HPV18陽性和HPV18陰性子宮頸癌組織中miR-24-3p和HOXB8蛋白的表達(dá)差異及其機(jī)制研究

李會影 徐明鑫 徐明研 李鑫 宋超 周宇

【摘要】 目的：檢測HPV18陽性和HPV18陰性子宮頸癌患者癌組織中miR-24-3p和HOXB8的表達(dá)差異并探討其變化機(jī)制。方法：選取2015年1月-2019年1月于本院就診的HPV18陽性子宮頸癌患者40例（HPV18+組）和HPV18陰性子宮頸癌患者40例（HPV18-組）的手術(shù)標(biāo)本。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測兩組miR-24-3p和HOXB8 mRNA的表達(dá)水平;免疫印跡法檢測兩組HOXB8蛋白的表達(dá)水平;巢式降落式甲基化特異性PCR（nMS-PCR）檢測兩組miR-24-3p啟動子區(qū)DNA甲基化水平;染色質(zhì)免疫共沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）檢測兩組miR-24-3p啟動子區(qū)H3K27me3水平;培養(yǎng)人子宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染miR-24-3p模擬物和miR-24-3p抑制物后檢測HOXB8的表達(dá)水平。結(jié)果：HPV18-組miR-24-3p的相對表達(dá)水平高于HPV18+組（P<0.01）。HPV18-組HOXB8 mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于HPV18+組（P<0.01）。miR-24-3p啟動子區(qū)富含CpG位點(diǎn)和CpG島，HPV18-組miR-24-3p啟動子區(qū)DNA甲基化水平低于HPV18+組，（P<0.01）。HPV18-組miR-24-3p啟動子區(qū)H3K27me3水平低于HPV18+組，（P<0.01）。在Hela細(xì)胞過表達(dá)miR-24-3p可抑制HOXB8的表達(dá)，而敲減miR-24-3p的表達(dá)可提高HOXB8的表達(dá)，與陰性對照比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：HPV18可能通過DNA甲基化和組蛋白甲基化下調(diào)miR-24-3p的表達(dá)導(dǎo)致HOXB8表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，為HPV18+子宮頸癌的治療研究提供了實驗基礎(chǔ)和干預(yù)靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 HPV18 子宮頸癌 miR-24-3p HOXB8 DNA甲基化 H3K27me3

Study on the Expression Differences of miR-24-3p and HOXB8 Protein in HPV18 Positive and HPV18 Negative Cervical Cancer Tissues and Its Mechanism/LI Huiying， XU Mingxin， XU Mingyan， LI Xin， SONG Chao， ZHOU Yu. //Medical Innovation of China， 2020， 17（28）： 00-006

[Abstract] Objective： To detect the differential expression of miR-24-3p and HOXB8 in cancer tissues of HPV18 positive and HPV18 negative cervical cancer patients and exploring the mechanisms. Method： From January 2015 to January 2019， surgical specimens were selected from 40 patients with HPV18 positive cervical cancer （HPV18+ group） and 40 patients with HPV18 negative cervical cancer （HPV18- group） visited our hospital. miR-24-3p and HOXB8 were detected by real-time quantitative PCR （RT-qPCR）. The expression of HOXB8 protein was detected by Western blotting. The DNA methylation level of miR-24-3p promoter was detected by nMS-PCR. The H3K27me3 level in miR-24-3p promoter region was detected by chromatin immunoprecipitation quantitative PCR （ChIP-qPCR）. Hela cells were cultured and expression levels of HOXB8 were detected after transfection with miR-24-3p mimics and miR-24-3p inhibitors， respectively. Result： The relative expression level of miR-24-3p in the HPV18- group was higher than that in the HPV18+ group （P<0.01）. Both mRNA and protein expression levels of HOXB8 in the HPV18- group were lower than those in the HPV18+ group （P<0.01）. The promoter region of miR-24-3p was rich in CpG sites and CpG islands， and the DNA methylation level of the promoter region of miR-24-3p in the HPV18- group was lower than that in the HPV18+ group （P<0.01）. The promoter H3K27me3 level of miR-24-3p in the HPV18- group was lower than that in the HPV18+ group （P<0.01）. Over expression of miR-24-3p in HeLa cells inhibited the expression of HOXB8， while knockdown of miR-24-3p

