激光解吸后電離質(zhì)譜成像技術(shù)在生物醫(yī)學分析中的應(yīng)用

陸 橋 聶武藝 胡勇軍

( 華南師范大學生物光子學研究院激光生命科學教育部重點實驗室暨廣州市光譜分析與功能探針重點實驗室， 廣州 510631)

1 引言

激光自發(fā)明以來已被應(yīng)用于多種領(lǐng)域，尤其是與生命科學的結(jié)合更是研究的熱點和前沿[1]，它被譽為“一把鋒利的刀”。激光技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合始于1963年，由美國科學家Honig提出，最初應(yīng)用于分子反應(yīng)動力學和光電離光譜等基礎(chǔ)科學的研究[2]。隨后，研究人員又將這一技術(shù)應(yīng)用到分析化學領(lǐng)域，用于對無機材料、芳香族化合物、生物材料、氨基酸、藥物、有機酸代謝產(chǎn)物等分析中。最開始比較成功的應(yīng)用是激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)(LDI-MS)，它很好地解決了質(zhì)譜對小分子分析的困擾且實現(xiàn)了對樣品的原位分析[7]。然而這種方法的檢測靈敏度相對較低，易產(chǎn)生碎片離子峰，且只適合于分析分子量低于500的小分子化合物，而大部分生物組織內(nèi)源物如磷脂，其分子量都在600以上，因而LDI-MS技術(shù)沒能在生物醫(yī)學領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

在LDI-MS的基礎(chǔ)上，上世紀80年代，分析化學家們又提出了將一束激光解吸電離改成用兩束激光分別完成對樣品的解吸和離子化任務(wù)，然后用質(zhì)量分析器對樣品進行檢測，這一方法被稱為激光解吸后電離質(zhì)譜法(LDPI-MS)[8, 9]。兩束激光的時空可調(diào)性以及第二束電離激光的引入也大大提高了對樣品的離子化效率，使得其可以檢測到只用第一束激光無法探測到的樣品信號。當前質(zhì)譜成像(MSI)技術(shù)日趨成熟，已被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，而與LDPI結(jié)合的MSI技術(shù)，即LDPI-MSI，兼具兩種技術(shù)的優(yōu)勢，也開始得到分析學家和儀器學家的關(guān)注。生物技術(shù)的快速發(fā)展以及亟待解決的生命科學問題也促進了LDPI-MSI技術(shù)在生物醫(yī)學領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，同時也對其提出了一些挑戰(zhàn)。本文將深入闡述LDPI-MSI的基本原理和影響LDPI過程中離子化效率的重要參數(shù)，同時介紹LDPI-MSI技術(shù)在生物醫(yī)學分析研究中的應(yīng)用。

2 激光解吸后電離質(zhì)譜成像技術(shù)原理

2.1 基本原理介紹

LDPI-MS與LDI-MS及基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)質(zhì)譜法不同，其基本原理如圖1所示。在該系統(tǒng)中，兩束激光的燈泵和Q開關(guān)觸發(fā)信號線被同時連接在一個延時觸發(fā)器上，可以分別優(yōu)化兩束激光的能量和延時間隔。同時，可以通過光學元件來調(diào)整兩束激光的空間位置，從而實現(xiàn)了在時間和空間上對改離子源的同時優(yōu)化。第一束激光為解吸激光，其作用是使樣品在很短的時間內(nèi)得以解吸/氣化，一般使用納秒級或更短脈沖的激光，這對于熱不穩(wěn)定且難以揮發(fā)的物質(zhì)極為關(guān)鍵。這束激光一般采用低功率密度的可見波段的激光，但有時為了特殊需要也使用紅外激光、紫外激光，甚至是真空紫外或極紫外激光。當解吸激光照射到樣品上時，待測樣品就會吸收光子并迅速將其大部轉(zhuǎn)換成熱能，使樣品在瞬間被氣化而從樣品解吸出來，這可以避免樣品分子因長時間受熱而發(fā)生裂解。經(jīng)過解吸激光的照射后，在離樣品表面垂直距離約2 mm內(nèi)將會形成一個微小的樣品分子組成的氣團，該氣團中的大部分粒子是電中性的，只有少部分是帶電粒子，其中性粒子數(shù)目是帶電粒子的1000倍以上。當經(jīng)過一定時間的延遲后(時間一般在微秒級，根據(jù)氣團離樣品的距離而不同)，觸發(fā)第二束激光(電離激光)，該激光被聚焦到該氣團上并將氣態(tài)的樣品分子電離，離子隨后被引入質(zhì)量分析器而被檢測到。

