轉(zhuǎn)錄組測序法研究草珊瑚葉和根的基因差異表達

車蘇容 張家源 盧偉 祁克明 魏藝聰

滴要：[目的]從基因表達的水平，初步分析草珊瑚葉和根之間次生代謝差異的分子機制，為二者之間臨床療效差異形成的分子機制分析提供信息。[方法]以福建省福州市的草珊瑚作為樣品，采用lluminaHiSeqTM高通量測序技術(shù)測定草珊瑚葉和根的轉(zhuǎn)錄組，然后經(jīng)過濾和Trinity組裝，得到的unigenes再通過blast與Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-Prot、Kegg和GO進行比對注釋，并對葉和根的基因差異表達進行分析，尤其是對KEGG代謝通路富集的差異基因進行分析。[結(jié)果]轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果共獲得0.4億多個cleanreads，經(jīng)Trinity組裝后共得到508271個unigenes，其平均長度為740bp，最大長度為17.3kb?；赽last分析，共有148561個unigenes在七大功能注釋數(shù)據(jù)庫中得到成功注釋，占總基因數(shù)的58.80%。在分析基因表達水平差異時，發(fā)現(xiàn)草珊瑚葉和根的共同基因有93127個，葉和根的差異基因分別為36327個和52268個;同時還發(fā)現(xiàn)在29732種不同表達的unigenes中，有12511個上調(diào)基因和17221個下調(diào)基因;代謝相關(guān)KEGG具有顯著差異的通路有淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷類生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、光合生物的固碳作用、吞噬體、谷胱甘肽代謝、光合作用、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、倍半萜類和三萜類生物合成、卟啉和葉綠素代謝、氮素代謝、晝夜節(jié)律一植物、光合作用一天線蛋白、芪類、二芳基庚酸和姜酚生物合成、不飽和脂肪酸生物合成、檸檬烯和蒎烯降解、類胡蘿卜素生物合成、二萜類生物合成、類黃酮生物合成、脂肪酸延伸等。其中與藥效密切相關(guān)的次生代謝通路苯丙烷類、倍半萜類和三萜類、二萜類、類黃酮類生物合成等途徑分別有193個、82個、40個、35個差異表達基因，而上調(diào)倍半萜合酶、ent-kaur-16-烯合酶、黃酮醇合酶/黃烷酮3-羥化酶等基因和下調(diào)8-羥基香葉醇脫氫酶、vinorine合酶、角鯊烯合酶等關(guān)鍵酶基因差異顯著。[結(jié)論]草珊瑚葉和根中苯丙烷類、倍半萜類和三萜類、二萜類、類黃酮次生代謝途徑的相關(guān)基因差異最為顯著，其中差異顯著的關(guān)鍵酶基因可為分析其葉和根之間次生代謝差異的分子機制提供重要信息。

