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    基因芯片法在結(jié)核分枝桿菌耐藥基因快速診斷中的應用價值

    2020-11-09 07:52:26楊映暉伍定輝蘇偉明董春萍姚向陽
    中國防癆雜志 2020年11期
    關(guān)鍵詞:基因芯片利福平結(jié)核

    楊映暉 伍定輝 蘇偉明 董春萍 姚向陽

    隨著對結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機制研究的深入,多種結(jié)核分枝桿菌耐藥基因的檢測方法相繼出現(xiàn)。基因芯片法是近年來在醫(yī)療領域最具影響力的科技發(fā)展成果之一,可快速檢測臨床疑似標本中的分枝桿菌屬DNA。本研究采用前瞻性的方法,通過對患者同一份痰標本同時進行基因芯片法、GeneXpert MTB/RIF(簡稱“GeneXpert”)和BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)及其比例法藥物敏感性試驗(簡稱“MGIT 960培養(yǎng)及其比例法藥敏試驗”)3種方法進行結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因rpoB、katG及inhA的檢測,并對3種檢驗結(jié)果進行對比分析,探討基因芯片檢測技術(shù)的優(yōu)勢和不足。

    資料和方法

    一、資料收集

    采用前瞻性的方法,收集2017年6月至2018年6月廈門大學附屬第一醫(yī)院肺科門診及住院的疑似肺結(jié)核患者的痰標本。標本采用患者晨痰,同一份痰標本同時進行基因芯片法、GeneXpert法和MGIT 960培養(yǎng)及其比例法藥敏試驗3種方法進行檢測。肺結(jié)核診斷標準參照《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[1]。本研究收集933例患者的晨痰標本;其中,男674例,女259例;年齡11~84歲,中位年齡56歲。

    二、儀器與試劑

    分枝桿菌菌種鑒定芯片(成都博奧晶芯生物科技有限公司;產(chǎn)品貨號301030);結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測芯片(成都博奧晶芯生物科技有限公司;產(chǎn)品貨號301035);Extractor 36核酸快速提取儀(博奧生物集團有限公司);LuxScan 10K-B微陣列芯片掃描儀及配套儀器(博奧生物集團有限公司);GeneXpert MTB/RIF檢測儀(美國Cepheid 公司);結(jié)核分枝桿菌rpoB基因和突變檢測試劑盒(Cepheid AB 瑞典賽沛公司;產(chǎn)品貨號1000061494);BACTEC MGIT 960全自動培養(yǎng)儀(美國BD公司);分枝桿菌藥物敏感性羅氏培養(yǎng)基(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

    三、菌種及耐藥基因檢測

    (一)基因芯片法檢測

    1.標本制備及核酸提?。禾禈吮炯尤氲攘?0% NaOH溶液,振蕩液化15~20 min,以3035×g離心5 min,離心后棄上清。再加入1 ml生理鹽水,充分振蕩后以12 830×g離心5 min,離心后棄上清。向核酸提取管中加入80 μl核酸提取液,加入上述標本后,使用Extractor 36核酸快速提取儀振蕩5 min,95 ℃水浴5 min,再以8910×g離心1 min。

    2.PCR擴增:采用不對稱擴增法對相關(guān)基因位點進行擴增。分別采用PCR擴增試劑1、2、3對每份樣品進行3管PCR擴增反應。分別向3管中加入2 μl模板DNA和18 μl PCR擴增試劑。每管PCR反應體系總體積為20 μl,置于PCR擴增儀中進行擴增。PCR反應條件為:37 ℃激活10 min;94 ℃變性600 s;94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s,35個循環(huán);94 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s,10個循環(huán);72 ℃ 420 s。

    3.芯片雜交與結(jié)果判讀:擴增反應完成后,在利福平芯片雜交管中加入3 μl擴增產(chǎn)物1、3 μl擴增產(chǎn)物2和9 μl雜交緩沖液,在異煙肼芯片雜交管加入3 μl擴增產(chǎn)物1、3 μl擴增產(chǎn)物3和9 μl雜交緩沖液。15 μl雜交反應混合物于95 ℃變性5 min,后立即冰水浴3 min。吸出13.5 μl雜交反應混合物加入芯片陣列,再置于50 ℃雜交儀中雜交120 min。雜交后經(jīng)洗滌甩干后使用LuxScan10K-B微陣列芯片掃描儀和晶芯軟件進行信號的讀取及結(jié)果的判讀。