圖1 激光解吸后電離質(zhì)譜成像裝置原理圖和兩束激光觸發(fā)時序圖

在獲得單點樣品的質(zhì)譜信號后，研究人員又設(shè)想對樣品進行逐點探測以獲取整個樣品表面的質(zhì)譜信息。他們通過在激光解吸樣品的時候有規(guī)律地移動樣品，同時記錄樣品的位置信息和質(zhì)譜峰信息。然后將每一個點的質(zhì)譜信息與位置逐一對應(yīng)，獲得整個樣品每個點的質(zhì)譜信號強度“熱圖”，即為質(zhì)譜成像圖。MSI是一種結(jié)合質(zhì)譜分析和影像可視化的分子成像技術(shù)，作為分子成像及質(zhì)譜領(lǐng)域研究的前沿和熱點，近年來受到研究人員高度的關(guān)注并得到迅速發(fā)展[11]。它可對生物組織樣品進行多組分檢測、多維數(shù)據(jù)獲取，從而實現(xiàn)對多種分子進行高靈敏度地同時檢測，與此同時，它還能夠直接提供目標化合物在生物組織中的空間分布信息。與其他成像技術(shù)相比，MSI技術(shù)無需利用放射性同位素或熒光進行標記，樣品前處理簡單。因此本文所介紹的LDPI-MSI的基本原理就是在LDPI-MS基礎(chǔ)上引入MSI技術(shù)，實現(xiàn)獲取樣品的成分信息和分子分布信息。

2.2 解吸激光的選擇及對成像分辨率的影響

解吸激光的波長、脈寬、能量、光斑大小等因素對樣品的解吸效率具有決定性作用[12]。陸橋等人在LDPI-MS裝置上使用光學參量震蕩/放大器(OPO/OPA)輸出的1.5～5.0 μm波長的紅外激光作為解吸光源，并與傳統(tǒng)解吸激光波段532 nm和1064 nm作對比，發(fā)現(xiàn)生物組織樣品更易吸收紅外激光，在其它條件相同的情況下表現(xiàn)出更強的質(zhì)譜信號。崔揚等人利用脈寬為75 fs、波長為800 nm的近紅外飛秒激光對樣品進行剝蝕，同時利用光闌對激光光斑進行壓縮，實現(xiàn)了2.0 μm的橫向成像分辨率[14]。在解吸激光波長的選擇上也應(yīng)考慮樣品分子的吸收波長，應(yīng)使用最靠近分子最大吸收峰的激光波長。此外，相同能量下的激光，脈寬越短，其功率密度越高，因此選擇短脈沖的激光，可以降低激光的能量，在對樣品解吸過程中可降低對樣品的破壞程度[15]?；诩す獾膫鹘y(tǒng)MSI技術(shù)，由于受光的衍射極限限制(≈λ/2N.A.，其中N.A.為數(shù)值孔徑)，激光的聚焦光斑直徑最小不低于光的半波長。除此之外，聚焦透鏡存在球差和相差，使得激光遠場聚焦光斑大小會遠大于理論值。近些年近場技術(shù)的發(fā)展很好地解決了光的衍射極限問題，使得激光的聚焦光斑大小突破到亞微米級。Zenobi等人在近場掃描顯微鏡的基礎(chǔ)上構(gòu)建近場激光解吸系統(tǒng)，可以將解吸激光聚焦到直徑為200 nm以下，實現(xiàn)了對樣品的高分辨成像[16]。