increased the expression of HOXB8， with statistically significant differences compared with the negative control group （P<0.05）. Conclusion： HPV18 may down-regulate the expression of miR-24-3p through DNA methylation and histone methylation， leading to increased HOXB8 expression， and then promote the occurrence and development of cervical cancer. It provides experimental basis and intervention targets for the treatment of HPV18+ cervical cancer.

[Key words] HPV18 Cervical cancer miR-24-3p HOXB8 DNA methylation H3K27me3

First-authors address： Hongqi Hospital Affiliated of Mudanjiang Medical College， Mudanjiang 157011， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.28.001

在世界范圍內(nèi)，子宮頸癌是女性第四大最常見的癌癥，2018年約有57萬新增病例，占所有女性癌癥死亡人數(shù)的7.5%。據(jù)估計，每年有超過31萬人死于子宮頸癌，其中85%以上發(fā)生在欠發(fā)達(dá)地區(qū)[1]。高危人乳頭瘤狀病毒18型（human papillomavirus 18，HPV18）感染是引起子宮頸癌的主要原因之一，但其導(dǎo)致子宮頸癌發(fā)生的分子機(jī)制仍不清楚[2-3]。MicroRNAs（miRNAs）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。文獻(xiàn)[4-5]報道m(xù)iRNAs可通過調(diào)控靶基因的表達(dá)參與子宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展，如miR-196可調(diào)控HOXB8的表達(dá)等。既往及現(xiàn)有子宮頸癌相關(guān)的miRNAs研究多集中于其對靶基因的調(diào)控作用，忽視了miRNAs本身表達(dá)變化的機(jī)制。因此，本研究以HPV18陽性和HPV18陰性子宮頸癌患者為研究對象，檢測兩組癌組織中miR-24-3p的表達(dá)情況并探討其變化機(jī)制，同時考察miR-24-3p對HOXB8是否具有調(diào)控作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）主要儀器：Microfuge 16臺式高速冷凍離心機(jī)（BECKMAN COULTER，美國）;Mastercycler nexus X2 PCR儀（Eppendorf，德國）;ABI QuantStudio 3熒光定量PCR儀（Themo Fisher，美國）;蛋白質(zhì)電泳、印跡及成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）;超凈工作臺（海爾生物醫(yī)療，中國）。（2）主要試劑：TRIzol試劑（Invitrogen，美國）;去DNA及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）（大連寶生物，中國）;熒光定量PCR試劑盒TB Green? Premix Ex Taq? Ⅱ（大連寶生物，中國）;DNA甲基化修飾試劑盒（北京天漠科技開發(fā)有限公司，中國）;miRNA提取試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及miRNA熒光定量PCR試劑盒（天根生化科技有限公司，中國）;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（南京凱基，中國）;HOXB8抗體（4F8）：sc-517156（Santa Cruz Biotechnology，美國）;GAPDH抗體（中杉金橋，中國）;ECL發(fā)光液（Thermo Fisher，美國）;miR-24-3p mimic和inhibitor（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，中國）;lipo3000（Invitrogen，美國）;染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒（millipore，美國）;

