性下降導(dǎo)致CO2的同化率低, 造成細(xì)胞間隙CO2積累等非氣孔因素引起的, 但與左應(yīng)梅等[38]研究發(fā)現(xiàn)水分虧缺并不會影響三七葉片的光合作用的結(jié)果不同, 這可能與根腐病原菌侵染和水分虧缺雙重脅迫有關(guān), 因?yàn)槿呤芗賳伟麠U菌侵染后, 病菌孢子阻礙水分向上運(yùn)輸, 但葉片一直保持高蒸騰水平, 水分利用率大幅下降, 使得植株長時(shí)間處于缺水狀態(tài), 進(jìn)而影響光合效率?？傊? DP導(dǎo)致n下降是由于葉片葉綠素降解、細(xì)胞間隙CO2積累以及葉片蒸騰失水等因素導(dǎo)致。

3.4 細(xì)菌性根腐病使三七PSⅡ受損

光系統(tǒng)是植物光合機(jī)構(gòu)對外界脅迫的敏感部位,其中PSⅡ被認(rèn)為是光抑制的原初位點(diǎn), 在強(qiáng)光、低溫、干旱、病害等脅迫下均會發(fā)生光抑制, 而PSⅠ一般是在低溫強(qiáng)光條件下發(fā)生光抑制[6,39]。v/m和m下降是光合作用PSⅠ和PSⅡ發(fā)生光抑制的顯著特征[40]。大量研究發(fā)現(xiàn), 病原物對兩個光系統(tǒng)的影響并不是等同的, 病原侵染后主要作用于PSⅡ, 這在煙草和蘋果()等植物中均得到證實(shí)[41-42]。本研究中DP處理下v/m降低,m值保持穩(wěn)定(表3), 由此說明相同光照下DP的PSⅡ易發(fā)生光抑制, 而PSⅠ對病害不敏感。

為減少光抑制造成的傷害, 植物形成了一系列光保護(hù)機(jī)制, 而增強(qiáng)光能的耗散被認(rèn)為是保護(hù)PSⅡ免受病害脅迫的重要機(jī)制之一, 這在病原菌侵染后的煙草和蠶豆()等植物中均得到證實(shí)[43-44]。本研究中, DP表現(xiàn)出較低的ETR(Ⅱ)、(Ⅱ)和NPQ, 較高的(NO)和(NPQ)(圖7-9), 說明葉片失水后LEF受到抑制, 由電子傳遞產(chǎn)生的跨類囊體膜質(zhì)子梯度也受到影響, 從而使依賴于跨類囊體膜質(zhì)子梯度激發(fā)的NPQ也降低, 導(dǎo)致葉片不能將過剩的光能以熱或光化學(xué)形式耗散, 誘發(fā)PSⅡ光損傷[27]。PSⅡ的損傷首先發(fā)生在OEC, 而O-J-I-P曲線中K相的出現(xiàn)被作為衡量OEC損傷的指標(biāo)[27]。核盤菌()侵染黃瓜()后, K點(diǎn)出現(xiàn)、k值上升, 說明OEC活性被抑制[45], 本研究DP處理的結(jié)果與此相似, 不同的是DP的j(48%)升幅大于k(22%), 表明OEC受到損傷的同時(shí), 還抑制PSⅡ供體側(cè)和受體側(cè), 且受體側(cè)損傷重于供體側(cè)[28,46]?？傊? DP導(dǎo)致PSⅡ光損傷的主要原因是葉片PSⅡ供體側(cè)的OEC活性被抑制, 受體側(cè)的電子傳遞被阻礙。

圍繞PSⅠ的CEF在保護(hù)光合機(jī)構(gòu)方面有重要作用。由CEF介導(dǎo)的ATP可用于PSⅡ光損傷的修復(fù)[27]。但有研究表明, 病原物侵染會抑制PSⅡ的修復(fù)[47]。靶斑病菌()侵染高粱()葉片后, 活性氧被大量積累, D1蛋白的合成被抑制, 進(jìn)而影響PSⅡ反應(yīng)中心的修復(fù)[47]。本研究中, DP的光反應(yīng)階段被抑制, 導(dǎo)致光合碳同化能力低, 合成ATP少, PSⅡ損傷速率大于修復(fù)速率, 過量積累活性氧, 使PSⅡ受到不可逆損傷。另一方面, CEF的激發(fā)會降低PSⅠ受體端電子的積累, 減輕電子鏈過度還原而引起的氧化傷害[27,39]。但本研究DP下(ND)、(NA)均升高(圖9), CEF減少(圖7), 說明CEF的激發(fā)被抑制, 導(dǎo)致PSⅠ受體端的電子過度積累, 進(jìn)而引起PSⅠ反應(yīng)中心鐵硫蛋白的過度還原, 并產(chǎn)生超氧陰離子, 最終損傷PSⅠ。也就是說, 受病害脅迫的葉片會激活CEF, 但可能因活性氧和超氧陰離子在光系統(tǒng)處的大量積累, 使CEF無法發(fā)揮保護(hù)光合機(jī)構(gòu)的作用, 最終導(dǎo)致三七無法進(jìn)行光合作用。

