一種大白菜新型甘藍(lán)型油菜CMS快速鑒定方法及應(yīng)用

劉曉東，李海山，孟 川，王玉海，吳 芳，牟金貴，馬俊賢,王明秋

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，河北省蔬菜工程技術(shù)中心，河北 石家莊 050051；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院， 河北 石家莊 050031;3.河北省市場(chǎng)監(jiān)督管理局,河北 石家莊 050091)

大白菜(Brassicarapapekinensis)是我國(guó)北方重要的蔬菜作物，育種方式仍以雜交育種為主，重點(diǎn)在于雜交親本的選育。經(jīng)歷了自交系育種、自交不親和系育種、雄性不育系育種3個(gè)階段，通過(guò)回交轉(zhuǎn)育、抗病聚合、品質(zhì)篩選等多種技術(shù)手段，實(shí)現(xiàn)了新資源、新品種的創(chuàng)新選育。利用植物雄性不育系進(jìn)行雜交種的選育，已成為當(dāng)前育種的主要手段之一。自20世紀(jì)70年代中國(guó)學(xué)者開(kāi)展大白菜雄性不育系的選育與利用以來(lái)，先后有譚其猛[1]、張書(shū)芳[2]、馮輝[3]、柯桂蘭[4]、孫日飛[5]、張德雙[6]等分別育成了核隱性雄性不育系、核基因互作型雄性不育系、復(fù)等位基因型雄性不育系、甘藍(lán)型油菜PolCMS、新型蘿卜胞質(zhì)CMS、新型甘藍(lán)型油菜CMS等材料，并育成了相關(guān)的品種。

然而在雄性不育系選育與利用過(guò)程中仍然存在一些問(wèn)題，如利用核隱性雄性不育系制種，不育系存在50%的可育株，不但雜交種純度難以保障，拔除可育株[7-8]費(fèi)工費(fèi)力而且降低單位面積產(chǎn)量；采用100%核基因雄性不育系，因采用三系配套，雜交制種實(shí)際上為三交種，若甲型“兩用系”與“保持系”遺傳基礎(chǔ)差距較大時(shí)，易出現(xiàn)F1不整齊現(xiàn)象[9]；采用PolCMS不育系配制雜交種，因PolCMS具有對(duì)環(huán)境敏感的特性，在溫度變化時(shí)極易恢復(fù)育性，造成雜交純度降低的問(wèn)題[10]。而新型甘藍(lán)型油菜CMS具有不育性穩(wěn)定、蜜腺正常、配合力好的特點(diǎn)，可以作為大白菜細(xì)胞質(zhì)不育系材料創(chuàng)制的不育源。

目前，采用分子標(biāo)記的方法對(duì)不同細(xì)胞質(zhì)不育類(lèi)型進(jìn)行鑒定，主要利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的遺傳標(biāo)記，進(jìn)行分子鑒定，存在需要從蘿卜OguCMS特異性核苷酸序列orf138[11]，甘藍(lán)型油菜PolCMS特異性核苷酸序列orf222[12]、orf224[13]中選取多對(duì)標(biāo)記引物才能從大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中鑒定出新型甘藍(lán)型油菜CMS的問(wèn)題，本研究通過(guò)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一對(duì)引物即可快速鑒定新型甘藍(lán)型油菜CMS的分子標(biāo)記，以不同時(shí)期回交轉(zhuǎn)育獲得的不同類(lèi)型雄性不育系材料為試材，以現(xiàn)有的引物進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定為對(duì)照，建立了一種快速鑒定新型甘藍(lán)型油菜CMS的方法，并對(duì)回交轉(zhuǎn)育了該基因的雄性不育系材料進(jìn)行了鑒定。

1 材料和方法

本試驗(yàn)于2014年8月11日對(duì)CMS-AM41、CMS-AQ29、CMS后36高進(jìn)行播種，苗期選取細(xì)胞分生能力最強(qiáng)的大小約2 cm2柔嫩心葉，每株1～2 g，進(jìn)行DNA提取。依據(jù)orf138、orf222、orf2243個(gè)基因序列，通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)引物擴(kuò)增分子標(biāo)記進(jìn)行不育類(lèi)型分析鑒定，篩選出新型甘藍(lán)型油菜CMS不育材料。以設(shè)計(jì)的新引物分子標(biāo)記鑒定轉(zhuǎn)育四倍體不育系CMS-D571、CMS-D574和相應(yīng)保持系D571、D574。

通過(guò)對(duì)比orf138、orf222、orf2243個(gè)線粒體特異核苷酸序列，采用引入錯(cuò)配堿基的方法[14]，設(shè)計(jì)專(zhuān)用型引物，并對(duì)利用新型甘藍(lán)型油菜CMS轉(zhuǎn)育的四倍體雄性不育系進(jìn)行鑒定。