關(guān)鍵詞：草珊瑚;葉;根;Illumina測序;基因差異表達分析;次生代謝

中圖分類號：R932

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）060598-13

[研究意義]草珊瑚，又名腫節(jié)風、九節(jié)風、接骨木、接骨金粟蘭等，是金粟蘭科草珊瑚屬植物草珊瑚Sarcandraglabra（Thunb.）Nakai的干燥全草叫。在2015年版《中國藥典》中的草珊瑚是以腫節(jié)風收載，其性平，味苦、辛，歸心、肝經(jīng)，具有清熱涼血，活血消斑，祛風通絡(luò)的功效，用于治療血熱發(fā)斑發(fā)疹，風濕痹痛，跌打損傷。民族用藥中，苗藥關(guān)于草珊瑚療效的記載和藥典大致相同，但特別加以記錄了臨床上不同部位的不同功效主治，如：莖、葉主治頭暈、夏季濕病;葉主治骨折，根主治痢疾、胃痛、肝風、跌打腫痛”。目前已從草珊瑚中分離出黃酮類、倍半萜類、香豆素類、有機酸類的活性成分，還得到了較為豐富的揮發(fā)油！、氨基酸和微量元素等成分，現(xiàn)代藥理研究顯示草珊瑚具有抗腫瘤、抗癌、抗菌、抗病毒、消炎鎮(zhèn)痛、對白細胞和血小板的影響、抗胃潰瘍、祛痰平喘、促進骨折愈合、調(diào)整機體免疫的作用因此，若能從分子水平研究草珊瑚不同部位次生代謝調(diào)控基因表達差異的相關(guān)信息，將更好地為草珊瑚藥用價值的分析提供線索，對有效利用草珊瑚資源具有重要意義。[前人研究進展]近年來，高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)日益發(fā)展，在藥用植物轉(zhuǎn)錄組測序方面也已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用?，F(xiàn)有的技術(shù)可以通過測定不同品種、不同采收期、不同產(chǎn)地、不同入藥部位等藥用植物轉(zhuǎn)錄組信息，整體地研究藥效成分相關(guān)酶基因的表達情況，進而發(fā)現(xiàn)其次生代謝產(chǎn)物的合成途徑及其調(diào)控機制凹。唐娟巧對三種不同品種的茯苓進行了轉(zhuǎn)錄組測序，研究了其基因的差異表達和可能與茯苓多糖含量有關(guān)的關(guān)鍵基因;鄧楠等叫研究了不同發(fā)芽時期麻黃種子在萌發(fā)時的相關(guān)基因及重要基因的表達情況;謝冬梅等5研究了道地藥材丹皮和非道地丹皮之間的基因表達差異，為道地性的形成闡明機制;陳延清等心建立了冬凌草葉和莖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫;朱孝軒對長春花的葉、花、根的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行分析，得出了不同藥用部位中基因的表達差異。[本研究切人點]目前尚未見涉及轉(zhuǎn)錄組測序法研究草珊瑚不同部位基因差異表達的報道。[擬解決的關(guān)鍵問題]本試驗通過lluminaHiSeqTM高通量測序技術(shù)來獲得草珊瑚葉和根的轉(zhuǎn)錄組信息，從基因表達的角度，分析草珊瑚葉和根之間基因表達差異，為二者之間可能存在的次生代謝差異分析提供信息，為草珊瑚葉和根不同藥用價值分析提供參考，有利于草珊瑚葉和根資源的精準利用。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗樣品取自福建省福州市閩侯縣（東經(jīng)1191057.54"，北緯2604'36.10"），經(jīng)福建中醫(yī)藥大學盧偉教授鑒定為金粟蘭科植物草珊瑚Sarcandraglabra（Thunb.）Nakai。分別取林下種植、5年生的同一居群的3株草珊瑚葉和根樣本各3份，編號分別為L1、L2、L3和R1、R2、R3，經(jīng)過清洗、千燥后立即在液氮中冷凍并儲存于-80C備用。

1.2基因文庫的構(gòu)建與RNA測序

使用TRIzol試劑盒分別提取草珊瑚樣品中葉和根的總RNA，經(jīng)檢測合格后，富集各自的mRNA，并以此模板進一步合成雙鏈cDNA，再經(jīng)純化處理、選擇合適的片段大小，最后通過PCR技術(shù)擴增，并純化PCR產(chǎn)物以獲得基因文庫。庫檢合格后，最終通過IlluminaHiSeqTM進行高通量測序。

1.3數(shù)據(jù)的篩選與轉(zhuǎn)錄本的組裝

使用Trinity軟件8將得到的rawreads進行過濾純化，去除帶接頭的reads、無法確定堿基信息比例大于10%的reads和低質(zhì)量的reads（質(zhì)量值Qphred《=20的堿基數(shù)占整個reads的50%以上的reads），得到cleanreads。再對cleanreads進行組裝，得到轉(zhuǎn)錄本序列。再使用Corset對轉(zhuǎn)錄本進行層次聚類，得到最終unigene。