3.5 三七細(xì)菌性根腐病的病程特征

植物受病原物的感染, 一般經(jīng)過生理病變和組織病變后, 最后才在外部出現(xiàn)有別于正常植株的形態(tài)病變[1]。結(jié)合其他作物病程特征[1,29], 推測出三七細(xì)菌性根腐病的大致病程為: 三七受假單胞桿菌侵染后, 細(xì)菌為爭奪三七養(yǎng)分, 先破壞寄主植株養(yǎng)分輸導(dǎo)系統(tǒng), 改變代謝平衡及一些酶的活性, 進(jìn)而抑制光合作用, 增強(qiáng)呼吸作用, 合成一系列拮抗性酶類和化學(xué)物質(zhì); 隨著細(xì)菌的深入, 假單胞桿菌在三七體內(nèi)獲得生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)和空間后, 在蘆頭與芽基結(jié)合處出現(xiàn)褐色水漬狀病變, 阻塞導(dǎo)管, 地上部葉片的色素含量相應(yīng)減少; 進(jìn)一步病變, 主根變褐腐爛, 莖稈失水收縮, 葉片萎蔫下垂。病變加重后, 根系腐爛, 莖稈基部腐爛中空, 葉片干枯; 最后, 全株失水, 植株積累高含量的自由基, 細(xì)胞壞死, 植株枯萎死亡。

4 結(jié)論

細(xì)菌性根腐病導(dǎo)致三七主根褐變腐爛, 須根斷損, 莖基部腐爛中空, 莖稈失水收縮, 葉片蒸騰過度而萎蔫。同時(shí), 根腐病誘導(dǎo)的缺水使三七葉片葉綠素降解, PSⅡ供體側(cè)的OEC活性受損, 受體側(cè)電子傳遞被抑制, 反應(yīng)中心受到不可逆損傷, PSⅠ受體端電子過度還原, 進(jìn)而導(dǎo)致葉肉細(xì)胞CO2的同化能力降低, 從而抑制細(xì)菌性根腐三七植株的光合速率。

然而, 細(xì)菌性根腐病不僅僅會導(dǎo)致植株缺水, 還可造成自由基毒性的積累、缺氧等脅迫, 但因缺水是造成植株死亡的直接原因, 因此, 本研究僅側(cè)重于探討根腐病誘導(dǎo)的缺水對三七植株光合生理特性的影響。此外, 本研究僅僅關(guān)注三七形態(tài)病變后的光合生理特性, 而細(xì)菌侵入后引起的一系列免疫反應(yīng)(如活性氧積累和清除)還需進(jìn)一步的研究討論, 以期為三七病害生理學(xué)研究提供充實(shí)的理論依據(jù)。

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Effects of bacterial root rot on photosynthetic characteristics in*

WU Hongmin1,2,3, SHA Bencai1,2, ZHANG Jinyan1,2,3, CUN Zhu1,2,3, CHEN Junwen1,2,3**

(1. National & Local Joint Engineering Research Center on Germplasm Innovation & Utilization of Chinese Medicinal Materials in Southwestern China, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2. Key Laboratory of Medicinal Plant Biology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 3. College of Agronomy and Biotechnology, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

Root rot is an important factor that has threatened the cultivation of, with an incidence rate of 5% to 20%. Bacterial root rot caused bymight only be discovered after infected leaves have wilted, and by then there will no longer be any effective control measures. The objective of this study was to explore the differences in effects of bacterial root rot on the photosynthetic physiological characteristics between control (CK) and diseased plants (DP), thus providing a theoretical basis for the understanding of disease physiology in. The results showed that the taproot of DP was browned and rotted from root rot, accompanied by broken fibrous roots, decay and hollow stems, withering leaves, and low water content. There was no significant difference in plant height, leaf area, and thickness of leaf antomical strucutres (including thickness of upper epidermis, lower epidermis, palisade tissue, and sponge tissue) between DP and CK. However, the chlorophyll content, net photosynthetic rate (n), stomatal conductance (s), instantaneous water use efficiency (WUEinst), intrinsic water use efficiency (WUEi), and apparent mesophyll conductance (AMC) were significantly lower in DP than in CK (≤0.05), with intercellular CO2concentration (i) inversely proportional tonin DP individuals. The maximum fluorescence signal of the P700 reaction center (m) in DP was not affected during the period of initial infection, but the maximum quantum efficiency of photosystem Ⅱ (PSⅡ) under dark adaptation (vm), electron transfer rate of PSⅡ [ETR(Ⅱ)], actual photochemical quantum yields of PSⅡ [(Ⅱ)], electron transfer rate of PSⅠ[ETR(Ⅰ)], cyclic electron flow around PSI (CEF), and actual photochemical quantum yields of PSⅠ [(Ⅰ)] were significantly lower in DP than in CK (≤0.05). Additionally, the fraction of energy passively dissipated in the forms of heat and fluorescence [(NO)] were significantly higher in DP than in CK (≤0.05). Furthermore, The K phase in the fast chlorophyll fluorescence kinetic curves was significantly higher in DP than in CK (≤0.05). Overall, the degree of damage for the various organs of DP was: root>stem>leaf. Root rot significantly degraded leaf chlorophyll, along with irreversible damage to PSⅡ and inhibition of PSⅠelectron transfer and reduced the assimilation ability of mesophyll cells, consequently restricting photosynthetic performance.

; Bacterial root rot; Water shortage; Leaf anatomical structure; Photosynthetic characteristics; Chlorophyll fluorescence

, E-mail: cjw31412@163.com

Apr. 8, 2020;

Jul. 1, 2020

S567.5+3

10.13930/j.cnki.cjea.200266

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* 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81860676, 81360609)和云南省科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2017ZF001, 2016ZF001)資助

陳軍文, 主要研究方向?yàn)樗幱弥参镔Y源與生態(tài)種植。E-mail: cjw31412@163.com

武洪敏, 主要研究方向?yàn)樗幱弥参锷砩鷳B(tài)。E-mail: 1071251844@qq.com

2020-04-08

2020-07-01

* This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81860676, 81360609) and the Key Science and Technology Project of Yunnan Province (2017ZF001, 2016ZF001).