細(xì)菌性陰道炎病原菌分布調(diào)查

王曉平 裴銀輝 安 新 李 琳 韓麗媛

華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063210；①開灤總醫(yī)院；②唐山婦幼保健院

細(xì)菌性陰道炎是女性生殖道最為常見且極易復(fù)發(fā)的一種疾病。相關(guān)資料顯示育齡婦女約30%～50%曾被感染，10%～30%的女性出現(xiàn)癥狀，遠(yuǎn)多于滴蟲性陰道炎和真菌感染者[1]。近年來，該病感染率仍呈上升趨勢，對女性身心健康、生活和工作都造成影響，嚴(yán)重者還可以引起盆腔炎、異常子宮出血、婦科術(shù)后感染、宮頸癌、不孕不育[2]等并發(fā)癥。文獻(xiàn)報道由本病引起的不孕癥占不孕患者的37.4%[3]。此外，相關(guān)研究表明細(xì)菌性陰道炎與宮頸HPV感染呈正相關(guān)，明顯增加了宮頸HPV感染的風(fēng)險[4]。引起本病的病原菌種類多，影響因素復(fù)雜，盡管通過治療后可取得一定的效果，但極易出現(xiàn)反復(fù)，久治不愈[5]。在目前缺乏有效治療手段的情況下，通過多價聯(lián)合疫苗進(jìn)行主動免疫預(yù)防，可大大降低細(xì)菌性陰道炎的發(fā)生率。本文旨在通過對引起細(xì)菌性陰道炎的病原菌進(jìn)行分離鑒定并描述其頻數(shù)分布，為聯(lián)合疫苗的制備提供實驗依據(jù)。

1 對象與方法

1.1研究對象 選取2018年10月～2019年3月就診于華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院及唐山婦幼保健院婦科門診患者187例，臨床初步診斷為細(xì)菌性陰道炎，年齡(35.01±9.94)歲。由婦科專業(yè)醫(yī)師按照臨床操作規(guī)范用無菌棉拭子采集陰道分泌物，所有標(biāo)本均排除月經(jīng)期、性生活、陰道灌洗、用藥等影響因素。細(xì)菌性陰道炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：①患者有外陰不適、灼燒感、瘙癢等癥狀，分泌物增多，可呈黃綠色稀薄狀，可伴有魚腥臭味；②陰道分泌物涂片鏡下發(fā)現(xiàn)線索細(xì)胞，且大>20%；③陰道pH值升高，一般>4.8；④陰道桿菌減少(<5個/油鏡視野)。排除陰道毛滴蟲和真菌等其他病原體感染。

1.2研究方法

1.2.1常規(guī)鏡檢 取樣本液滴于載玻片，蓋上蓋玻片靜置5分鐘，高倍鏡觀察上皮細(xì)胞、線索細(xì)胞、白細(xì)胞等，排除真菌及滴蟲性陰道炎標(biāo)本。

1.2.2五聯(lián)卡檢測 從冰箱中取出試劑盒置室溫平衡(試劑盒由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供)，將采集的標(biāo)本中滴入專用稀釋液6～8滴，充分混勻后將拭子棄去。取室溫平衡后的檢測卡，用吸管將樣本液反復(fù)吹打混勻，然后于每孔中滴加樣本一滴(約30μL)，1分鐘內(nèi)與聯(lián)檢比色卡對照，記錄pH值。再將檢測卡置于37℃水浴箱中溫育15分鐘后取出，第3、4孔分別滴加一滴終止液終止其反應(yīng)，2分鐘內(nèi)對照比色卡判讀各孔結(jié)果。