miR-24-3p及U6引物（天根生化科技有限公司，中國）;HOXB8、GAPDH及甲基化特異性引物（華大基因，中國）。（3）研究對象：選取2015年

1月-2019年1月本院婦產(chǎn)科收治的HPV18陽性子宮頸癌患者40例（HPV18+組）和HPV18陰性子宮頸癌患者40例（HPV18-組）。留取兩組手術(shù)切除的癌組織標(biāo)本，凍存于-80 ℃，備用。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)組織活檢及術(shù)后病理證實為子宮頸癌;（2）不合并其他惡性腫瘤及既往無其他惡性腫瘤病史;（3）于本院首次接受治療的子宮頸癌患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕婦;（2）合并嚴(yán)重的肝腎功能障礙;（3）年齡≤18歲;（4）合并嚴(yán)重的高血壓、糖尿病及心臟疾病等。所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書，本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測兩組miR-24-3p和HOXB8 mRNA的表達(dá)水平 稱取50 mg子宮頸癌組織，冰上勻漿，離心去除上清，收集沉淀。采用TRIzol試劑及miRNA提取試劑盒提取子宮頸癌組織中的總RNA和miRNA。按照PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）試劑盒說明書對總RNA進(jìn)行去DNA及逆轉(zhuǎn)錄，按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對miRNA逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，按照TB Green? Premix Ex Taq? Ⅱ和miRNA熒光定量PCR試劑盒說明書分別對miR-24-3p和HOXB8 mRNA進(jìn)行RT-qPCR檢測。以U6為內(nèi)參，根據(jù)目的基因的相對表達(dá)量=2-△△Ct計算miR-24-3p的相對表達(dá)水平。以GAPDH內(nèi)參，根據(jù)目的基因的相對表達(dá)量=2-△△Ct計算HOXB8 mRNA的相對表達(dá)水平。HOXB8及GAPDH引物信息見表1。

1.2.2 免疫印跡法檢測兩組HOXB8蛋白的表達(dá)水平 稱取100 mg子宮頸癌組織，冰上勻漿，離心去除上清，收集沉淀。按照總蛋白提取試劑盒說明書提取子宮頸癌組織的總蛋白，并采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。加入4×SDS Loading Buffer后煮沸使蛋白變性。取10 μL蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，80 V電泳濃縮膠，120 V電泳分離膠。冰上恒流0.3 A（或恒壓60 V）轉(zhuǎn)膜2 h，PBST洗一次后采用2%BSA室溫封閉1 h。分別與HOXB8

抗體和GAPDH抗體于4 ℃孵育過夜。PBST洗

3次，5 min/次，二抗室溫孵育1 h。PBST洗3次，5 min/次，ECL發(fā)光液孵育1 min后在凝膠成像分析儀上顯影成像，以GAPDH蛋白為內(nèi)參計算HOXB8蛋白的相對表達(dá)水平。

1.2.3 巢式降落式甲基化特異性PCR（nMS-PCR）檢測兩組miR-24-3p啟動子區(qū)DNA甲基化水平 稱

取50 mg子宮頸癌組織，冰上勻漿，離心去除上清，收集沉淀。分別按照DNA提取試劑盒說明書和DNA甲基化修飾試劑盒說明提取基因組DNA并進(jìn)行甲基化修飾。在線查找miR-24-3p啟動子序列并設(shè)計1對外引物（OutPrimer）和2對內(nèi)引物，即甲基化引物（MethPrimer）和非甲基化引物（UnmethPrimer），引物信息見表2。外引物擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20個循環(huán)，每個循環(huán)退火溫度降0.5 ℃直至退火溫度降低到52 ℃，72 ℃ 7 min。以外引物擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物為模板，繼續(xù)進(jìn)行內(nèi)外引物擴(kuò)增，反應(yīng)條件同外引物。取5 μL內(nèi)引物擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)成像，按公式計算miR-24-3p啟動子區(qū)DNA甲基化水平：甲基化%=甲基化OD值/（甲基化OD值+非甲基化OD值）。

1.2.4 染色質(zhì)免疫共沉淀-定量PCR（CHIP-qPCR）檢測兩組miR-24-3p啟動子區(qū)組蛋白甲基化水平 稱取100 mg子宮頸癌組織，冰上勻漿，離心去除上清，收集沉淀。以1%甲醛重懸室溫固定