    (二)MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗

    取4倍體積的4% NaOH溶液溶于痰標本中,旋渦振蕩混勻,使痰標本充分液化,靜置15 min,以3035×g離心5 min,棄上清后中和,用一次性無菌吸管吸取處理后的痰標本0.5 ml,接種于液體培養(yǎng)管中,加載到BACTEC MGIT 960全自動培養(yǎng)儀上。培養(yǎng)陽性后,通過萋尼抗酸染色確定是否培養(yǎng)出抗酸桿菌;取陽性菌株接種于羅氏培養(yǎng)基進行傳代,并接種噻吩-2-羧酸肼和對硝基苯甲酸鑒別培養(yǎng)基,鑒定是否為結(jié)核分枝桿菌。比例法藥敏試驗:挑取對數(shù)生長期的結(jié)核分枝桿菌菌落,用滅菌生理鹽水配制1麥氏濁度的菌懸液,然后使用無菌的10 μl標準接種環(huán),進行100倍和10 000倍稀釋,用10 μl無菌標準接種環(huán)分別挑取10 000倍稀釋菌懸液一環(huán),劃線接種于一組空白對照培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基,再用10 μl無菌標準接種環(huán)分別挑取100倍稀釋菌懸液一環(huán),劃線接種于另外一組空白對照培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基,擰緊培養(yǎng)基管蓋,豎直置于恒溫培養(yǎng)箱中,于37 ℃培養(yǎng)4周后觀察記錄藥敏試驗結(jié)果。

    (三)GeneXpert檢測

    將痰標本與消化液以1∶2的比例加入15 ml無菌干燥離心管中,振蕩,室溫靜置15 min,使痰標本充分液化。使用與GeneXpert MTB/RIF樣品盒配套的一次性移液管,將2 ml處理后的樣品加至樣品盒中,將樣品盒掃描二維碼,錄入信息,放入GeneXpert MTB/RIF儀器中,2 h后讀取記錄檢測結(jié)果。

    四、質(zhì)量控制

    所有參加本研究的工作人員均接受嚴格、系統(tǒng)的培訓并掌握實施方案,嚴格按照標準納入患者,完成各項操作,進行結(jié)果判斷。實驗過程均做陰性、陽性質(zhì)量控制。

    五、統(tǒng)計學處理

    采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以“率(%)”描述,采用χ2檢驗進行比較,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。一致性檢驗采用Kappa檢驗,Kappa值≥0.75為兩者一致性較好,0.4≤Kappa值<0.75為兩者一致性一般,Kappa值<0.4為兩者一致性較差。各百分率的95%CI采用OpenEpi 3.01軟件進行計算。

    結(jié) 果

    一、基因芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥的效能

    933例患者的痰標本中,基因芯片法檢測出陽性484例,GeneXpert檢測出陽性462例,MGIT 960培養(yǎng)出陽性411例。3種檢測方法均為陽性的標本有395例,從3種檢測結(jié)果均為陽性的標本中通過Excel表以完全隨機的方式抽取232份分別進行異煙肼耐藥基因katG及inhA檢測。以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果為參考標準,基因芯片法檢測出異煙肼耐藥的敏感度為86.67%(26/30),特異度為96.53%(195/202),一致性達95.26%(221/232),Kappa值為0.798(0.682~0.914),具有良好的一致性(表1)。

    二、基因芯片法和GeneXpert檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥的效能

    分別采用基因芯片法和GeneXpert進行利福平耐藥基因rpoB檢測,同樣以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果為參考標準,基因芯片法檢測出的利福平耐藥敏感度為93.75%(30/32),特異度為97.00%(194/200),一致性達96.55%(224/232),Kappa值為0.862(0.768~0.956),兩者具有良好的一致性(表2)。

    以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果為參考標準,GeneXpert檢測出的利福平耐藥敏感度為84.38%(27/32),特異度為97.00%(194/200),一致性達95.26%(221/232),Kappa值為0.803(0.691~0.915),兩者具有良好的一致性(表2)。