1.2.3細(xì)菌培養(yǎng) 標(biāo)本采用三區(qū)劃線的方法分別接種于血瓊脂/中國藍(lán)瓊脂、巧克力色培養(yǎng)基及厭氧培養(yǎng)基上(購自溫州康泰生物技術(shù)有限公司和濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司)，并置于培養(yǎng)箱中24小時，厭氧培養(yǎng)皿放入有指示劑的厭氧袋中培養(yǎng)48小時。觀察各培養(yǎng)皿上細(xì)菌的生長情況，記錄其優(yōu)勢菌菌落形態(tài)(光滑/粗糙)、大小、顏色、有無溶血等。滅菌生理鹽水進(jìn)行涂片及革蘭染色，并記錄鏡下染色結(jié)果。單個菌落純培養(yǎng)后采用全自動細(xì)菌分析儀鑒定(由法國生物梅里埃股份有限公司提供)并保存待用。

1.2.4PCR基因鑒定 根據(jù)菌落觀察及生化反應(yīng)初步鑒定結(jié)果，對引起細(xì)菌性陰道炎的病原菌采用實時熒光定量PCR(濟(jì)南歐萊博醫(yī)療器械有限公司)進(jìn)一步進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，按照文獻(xiàn)選擇相應(yīng)引物。配置PCR反應(yīng)體系：Template DNA 2μL、2×M5 Hiper SYBR Premix EsTap 12.5μL、Primer1 0.5μL、Primer2 0.5μL、ddH O 9.5μL。反應(yīng)擴(kuò)增程序按照PCR兩步法設(shè)定：Step1:95℃ 30秒、Step2: 95℃ 5秒、60℃ 30秒,40個循環(huán)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用行×列表χ2檢驗，檢驗水準(zhǔn)取雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1常規(guī)鏡檢及五聯(lián)卡檢測結(jié)果 本研究共采集臨床初步診斷為細(xì)菌性陰道炎標(biāo)本187例，經(jīng)常規(guī)鏡檢及五聯(lián)卡檢測聯(lián)合診斷為細(xì)菌性陰道炎標(biāo)本168例。細(xì)菌性陰道炎陰道分泌物常規(guī)鏡檢所見：上皮細(xì)胞減少、雜菌量增多、并可見線索細(xì)胞且>20%，見圖1。五聯(lián)卡檢測法陽性結(jié)果見圖2。

圖1 線索細(xì)胞 圖2 五聯(lián)檢測卡陽性結(jié)果

2.2細(xì)菌培養(yǎng)及生化反應(yīng)初步鑒定結(jié)果 168例標(biāo)本中共分離病原菌144株，見表1。引起細(xì)菌性陰道炎主要病原菌培養(yǎng)結(jié)果見圖3～5。

圖3 凝固酶陰性葡萄球菌菌落 圖4 大腸埃希菌菌落 圖5 肺炎克雷伯菌菌落

2.3細(xì)菌PCR基因鑒定結(jié)果 采用實時熒光定量PCR，144株病原菌中有136例與全自動細(xì)菌分析儀鑒定結(jié)果一致，符合率為94.4%，見表1。主要病原菌PCR鑒定曲線見圖6A～C。

表1 144株陰道分離致病菌生化反應(yīng)及PCR鑒定結(jié)果[株(%)]

圖6 主要致病菌PCR鑒定曲線注：A凝固酶陰性葡萄球菌，B大腸埃希菌，C肺炎克雷伯菌

2.4病原菌頻數(shù)分布 根據(jù)實時熒光定量PCR鑒定結(jié)果，以細(xì)菌種類為橫坐標(biāo)，以檢測例數(shù)為縱坐標(biāo)繪制細(xì)菌性陰道炎病原菌分布頻數(shù)圖。見圖7。