2.3 電離激光的選擇

紫外光或者真空紫外光作為第二束激光已經(jīng)廣泛應(yīng)用于LDPI-MSI技術(shù)中，真空紫外激光(光子的能量為7～11 eV)可以通過單光子吸收對絕大多數(shù)的分子進行“軟”電離，這樣可避免分子裂解而產(chǎn)生大量的碎片離子峰[17]。準分子激光器產(chǎn)生的157 nm波長的激光由于其相對較高的光子密度及成熟的商業(yè)化機型，許多實驗室將其作為后電離激光的優(yōu)選[18，19]。但是，對于電離能高于157 nm單光子能量的樣品分子，不能對該分子實現(xiàn)單光子電離，因而會產(chǎn)生碎片。其它諸如產(chǎn)生248 nm波長的KrF準分子激光器以及產(chǎn)生160 nm波長的H2準分子激光器也存在同樣的問題[20]。劉平等人比較了118 nm波長的真空紫外激光與355 nm和266 nm波長的紫外激光作為后電離源后，發(fā)現(xiàn)118 nm激光作為后電離激光時分子碎片率較低，母體離子峰相對更強[5]。使用同步輻射光源作為后電離光時，由于其可調(diào)諧性，可針對不同分子有不同的垂直電離能而選擇不同波長的光，實現(xiàn)對分子的單光子電離[17，21，22]。此外，共振增強了多光子電離(REMPI)配合超聲分子束冷卻技術(shù)也可以實現(xiàn)對樣品分子的“軟”電離[23，24]。

2.4 影響離子產(chǎn)率的參數(shù)

除了兩束激光的自身性質(zhì)會對樣品的離子化效率產(chǎn)生影響外，兩束光之間的延遲時間及第二束光與樣品臺的垂直距離均會對電離效率產(chǎn)生重大影響。通過優(yōu)化兩束光之間的延遲時間及第二束光與樣品臺的垂直距離, 可以極大地提高電離的效率，有助于質(zhì)譜信號強度和質(zhì)譜分辨率的提高。如圖2所示，陸橋等人通過實驗發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜信號強度會隨延時的增加先增加然后降低，也會隨電離光與樣品臺的垂直距離的增加先增加然后降低[25]。只有在恰當?shù)臅r間節(jié)點和位置才能獲得最佳的質(zhì)譜信號。對于利用具有大氣壓接口的四極桿/飛行時間質(zhì)譜儀的LDPI實驗，由于離子傳輸?shù)膯栴}，離子源所處環(huán)境的氣壓大小也會對質(zhì)譜信號有極大的影響[26]。

圖2 影響激光解吸后電離離子產(chǎn)率的兩個因素(a).兩束激光的延時時間；(b).電離激光與樣品靶的距離

3 在生物醫(yī)學分析中的應(yīng)用

3.1 對藥物在生物體內(nèi)作用機理的研究

對藥物在生命體內(nèi)的作用機理研究一直是藥學家、生命科學家等的研究熱點。通過質(zhì)譜成像技術(shù)我們可以清晰且直觀地觀察到藥物的作用部位以及藥物代謝情況[27]。Heeren等人利用LDPI-MSI技術(shù)闡述了阿霉素、紫杉醇、曲安奈德等藥物在病人組織區(qū)域內(nèi)的分布，揭示了藥物在人體內(nèi)的作用部位和機理。Akhmetov等人對表皮葡萄球菌生物膜上的利福平藥物進行成像，模擬研究了該藥物的擴散機制[28]。近些年質(zhì)譜成像技術(shù)的快速發(fā)展也促進了激光解吸后電離質(zhì)譜成像(LDPI-MSI)技術(shù)在生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其是對生物樣品進行質(zhì)譜成像。在生物組織層面，楊晴等人以及劉平等人利用LDPI-MS實現(xiàn)了對小鼠腎臟組織中抗癌藥物分子的探測[29，30]。陳家新等人在此基礎(chǔ)上配合質(zhì)譜成像技術(shù)，揭示了藥物分子在組織中的分布，為藥物開發(fā)及藥代動力學研究提供了理論支撐，他們以實驗小鼠為模型，通過研究藥物在給藥小鼠腎臟組織中的分布來探討藥物代謝機理[31，32]。陸橋等人在此基礎(chǔ)上創(chuàng)造性地提出在生物組織樣品上添加生物相容性較好的納米材料，提高了解吸激光對樣品的解吸效率，以此檢測到傳統(tǒng)技術(shù)難以探測到的低濃度藥物分子。崔揚等人將飛秒激光作為第一束解吸激光對培養(yǎng)的生物膜的內(nèi)源物進行了“低損”質(zhì)譜成像分析[33]。