    表1 以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果為參考標準判斷基因芯片法檢測異煙肼耐藥性的效能

    表2 以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果為參考標準判斷基因芯片法與GeneXpert檢測利福平耐藥性的效能

    表3 以MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗結(jié)果為參考標準判斷基因芯片法與GeneXpert檢測利福平耐藥一致性的比較

    將基因芯片法與GeneXpert進行比較,結(jié)果顯示兩種方法檢測出的利福平耐藥陽性一致性為90.91%(30/33),陰性一致性為96.98%(193/199),總一致性達96.12%(223/232),Kappa值為0.847(0.749~0.945),具有良好的一致性(表3)。

    討 論

    耐藥結(jié)核病是重大的公共衛(wèi)生問題,為控制結(jié)核病的一大障礙[2]。盡早掌握結(jié)核分枝桿菌耐藥狀況及影響因素,可提高耐藥結(jié)核病的發(fā)現(xiàn)和治療能力[3],對減少耐多藥結(jié)核病的傳播具有重大意義[4]。因此,臨床實驗室迫切需要開發(fā)特異度和敏感度高、檢測速度快的檢測方法。

    目前,最普遍使用并被視為診斷結(jié)核病參考標準的MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗,存在操作繁瑣、陽性率低、耗費時間長和生物安全性差等問題,明顯滯后于結(jié)核病早期診斷的期望[5],無法滿足臨床快速診斷的需求。近幾年,隨著分子生物學和基因工程技術(shù)的發(fā)展,分子診斷技術(shù)成為結(jié)核病快速診斷的主要手段[6]。其中基因芯片技術(shù)敏感、準確且簡便可靠,可以同時檢測到多種靶基因,如異煙肼耐藥基因katG和inhA基因啟動子及利福平耐藥基因rpoB等常見突變位點。該檢測手段所需樣本量少、準確、信噪比極小且易于操作,開辟了新的臨床診斷視野。

    本研究將基因芯片法與GeneXpert和MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗進行了深入比較,在結(jié)核分枝桿菌快速檢測及結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測方面具有良好的敏感度和特異度。基因芯片法結(jié)果與傳統(tǒng)細菌學培養(yǎng)和藥敏試驗結(jié)果具有良好的一致性,并且彌補了后者耗時長、陽性率低、占用實驗室空間的缺陷;與GeneXpert方法比較,兩種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義,但GeneXpert只能檢測一種耐藥基因(rpoB),基因芯片技術(shù)能一次檢測katG、inhA和rpoB3種耐藥基因,對耐多藥結(jié)核病的快速診療更有應用價值。代小偉等[7]、許榕青等[8]和王小路等[9]的研究結(jié)果也均顯示基因芯片技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌及耐藥基因檢測中具有明顯優(yōu)勢,與本研究所獲得的結(jié)果基本一致。

    但是,每種方法都有各自的局限性,與其設計原理、操作復雜性及結(jié)果判讀偏倚等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),基因芯片法和GeneXpert在結(jié)核分枝桿菌檢測的陽性例數(shù)方面,與MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗方法存在部分差異。分析可能的原因是:結(jié)核分枝桿菌的檢出結(jié)果受多種因素限制,如細菌代謝及繁殖是否旺盛,是否處于休眠狀態(tài),是否存在形態(tài)多樣性等因素[10]。結(jié)核分枝桿菌處于休眠或者衰亡狀態(tài),就可能出現(xiàn)培養(yǎng)陰性的情況。同時也突顯出當今分子診斷技術(shù)普遍存在的不足之處,即不能判斷結(jié)核分枝桿菌是否是具備傳染性的活菌,不能準確評價所用藥品的療效。所以基因芯片法不能完全取代MGIT 960培養(yǎng)及其藥敏試驗方法,兩者可以互相補充。

    綜上所述,基因芯片法在結(jié)核分枝桿菌及耐藥基因的檢測中,具有較高的敏感度和特異度,且檢測時間短,與傳統(tǒng)方法相比,具有快速、安全、準確、有效的特點,有利于耐多藥結(jié)核病的早期診斷及防控,值得在臨床診療中推廣應用。

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