圖7 細(xì)菌性陰道炎細(xì)菌頻數(shù)分布圖

3 討論

本研究共收集臨床初步診斷為細(xì)菌性陰道炎標(biāo)本187例，經(jīng)常規(guī)鏡檢和五聯(lián)卡檢測法聯(lián)合檢測確診為細(xì)菌性陰道炎共168例。常規(guī)鏡檢法被認(rèn)為是實驗室最常用最傳統(tǒng)的檢測方法，簡單快速易操作，有利于對滴蟲和真菌等有形成分的識別，但受涂片質(zhì)量及檢驗人員經(jīng)驗等影響，且單獨(dú)鏡檢不足以對細(xì)菌性陰道炎作出診斷。目前五聯(lián)卡檢測法在陰道分泌物檢測中得到廣泛應(yīng)用 , 但某些藥物、精液等因素會對結(jié)果判讀產(chǎn)生干擾[6]。常規(guī)鏡檢聯(lián)合五聯(lián)卡檢測法用于細(xì)菌性陰道炎的初步篩查可以互補(bǔ)兩者的不足。本研究將常規(guī)鏡檢及五聯(lián)卡檢測法初步篩選出的168例細(xì)菌性陰道炎患者陰道分泌物進(jìn)一步細(xì)菌培養(yǎng)后通過生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示：引起細(xì)菌性陰道炎的主要病原菌為凝固酶陰性葡萄球菌、大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌。

細(xì)菌培養(yǎng)一直被譽(yù)為是鑒定細(xì)菌的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7],但由于細(xì)菌培養(yǎng)步驟繁瑣、耗時較長且全自動細(xì)菌鑒定儀是根據(jù)生化反應(yīng)即細(xì)菌代謝產(chǎn)物而進(jìn)行的表型鑒定，存在特異性低的不足。實時熒光定量PCR具有簡單易操作、速度快、靈敏度及特異性較高等優(yōu)點[8]，因此，本研究進(jìn)一步應(yīng)用實時熒光定量PCR，從分子生物學(xué)水平對分離的病原菌進(jìn)行基因鑒定。實時熒光定量PCR鑒定144株病原菌中有136例與全自動細(xì)菌分析儀鑒定結(jié)果一致，符合率為94.4%。研究結(jié)果與張永生[9]的報道略有不同，其原因可能與樣本量的差異及不同地區(qū)流行菌株不同有關(guān)。

凝固酶陰性葡萄球菌為革蘭陽性球菌，?？梢鹎嗄昱悦谀虻栏腥尽⑿律鷥貉劢Y(jié)膜炎、敗血癥等。對患有結(jié)膜炎的新生兒眼部分泌物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),檢出的病原菌主要以凝固酶陰性葡萄球菌為主，究其原因可能為母親孕期陰道內(nèi)正常菌群發(fā)生變化，兼性厭氧菌增加或者本身有陰道炎病史。有文獻(xiàn)報道，不孕癥患者中輸卵管性不孕多是由生殖道病原菌感染引起，分離出來的主要致病菌為表皮葡萄球菌[10]。大腸埃希菌主要寄生在腸道內(nèi)，一般情況下不會致病，進(jìn)入其他部位后可能引起腸道外感染。有研究表明宮頸癌患者陰道分泌物致病菌檢出率較高，病原菌菌株多，以單菌株而言，大腸埃希菌為首要檢出菌[11]。肺炎克雷伯菌存在于正常人體的呼吸道及腸道內(nèi)，亦為條件致病菌，多引起呼吸系統(tǒng)疾病。已有研究發(fā)現(xiàn)，生殖道感染對胎兒的存活以及新生兒狀態(tài)均有較大的影響。該菌在陰道內(nèi)大量增殖使得患絨毛膜羊膜炎的風(fēng)險也顯著增加，可造成嬰兒早產(chǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致早產(chǎn)兒呼吸窘迫綜合征等疾病的發(fā)生[12-13]。

本研究對168例細(xì)菌性陰道炎患者陰道分泌物細(xì)菌鑒定結(jié)果顯示，凝固酶陰性葡萄球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為引起細(xì)菌性陰道炎的主要病原菌，占細(xì)菌性陰道炎的79.3%，因此可將這三種菌作為制備細(xì)菌性陰道炎疫苗的候選菌種。