姬松茸發(fā)酵液多糖的分離純化及其抗疲勞作用研究*

黎 軼

（宜春學(xué)院體育學(xué)院，江西 宜春 336000）

姬松茸（Agaricus blazei Murrill），屬于蘑菇科（Agaricaceae） 擔(dān)子菌，具有一定的藥用和食用價(jià)值，富含糖類和蛋白質(zhì)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，姬松茸發(fā)酵液中多糖（AbEXP1-a）具有較強(qiáng)的抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力的作用，但是在這方面的研究還處于啟蒙階段[1]。通過對姬松茸發(fā)酵液多糖的分離純化方法進(jìn)行全面整理，分析純化多糖的理化性質(zhì)，同時(shí)對其抗疲勞的作用進(jìn)行深入探究，為姬松茸發(fā)酵液多糖的結(jié)構(gòu)關(guān)系、生物性質(zhì)等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)使用從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌研究所采購的姬松茸菌種，編號(hào)華農(nóng)姬松茸1號(hào)。

試驗(yàn)使用儀器包括：HITACHI Himac CR21G高速冷凍離心機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；MB99-3型自動(dòng)液相色譜分離層析儀，上海滬西分析儀器廠；UV-1100紫外可見分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；DYY-5（8B） 型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 姬松茸發(fā)酵液多糖的分離純化

1.2.1 制備胞外粗多糖

對姬松茸深層發(fā)酵液用超濾儀進(jìn)行過濾（1 000 mL粗多糖液含多糖13.00 mg·mL-1、蛋白質(zhì)6.23 mg·mL-1）、純化，去除全部菌絲體，使用冷乙醇進(jìn)行沉淀，在4℃的環(huán)境中靜置12 h，使用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇對沉淀物進(jìn)行洗滌，再用60℃熱水溶解，10 000 r·min-1離心去除雜質(zhì)，對上清液進(jìn)行二次離心處理，干燥后得到姬松茸胞外粗多糖，顏色為棕色。

1.2.2 脫蛋白

將三氯甲烷、正丁醇配制成體積比為4∶1的Sevage混合液。將上述糖溶液稀釋成濃度2 mg·mL-1，取150 mL與50 mLSevage試劑（5∶1） 混合，充分振蕩30 min，在分液漏斗中靜置3 h分層。下層白色絮狀沉淀為蛋白質(zhì)層，分液除去，上層為多糖溶液。此過程重復(fù)3次。

1.2.3 脫色

加入濃度為20%的過氧化氫，將多糖溶液的pH調(diào)至8.0，多糖溶液呈現(xiàn)出淡黃色，在45℃的環(huán)境中靜置2 h，將蒸餾水加入到脫色液中透析2次，使用體積為3倍的乙醇對其進(jìn)行沉淀處理。

1.2.4 DEAE-Cellulose柱層析

在裝柱以前需要對其進(jìn)行DEAE-Cellulose(OH-)常規(guī)預(yù)處理，使用蒸餾水平衡4個(gè)柱體積。柱的規(guī)格設(shè)置為1.3 cm×30 cm，裝填的高度需要保持在30 cm左右，上樣量需要控制在100 mg左右。先使用蒸餾水對其進(jìn)行洗脫；再用0.1 mol·L-1、0.3 mol·L-1和 0.5 mol·L-1的 NaHCO3進(jìn)行洗脫；最后使用0.1 mol·L-1的NaOH洗脫[2]。速度需要保持在0.3 mL·min-1左右，每一管的收集高度需要保持在3 mL左右。跟蹤檢測的時(shí)候，需要使用苯酚-硫酸法，需標(biāo)注。

1.2.5 Sephadex G-200柱層析

在裝柱以前需要對其進(jìn)行Sephadex G-200常規(guī)預(yù)處理，使用蒸餾水對其進(jìn)行24 h的平衡。柱的規(guī)格設(shè)置為1.6 cm×50 cm，裝填的高度保持在50 cm，上樣量控制在20 mg。先使用雙蒸水對其進(jìn)行洗脫；接著使用0.1 mol·L-1的NaCl洗脫。速度需要保持在0.15 mL·min-1，每一管的收集高度需要保持在3 mL。跟蹤檢測的時(shí)，需要使用苯酚-硫酸法[3]。

1.2.6 鑒定純度

使用凝膠過濾法和醋酸纖維薄膜電泳法2種方法對純度進(jìn)行鑒定。

1）凝膠過濾法：Sephadex G-200色譜柱，使用蒸餾水進(jìn)行洗脫，柱的規(guī)格為1.6 cm×50 cm，上樣量控制在20 mg左右。速度保持在0.15 mL·min-1，每一管的收集高度保持在3 mL。跟蹤檢測的時(shí)候，使用苯酚-硫酸法[4]。