10 min;加入0.125 mol/L甘氨酸混勻作用5 min終止交聯(lián);離心棄上清，用預(yù)冷的PBS洗2遍;離心后棄上清，加入適量SDS裂解液重懸沉淀，冰上超聲，將基因組DNA打成100～1 000 bp大小的片段;12 000 r/min離心15 min，取上清100 μL，加入適量H3K27me3抗體，4 ℃孵育過夜以形成anti-H3K27me3-H3K27me3復(fù)合物;加入適量A/G瓊脂糖結(jié)合抗體的Fc段，形成protein G Agarose-anti-H3K27me3-H3K27me3復(fù)合物;65 ℃水浴解交聯(lián)并純化DNA，以純化的DNA為模板，對miR-24-3p啟動子區(qū)進(jìn)行RT-qPCR，miR-24-3p啟動子區(qū)組蛋白相對甲基化水平計算方法同RT-qPCR。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HeLa細(xì)胞用含10% FBS及100 U/mL青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。按每孔0.4×106個細(xì)胞/孔鋪板：（1）取125 μL opti-MEM與適量lipo3000混勻;（2）另取125 μL opti-MEM與適量miR-24-3p模擬物（miR-24-3p mimic）或miR-24-3p抑制物（miR-24-3p inhibitor）或陰性對照（negative control）混勻;（3）將（1）加入（2）中并吹打混勻，室溫靜置10 min;逐滴滴入細(xì)胞培養(yǎng)液中并輕輕搖勻，6 h后換新鮮培養(yǎng)液1 mL，48 h后收集細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表3。

2.2 兩組miR-24-3p mRNA表達(dá)水平比較 相對于HPB18+組miR-24-3p的相對表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1.00，HPV18-組miR-24-3p mRNA表達(dá)水平為（5.28±2.27），HPV18-組miR-24-3p mRNA表達(dá)水平高于HPB18+組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.95，P<0.01），見圖1。

2.3 兩組HOXB8 mRNA和蛋白表達(dá)水平比較 相對于HPV18+組HOXB8 mRNA相對表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1.00，HPV18-組為（0.32±0.10），HPV18-組HOXB8 mRNA相對表達(dá)量低于HPV18+組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=41.68，P<0.01），見圖1A。相對于HPV18+組HOXB蛋白的相對表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為1.00，HPV18-組為（0.45±0.17），HPV18-組HOXB蛋白的相對表達(dá)量低于HPV18+組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=20.19，P<0.01），見圖1B。

2.4 兩組miR-24-3p啟動子區(qū)DNA水平比較 通過生物信息學(xué)網(wǎng)站查詢miR-24-3p啟動子區(qū)是否含有CpG位點(diǎn)和CpG島及其分布情況，結(jié)果顯示miR-24-3p啟動子區(qū)富含CpG位點(diǎn)和CpG島，分布情況見圖3A。相對于HPV18+組miR-24-3p啟動子區(qū)DNA甲基化水平標(biāo)準(zhǔn)化為1.00，HPV18-組為（0.20±0.10），HPV18-組miR-24-3p啟動子區(qū)DNA甲基化水平低于HPV18+組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=50.10，P<0.01），見圖3B。

2.5 兩組miR-24-3p啟動子區(qū)H3K27me3水平比較 相對于HPV18+組miR-24-3p啟動子區(qū)H3K27me3水平標(biāo)準(zhǔn)化為1.00，HPV18-組為（0.49±0.30），HPV18-組miR-24-3p啟動子區(qū)H3K27me3水平低于HPV18+組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.98，P<0.01），見圖4。

2.6 miR-24-3p參與調(diào)控HOXB8表達(dá) 在HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-24-3p 模擬物和抑制物后，檢測HOXB8表達(dá)變化，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-24-3p可抑制HOXB8的表達(dá)，而敲減miR-24-3p的表達(dá)可提高HOXB8的表達(dá)，與陰性對照比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.90，P<0.01;t=4.16，P<0.05），