試驗(yàn)采用CTAB基因提取法[15]提取待測(cè)樣品的基因組DNA，以待測(cè)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系大白菜樣品的基因組DNA為模板，以不同引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系為：總體積20 μL，Buffer 2.0 μL，dNTP 0.4 μL，正反引物(10×)各0.5 μL，gDNA(2.5～5.0 ng/μL)模板1 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，加ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。

PCR反應(yīng)試劑Buffer、TaqDNA聚合酶為北京全式金公司Trans Gen Biotech的PCR反應(yīng)試劑盒；反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃復(fù)性30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存10 min[16-18]。

核苷酸序列通過(guò)在線序列比對(duì)軟件MulAlin對(duì)其進(jìn)行比對(duì)。

擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)：將PCR產(chǎn)物用加有EB(溴化乙啶)的1%瓊脂糖在100～120 V的電壓下電泳30～40 min，最終在凝膠成像系統(tǒng)上顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜新型甘藍(lán)型油菜CMS不育材料的篩選

對(duì)3種不育類(lèi)型的CMS-AM41、CMS-AQ29、CMS后36高鑒定采用現(xiàn)有的技術(shù)引物開(kāi)展RAPD分子標(biāo)記，依據(jù)3種不育類(lèi)型基因特異片段orf138、orf222、orf224的差異性設(shè)計(jì)出引物，利用orf138、orf222、orf224擴(kuò)增的引物核苷酸序列如表1所示。

經(jīng)PCR擴(kuò)增電泳凝膠成像顯示，由圖1可知泳道1-3為CMS后36高3次重復(fù)，利用orf138和orf222的2種引物擴(kuò)增后，分別擴(kuò)增出300，700 bp的DNA片段，表明CMS后36高為新型甘藍(lán)型油菜CMS類(lèi)型；泳道4-6為CMS-AQ293次重復(fù)，利用orf138的引物未擴(kuò)增出DNA片段，而利用orf222的引物擴(kuò)增出了700 bp的DNA序列，且利用orf224的引物擴(kuò)增出了650 bp的DNA片段，準(zhǔn)確表明CMS-AQ29為PolCMS類(lèi)型；泳道7，8為CMS-AM41的保持系M41的2次重復(fù)，3種引物均未擴(kuò)增出DNA片段，表明M41為自交系，與實(shí)際吻合；泳道9，10為CMS-AM41的2次重復(fù)，利用orf138的引物擴(kuò)增出了300 bp的DNA片段，而利用orf222的引物并未擴(kuò)增出DNA序列，表明CMS-AM41為OguCMS類(lèi)型。CMS后36高為篩選的特定雄性不育源。

表1 利用orf138、orf222、orf224基因片段擴(kuò)增引物Tab.1 Primer amplification according to orf138, orf222, orf224

M.Marker;1-3.CMS后36高；4-6.CMS-AQ29；7,8.M41；9,10.CMS-AM41。 M.Marker; 1-3.CMS hou36gao; 4-6.CMS-AQ29; 7,8.M41; 9,10.CMS-AM41.

2.2 Pol CMS與新型甘藍(lán)型油菜CMS經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列差異分析

依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中orf222引物在PolCMS與新型甘藍(lán)型油菜CMS的大白菜DNA中均能擴(kuò)增出700 bp左右的片段，經(jīng)測(cè)序?qū)Ρ?種類(lèi)型雄性不育系PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列，篩選差異序列。

以提取的分別含有PolCMS不育基因的CMS-AQ29基因組DNA和含有新型甘藍(lán)型油菜CMS不育基因的CMS后36高基因組DNA為模板，通過(guò)引物orf222進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 經(jīng)在線序列對(duì)比軟件MulAlin對(duì)其進(jìn)行比對(duì)，如圖2所示，2組序列同源性高達(dá)84.44%，差異性較明顯的序列片段位于180～210 bp。

圖2 CMS后36高與CMS-AQ29擴(kuò)增核苷酸序列差異性對(duì)比Fig.2 Comparison of CMS hou36gao and CMS-AQ29 amplified nucleotide sequences

2.3 新型甘藍(lán)型油菜CMS專(zhuān)用引物O-2的設(shè)計(jì)

依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列orf222-Pol和orf222-New CMS(圖2)設(shè)計(jì)引物。在其上游引物 Fw:5′-AAGCTTGGTGGAAAAGATCGTA-3′的3′端引入T/G錯(cuò)配堿基，引入后序列變更為Fw:5′-AAGCTTGGT GGAAAAGATCGGA-3′，堿基錯(cuò)配降低了引物與其3′末端互補(bǔ)模板之間的延伸。從而使得新設(shè)計(jì)的引物不能以甘藍(lán)型油菜PolCMS的大白菜DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，因此,成為鑒定新型甘藍(lán)型油菜CMS大白菜的特異引物。該引物定名為“O-2”，其核苷酸序列為：