2） 醋酸纖維薄膜電泳法：緩沖液為0.025 mol·L-1硼砂，pH9.3，電壓250 V，醋酸纖維薄膜規(guī)格為2 cm×8 cm，電泳時(shí)間設(shè)置為40 min左右，使用西夫試劑和阿利新藍(lán)染色，使用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇進(jìn)行漂洗[5]。

1.2.7 測定分子量

在進(jìn)行測定的時(shí)候，需要按照2000年版中國藥典二部附錄中規(guī)定的多糖分子量分步測定法進(jìn)行操作。選取10 mg多糖AbEXP1-a樣品，添加1 mL流動(dòng)相使其完全溶解，離心處理以后，選取20 μL作為樣量，專用Beck-man System Gold GPC軟件完成色譜數(shù)據(jù)處理。

1.2.8 紫外掃描

將多糖AbEXP1-a配制成濃度為1 g·L-1的水溶液，紫外掃描需要在波長200 nm～400 nm區(qū)間完成。

1.3 姬松茸胞內(nèi)多糖抗疲勞作用

1.3.1 試驗(yàn)對象

選取的小鼠由煙臺(tái)綠葉制藥集團(tuán)提供，種類為昆明系小鼠，雄性，出生2個(gè)月左右，體重35 g左右，將其分為多糖組和對照組2組，每組50只。

1.3.2 灌胃動(dòng)物模型

多糖組：依據(jù)《藥用實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中規(guī)定的成人劑量來對小鼠的用藥劑量進(jìn)行設(shè)置，使用藥劑量可以達(dá)到成人的5倍左右。小鼠的標(biāo)準(zhǔn)體重設(shè)置為30 g，每日攝取0.2 mL·kg-1的姬松茸多糖制劑，早晚各1次進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃3周。對照組：使用濃度為0.2 mL·kg-1生理鹽水連續(xù)灌胃3周。

1.3.3 測試指標(biāo)及測試方法

1） 力竭游泳時(shí)間

將重量為小鼠體重5%的鉛絲系在鼠尾，迫使其游泳直到沉底10 s為止，具體方法為實(shí)驗(yàn)開始前3 d，每天每只小鼠適應(yīng)性游泳20 min，水溫控制在（20±10）℃，水深40 cm，隨后進(jìn)行無負(fù)重游泳訓(xùn)練（游泳過程中用玻璃棒驅(qū)趕小鼠，避免小鼠漂浮在水面上，游泳結(jié)束后用毛巾擦干并用電暖扇幫助小鼠取暖防止感冒），每天晚上20點(diǎn)開始，將各組小鼠放入80 cm×60 cm×50 cm的塑料泳池中強(qiáng)制游泳90 min，前4周除周日休息外，第五周的周六進(jìn)行力竭游泳訓(xùn)練并記錄具體的力竭時(shí)間。記錄游泳時(shí)間。

2） 耐缺氧試驗(yàn)

最后給藥1 h以后，將其放置在250 mL廣口瓶內(nèi)，瓶中放置堿石灰10 g，使用石蠟將瓶口封住。將小鼠進(jìn)入瓶內(nèi)到死亡的時(shí)間進(jìn)行記錄[6]。

3） 測定血紅蛋白

使用氰化高鐵血紅蛋白法對血紅蛋白進(jìn)行測定，具體方法：小鼠連續(xù)灌胃10 d，末次給藥30 min后，讓小鼠自由游泳5 min取出，斷頭取血。血樣于冰箱中靜置后，3 500 r·min-1離心10 min，取上清液，測定血清中血紅蛋白含量[7]。

4） 血乳酸水平

將重量為小鼠體重5%的鉛絲系在鼠尾，迫使其游泳20 min后采鼠尾血，使用血乳酸測試試劑條完成血乳酸水平測試[8]。

5） 測定血尿素

力竭游泳結(jié)束后，采眼眶血，使用中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)的試劑盒對所選取的100 μL血清進(jìn)行測試，使用7 200型分光廣度計(jì)完成血尿素的測定[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 姬松茸粗多糖脫蛋白、脫色

使用雙蒸水溶解棕色粉末狀姬松茸粗多糖，在脫蛋白、脫色處理以后進(jìn)行醇沉，干燥后為淡黃色粉末。

2.2 多糖的DEAE-Cellulose柱層析

使用雙蒸水溶解多糖AbEXP-a，使用水，0.1 mol·L-1、0.3 mol·L-1和 0.5 mol·L-1的 NaHCO3以及0.1 mol·L-1的 NaOH 洗脫。