3.2 在疾病診斷中的應(yīng)用

LDPI-MSI技術(shù)在醫(yī)學疾病診斷中也占據(jù)越來越重要的地位。陸橋等人通過構(gòu)建對實驗小鼠接種腫瘤，利用LDPI-MSI技術(shù)探測腫瘤及癌旁組織中葉酸分子的分布情況，間接鑒別出腫瘤與非腫瘤組織區(qū)域[25]。相比于其他的傳統(tǒng)方法，該方法操作簡便，無復(fù)雜的樣品前處理及標記過程。這一方法對腫瘤的組織病理學檢測具有極大的應(yīng)用潛力，對腫瘤的外科手術(shù)治療具有潛在的指導(dǎo)價值。Niehaus等人利用LDPI-MSI技術(shù)對生物組織中內(nèi)源性物質(zhì)的分布進行分析，可以通過檢測內(nèi)源物分布及含量變化推測出致病機理。這一方法對組織病理學檢測是一種極大的補充，它可以讓我們看到組織病理學不能給出的分子信息[34]。

3.3 對單細胞的分析

細胞是生命體的基本單元，對細胞的研究是揭露生命的起源以及對生命科學研究的重要途經(jīng)。包括LDPI-MSI在內(nèi)的質(zhì)譜技術(shù)在單細胞分析領(lǐng)域起到越來越重要的作用。目前基于激光的質(zhì)譜技術(shù)對單細胞分析的最大難點是解吸激光難以聚焦到亞微米級，因而無法對亞細胞結(jié)構(gòu)進行成像分析。當?shù)谝皇す饩劢构獍咦銐蛐?，達到亞微米級別時，可以利用LDPI-MSI技術(shù)實現(xiàn)對單細胞進行分析。殷志斌等人將第一束激光引入出口直徑為200 nm左右的光纖中，并配合使用原子力顯微鏡，構(gòu)建了近場激光解吸系統(tǒng)，加上用157 nm激光后電離，實現(xiàn)了對單個癌細胞內(nèi)抗癌藥物的質(zhì)譜成像，成像分辨率高達300 nm[35]。Zavalin等人利用一個N.A.值接近1的聚焦透鏡，將解吸激光聚焦到1 μm左右[36]。Niehaus等人將樣品貼附在玻璃片的另一面，激光透過玻璃片照射在樣品的背面，高能激光就可以穿透樣品，從而完成對樣品的解吸，實現(xiàn)了對細胞內(nèi)的磷脂類物質(zhì)進行了質(zhì)譜成像分析，分辨率達到亞微米級[34]。值得一提的是，他們的解吸激光波長為355 nm，同時在樣品上噴涂MALDI技術(shù)用的基質(zhì)，實現(xiàn)了對細胞的內(nèi)源物質(zhì)的高分辨質(zhì)譜成像。

4 結(jié)論與展望

質(zhì)譜技術(shù)以其高靈敏度和高分辨率在生物醫(yī)學檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，例如藥物分子代謝產(chǎn)物的動態(tài)分析、腫瘤標志物的鑒定、蛋白組學分析等。在最近20年間發(fā)展起來的質(zhì)譜成像技術(shù)，尤其是生物組織分子質(zhì)譜成像已經(jīng)逐步進入生物醫(yī)學分析領(lǐng)域。本論文詳細介紹了LDPI-MSI的基本原理、構(gòu)建LDPI的兩束激光源的選擇、影響LDPI-MS參數(shù)優(yōu)化以及其在生物醫(yī)學分析研究中的應(yīng)用?？梢灶A(yù)見，高空間分辨率質(zhì)譜分子成像及高靈敏度、高通量質(zhì)譜檢測技術(shù)將在生物醫(yī)學、藥學等各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，同時這對儀器的靈敏性、便攜化、穩(wěn)定性提出了更高的要求。國內(nèi)質(zhì)譜技術(shù)的迅猛發(fā)展及國產(chǎn)質(zhì)譜儀的產(chǎn)業(yè)化也將助推LDPI-MSI技術(shù)與生物醫(yī)學分析的融合，助力生物醫(yī)學分析的發(fā)展。