Fw: 5′-AAGCTTGGTGGAAAAGATCGGA-3′，Rv: 5′-GATTTCGTTCACCTTGGCTCT-3′。

以提取的CMS后36高基因組DNA為模板，通過(guò)引物O-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，大小為474 bp,核苷酸測(cè)序如圖3所示。

2.4 不同引物分子標(biāo)記鑒定新型甘藍(lán)型油菜雄性不育系及其保持系

以轉(zhuǎn)育了新型甘藍(lán)型油菜CMS的四倍體大白菜材料 CMS-D571、CMS-D574和相應(yīng)的保持系D571、D574為試材，通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)引物進(jìn)行分子標(biāo)記，如圖4所示，經(jīng)orf138、orf222鑒定，CMS-D571>(泳道1-3)、CMS-D574(泳道9，10)分別在300，700 bp處形成亮帶，而orf224相應(yīng)位置無(wú)亮帶，表明CMS-D571、CMS-D574成功轉(zhuǎn)育為了新型甘藍(lán)型油菜CMS，而保持系D571(泳道4-6)、D574(泳道7，8)試驗(yàn)中未檢出相關(guān)基因。

圖3 利用新型引物 O-2 擴(kuò)增出的核苷酸序列Fig.3 Nucleotide sequences amplified using novel primer O-2

M.Marker;1-3.CMS-D571；4-6.D571；7,8.D574；9,10.CMS-D574；11.ddH2O。圖5同。 M.Marker; 1-3.CMS-D571; 4-6.D571; 7,8.D574; 9,10.CMS-D574; 11.ddH2O.The same as Fig.5.

分別以CMS-D571、D571、D574、CMS-D574的DNA為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)的新型引物O-2進(jìn)行核苷酸序列擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。CMS-D571和CMS-D574均在470 bp處擴(kuò)增出了產(chǎn)物，證實(shí)為成功轉(zhuǎn)育了新型甘藍(lán)型油菜CMS的雄性不育系材料，而保持系D571和D574則未擴(kuò)增出產(chǎn)物，為自交系材料。

圖5 采用O-2引物對(duì)CMS-D571、D571、D574、 CMS-D574雄性不育分子標(biāo)記鑒定Fig.5 Molecular marker identification of male sterility lines CMS-D571, D571, D574, CMS-D574 by O-2 primer

3 討論

張德雙[19]、王國(guó)芳等[20]對(duì)3種不育類(lèi)型的鑒定采用RAPD分子標(biāo)記法，找出3種不育類(lèi)型基因的特異片段進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)核苷酸系列的差異性設(shè)計(jì)引物，并轉(zhuǎn)換為SCAR標(biāo)記：orf138、orf222、orf224。但orf138在OguCMS與新型甘藍(lán)型油菜CMS的DNA序列中均能擴(kuò)增出300 bp大小的片段。orf222在PolCMS與新型甘藍(lán)型油菜CMS的DNA序列中同樣能擴(kuò)增出700 bp大小的片段，orf224只能在PolCMS的DNA序列中能擴(kuò)增出650 bp大小片段。

本研究通過(guò)采用現(xiàn)有技術(shù)引物，從已掌握的二倍體大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中篩選出了含有新型甘藍(lán)型油菜CMS的不育系材料CMS后36高和含有PolCMS不育基因的CMS-AQ29，通過(guò)核苷酸測(cè)序?qū)Ρ?，篩選出了位于180～210 bp差異性較明顯的序列片段。通過(guò)堿基錯(cuò)配，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了一對(duì)引物O-2，對(duì)轉(zhuǎn)育了新型甘藍(lán)型油菜CMS的大白菜材料進(jìn)行PCR核苷酸擴(kuò)增，經(jīng)電泳凝膠成像可在470 bp處形成亮帶，而新引物不能以PolCMS的大白菜DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，成為鑒定新型甘藍(lán)型油菜CMS大白菜的特異引物。

利用該引物建立的快速鑒定新型甘藍(lán)型油菜CMS的方法，擴(kuò)增出的條帶清晰，該分子標(biāo)記具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，從DNA水平上鑒定了細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的大白菜品種，提高了準(zhǔn)確性。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中需要多對(duì)引物才能鑒定大白菜是否為新型甘藍(lán)型油菜CMS的問(wèn)題，大大減少了鑒定工作量，提高了檢測(cè)效率，對(duì)于促進(jìn)利用大白菜雄性不育系育種進(jìn)程具有重要意義。