進一步分析這四個代謝途徑中差異倍數(shù)前10名的基因，可以發(fā)現(xiàn)在苯丙烷類代謝途徑上，差異倍數(shù)較大的上調(diào)基因有莽草酸氧羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶、過氧化物酶、B一葡萄糖苷酶，下調(diào)基因有8-羥基香葉醇脫氫酶、過氧化物酶、甘露醇脫氫酶;在倍半萜類和三萜類代謝途徑上，差異倍數(shù)較大的上調(diào)基因有倍半萜合酶、鍺烷烯-D合酶，下調(diào)基因有（-）-鍺烷烯D合酶、valencene合酶、8-鎘烯合酶同工酶、角鯊烯合酶;在二萜類代謝途徑上，差異倍數(shù)較大的上調(diào)基因有赤霉素2-B-雙加氧酶、ent-kaur-16-烯合酶，下調(diào)基因有en-kaurene氧化酶、戊二烯丙基二磷酸合酶、ent-kaurenoicacidOXidase、赤霉素2-B-雙加氧酶;在類黃酮代謝途徑上，差異倍數(shù)較大的上調(diào)基因有黃酮醇合酶/黃烷酮3-羥化酶、莽草酸氧-羥基肉桂?；D(zhuǎn)移酶、查爾酮合成酶、黃烷酮3-羥化酶，下調(diào)基因有vinorine合酶、咖啡酰輔酶AO-甲基轉(zhuǎn)移酶、4-香豆酸-3-羥化酶、莽草酸氧-羥基肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶、咖啡酰輔酶A3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶。結(jié)果如表6～9。

3討論與結(jié)論

在本試驗中，我們采用IluminaHiSeq”^高通量測序技術(shù)對草珊瑚葉和根的轉(zhuǎn)錄組進行測序，去除冗余后各獲得了0.4億多cleanreads，其中，各樣品的Q20、Q30值均大于97.60%、93.10%，GC量均大于45.20%，說明建立的整個文庫質(zhì)量較高，再將這些讀數(shù)通過使用Trinity組裝成508271個轉(zhuǎn)錄物，其中Transcripts平均長度為740bp，最大長度為17.3kb，N50=l178bp，說明組裝的轉(zhuǎn)錄本質(zhì)量較高，測序質(zhì)量良好?；赽last分析，共有148561個unigenes可以在功能注釋數(shù)據(jù)庫（Nr、Nt、Pfam、KOG、Swiss-Prot、Kegg和GO），上匹配，占總基因數(shù)的58.80%，剩余的unigenes由于與未知功能的蛋白質(zhì)匹配，可能被認為是新的轉(zhuǎn)錄物或替代體，這些unigenes有待進一步的研究。

在分析基因表達水平差異時，采用DESeq2篩選出合格的readcount數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)草珊瑚葉和根的共同基因有93127個，葉和根的差異基因分別為36327個和52268個，同時還發(fā)現(xiàn)在29732種不同表達的unigenes中，有12511個上調(diào)基因和17221個下調(diào)基因，在葉中被大幅度上調(diào)，與根表達差異倍數(shù)最大的基因有抗壞血酸過氧化酶、植酰苯醌甲基轉(zhuǎn)移酶、腺苷硫酸鹽還原酶等;在根中大幅度下調(diào)，與葉中表達差異倍數(shù)最大的基因有葡萄糖脫氫酶、類枯草素蛋白酶、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等，這與Mizra-chi等人2的研究結(jié)果相似。

在差異基因KEGG顯著性富集通路中，與藥效密切相關(guān)的次生代謝通路包括苯丙烷類生物合成基因193個，其中差異倍數(shù)較大的上調(diào)基因有莽草酸氧一羥基肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶、B-葡萄糖苷酶，下調(diào)基因有8-羥基香葉醇脫氫酶、過氧化物酶、甘露醇脫氫酶;倍半萜類和三萜類生物合成基因82個，其中差異倍數(shù)較大的上調(diào)基因有倍半萜合酶、鍺烷烯-D合酶，下調(diào)基因有（一）一鍺烷烯D合酶、valencene合酶、8-鎘烯合酶同工酶、角鯊烯合酶：萜類生物合成基因40個，其中差異倍數(shù)較大的上調(diào)基因有赤霉素2-B-雙加氧酶、ent-kaur-16-烯合酶，下調(diào)基因有en-kaurene氧化酶、戊二烯丙基二磷酸合酶、ent-kaurenoicacidoxidase、赤霉素2-B-雙加氧酶;類黃酮生物合成基因35個，其中差異倍數(shù)較大的上調(diào)基因有黃酮醇合酶/黃烷酮3-羥化酶、莽草酸氧羥基肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶、查爾酮合成酶、黃烷酮3-羥化酶，下調(diào)基因有vinorine合酶、咖啡酰輔酶AO-甲基轉(zhuǎn)移酶、4-香豆酸-3-羥化酶、莽草酸氧-羥基肉桂酰基轉(zhuǎn)移酶、咖啡酰輔酶A3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶。