見圖5。

3 討論

子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)普遍存在。雖然子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素和多階段調(diào)控異常的過程，但高危型HPV感染是子宮頸癌發(fā)病的主要誘因之一。文獻(xiàn)[6-7]報道感染HPV的子宮頸癌組織與未感染HPV的正常宮頸上皮組織相比，存在miRNAs的異常表達(dá)和調(diào)控。前期的miRNAs芯片結(jié)果顯示，在HPV18+的子宮頸癌組織中miR-24-3p表達(dá)異常減低[8-9]。本研究所用病例采用RT-qPCR對芯片結(jié)果進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示HPV18+組的子宮頸癌組織中

miR-24-3p的表達(dá)水平明顯低于HPV18-組（P<0.05），與前期miRNAs芯片研究結(jié)果一致，可基本排除由于樣本量小或樣本偏倚導(dǎo)致的誤差。Targetscan網(wǎng)站預(yù)測HOXB8可能是miR-24-3p的靶基因，因此本研究也對該預(yù)測進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示過表達(dá)miR-24-3p可抑制HOXB8的表達(dá)，而敲減miR-24-3p的表達(dá)可提高HOXB8的表達(dá)，提示miR-24-3p可調(diào)控HOXB8的表達(dá)。

目前及既往的研究大多集中于miRNAs的表達(dá)變化及其對下游基因的調(diào)控作用對子宮頸癌發(fā)生發(fā)展的影響，并以miRNAs-靶基因信號通路研究干預(yù)靶點(diǎn)，而忽略了miRNAs本身變化的機(jī)制[10-11]。若找到miRNAs的變化機(jī)制，則可實現(xiàn)在更高級的調(diào)控層面研究干預(yù)靶點(diǎn)。表觀遺傳學(xué)調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式，是指在基因核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)的可遺傳的變化。表觀遺傳調(diào)控的現(xiàn)象有很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation），組蛋白甲基化（Histone methylation）、基因組印記（genomic imprinting），母體效應(yīng)（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁顯性，休眠轉(zhuǎn)座子激活和RNA編輯（RNA editing）等[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳學(xué)改變的累加效應(yīng)體現(xiàn)在宮頸由正常組織—癌前病變—子宮頸癌的發(fā)展過程[14]。DNA甲基化和組蛋白甲基化是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要方式，研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化和組蛋白修飾在發(fā)育過程中相互影響，組蛋白甲基化可以幫助指導(dǎo)DNA甲基化模式，而DNA甲基化可以作為DNA復(fù)制后重建組蛋白修飾模式的模板，因此兩者存在互相調(diào)控作用[15-16]。DNA甲基化和組蛋白甲基化是否參與HPV18+和HPV18-患者子宮頸癌組織中miR-24-3p的表達(dá)調(diào)控仍不清楚影響。本研究結(jié)果顯示，HPV18+組miR-24-3p啟動子區(qū)DNA甲基化和組蛋白甲基化水平均高于HPV18-組（P<0.05），提示DNA甲基化和組蛋白甲基化參與了HPV18+子宮頸癌中miR-24-3p的表達(dá)調(diào)控，針對DNA甲基化和組蛋白甲基化設(shè)計干預(yù)靶點(diǎn)可能比針對miRNAs-靶基因信號通路設(shè)計干預(yù)靶點(diǎn)取得更好的臨床效果。

綜上所述，HPV18可能通過DNA甲基化和組蛋白甲基化下調(diào)miR-24-3p的表達(dá)導(dǎo)致HOXB8表達(dá)升高，進(jìn)而促進(jìn)子宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，為HPV18+子宮頸癌的治療研究提供了實驗基礎(chǔ)和干預(yù)靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2020-03-19） （本文編輯：田婧）