對于苯丙烷類生物合成代謝，穆紅梅等巧總結(jié)了植物中苯丙烷類物質(zhì)生物合成的主要途徑，其下游分支有形成木質(zhì)素類的成分、形成花青素、單寧等物質(zhì)和形成黃酮類成分（包括查爾酮、黃烷酮、總黃酮）。其中，黃酮類物質(zhì)作為草珊瑚的主要化學成分，具有抗癌、抗腫瘤、消炎抗菌、抗氧化、降血脂的功效。王敦清等26研究發(fā)現(xiàn)，在草珊瑚不同部位中，葉的總黃酮含量相對較高，本試驗的結(jié)果不僅從基因的角度證明了王敦清等的研究，還進一步發(fā)現(xiàn)在葉中差異最大的基因是黃酮醇合酶/黃烷酮3-羥化酶基因，該類基因顯著上調(diào)，其下游產(chǎn)物：高良姜素、楊梅素、山奈素、槲皮素的含量顯著增多。因此，在臨床上治療癌定、腫瘤、心血管、肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病時往往可以優(yōu)先選擇草珊瑚的葉作為主要原料部位。在苯丙烷類物質(zhì)中也包括木質(zhì)素類（香豆素類）成分，如現(xiàn)行的藥典規(guī)定草珊瑚含量測定的指標性成分之一的異嗪皮啶！。包俠萍56發(fā)現(xiàn)，草珊瑚中異嗪皮啶的含量在根中最高，其次是莖、葉中最低;本試驗發(fā)現(xiàn)，在根中差異倍數(shù)最大的基因是8-羥基香葉醇脫氫酶，其下游產(chǎn)物芥子醇參與木質(zhì)素類生物合成途徑”，故進一步佐證了合成異嗪皮啶成分的基因在葉和根中的差異較為顯著，認為差異與8～羥基香葉醇脫氫酶基因顯著上調(diào)有關(guān)。而對于植物萜類物質(zhì)生物合成代謝，近年來已有多數(shù)研究學者對其進行詳盡的歸納總結(jié)8-39，藥典中規(guī)定草珊瑚以全草人藥，其化學成分中含量最豐富的是倍半萜類的成分，在差異基因KEGG富集通路排名靠前的結(jié)果中，我們可以發(fā)現(xiàn)草珊瑚葉和根在二萜類生物合成代謝上差異較大，以根中的表達較高，差異最大的基因是en-kaurene氧化酶，其下游產(chǎn)物是ent-Kaur-16-en-19-oate，該基因的下調(diào)可能是二者療效差異的指標之一;而倍半萜類和三萜類生物合成代謝上基因差異性不是很顯著，差異基因倍半萜合酶和（-）-鍺烷烯D合酶的下游產(chǎn)物均為（-）-鍺烷烯，說明葉和根倍半萜類化合物含量相差不大，以葉中含量較高，并且僅在根中發(fā)現(xiàn)角鯊烯合酶基因表現(xiàn)為上周，說明根還具有一定的抗氧化、保肝、促進血液循環(huán)等作用，對治療肝和心血管方面的疾病具有優(yōu)勢。因此，本試驗可以表明草珊瑚的葉和根之間基因表達的顯著差異，主要表現(xiàn)在苯丙烷類、倍半萜類和三萜類、二萜類、類黃酮生物合成次生代謝途徑的差異。其中上調(diào)倍半萜合酶、ent-kaur-16-烯合酶、黃酮醇合酶/黃烷酮3～羥化酶等基因和下調(diào)8-羥基香葉醇脫氫酶、vinorine合酶、角鯊烯合酶等基因，是葉和根療效差異的主要分子機制。

由于前人未對草珊瑚開展過全面的基因組測序，可供參考的遺傳信息較少，在一定程度上限制了草珊瑚功能基因的發(fā)掘和研究。本研究獲得了草珊瑚葉和根的轉(zhuǎn)錄組信息，通過比較不同部位的差異基因表達，尤其是葉和根在次生代謝中相關(guān)的基因差異性，可為進一步分析草珊瑚葉和根之間可能的次生代謝差異分析提供基因表達方面的信息，為草珊瑚葉和根不同藥用價值分析提供了重要信息與線索，有利于提升草珊瑚葉和根資源的精準利用。

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（責任編輯：吳宇琳）

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