水，0.1 mol·L-1和 0.3 mol·L-1的 NaHCO3分別洗脫出了3種含量較多的多糖AbEXP1、AbEXP2和AbEXP3 成分；而 0.5 mol·L-1的 NaHCO3和 0.1 mol·L-1的NaOH沒有洗脫峰值出現(xiàn)。對AbEXP1和AbEXP2進(jìn)行收集，同時(shí)純化處理多糖AbEXP1。

2.3 多糖的Sephadex G-200柱層析結(jié)果

將多糖AbEXP1溶解，上平衡好的Sephadex G-200凝膠柱，依次用雙蒸水和0.1 mol·L-1的NaCl溶液洗脫，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，層析AbEXPl后，獲得AbEXP1-a和AbEXP1-b，使用0.1 mol·L-1的NaCl繼續(xù)洗脫沒有結(jié)果。對AbEXP1-a進(jìn)行醇沉和濃縮處理，最終獲得白色晶體，并對這些白色晶體的純度進(jìn)行鑒定，同時(shí)對其理化性質(zhì)進(jìn)行研究。

2.4 鑒定多糖AbEXPl-a純度

多糖純度與普通化合物純度概念不一樣，主要是指在一定的分子量中體現(xiàn)出的均一性。使用醋酸纖維薄膜電泳法和Sephadex G-200凝膠過濾色譜法[4]對其進(jìn)行鑒定，結(jié)果見圖2。

從圖2可知，多糖AbEXP1-a經(jīng)Sephadex G-200凝膠過濾呈單一對稱洗脫峰，經(jīng)醋酸纖維薄膜電泳呈現(xiàn)單一天藍(lán)色區(qū)帶，說明AbEXP1-a為均一組分。

2.5 多糖AbEXP1-a的性質(zhì)

多糖AbEXP1-a為白色晶體，與稀釋的酸、堿和鹽溶液相溶，與熱水快速相溶，與甲醇和乙醇微溶，不會(huì)與有機(jī)溶劑如乙酸乙醋、氯仿、丙酮和乙醚等相溶。多糖AbEXP1-a在碘-碘化鉀反應(yīng)和菲林試劑反應(yīng)中體現(xiàn)出陰性，說明其不屬于淀粉物質(zhì)，還原端所占比例較低；在福林-酚反應(yīng)和蔥酮-硫酸反應(yīng)中體現(xiàn)為陽性，紫外掃描的吸收峰體現(xiàn)在圖譜波長280 nm處，說明其含氮元素。綜上所述，多糖AbEXP1-a為結(jié)合有蛋白質(zhì)類。

采用高效液相色譜法測定多糖AbEXP1-a的分子量，其保留時(shí)間為15.09 min，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，得出其分子量為50 kD（以右旋糖苷計(jì)）。

2.6 小鼠機(jī)體抗疲勞試驗(yàn)結(jié)果

姬松茸胞內(nèi)多糖抗疲勞作用的具體情況見表1。

表1 姬松茸發(fā)酵液多糖對小鼠機(jī)體抗疲勞能力的影響Tab.1 Effect of Polysaccharide from Agaricus blazei fermentation broth on anti fatigue ability of mice

由表1可知，在力竭即刻，多糖組小鼠的血乳酸含量與對照組相比顯著性降低（P＜0.05，P＜0.01）；各組小鼠的血尿素氮濃度對比中，多糖組的血尿素氮濃度均顯著低于對照組（P＜0.05）；其力竭游泳時(shí)間及耐缺氧時(shí)間多糖組數(shù)據(jù)均優(yōu)于對照組（P＜0.05）；提示經(jīng)過24 h的恢復(fù)和休息，機(jī)體的血乳酸水平恢復(fù)正常。

3 結(jié)論

經(jīng)過對姬松茸胞內(nèi)多糖抗疲勞作用的認(rèn)真研究以后發(fā)現(xiàn)，姬松茸胞內(nèi)多糖可以使小鼠的缺氧時(shí)間和負(fù)重游泳時(shí)間得到不斷的延長，由此可見，姬松茸多糖可以提高機(jī)體應(yīng)激因子的使用能力。陳智毅[9]研究表明姬松茸可以給循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激作用，可以有效增加“下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)”系統(tǒng)的反射性功能，通過不斷地自我調(diào)節(jié)，使其能夠快速的適應(yīng)惡劣的環(huán)境，表明姬松茸多糖的抗疲勞作用顯著。姬松茸胞外多糖AbEXP1-a的分子量正好處于大分子可溶性活性多糖的范圍以內(nèi)，這就表明姬松茸多糖可以有效提升免疫力[10]。經(jīng)過大量的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，姬松茸發(fā)酵菌絲體中的粗多糖含量要比姬松茸實(shí)體中的含量高很多，對姬松茸的深層發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行全面的推廣，將使其在保健品研發(fā)過程中發(fā)揮積極的促進(jìn)作用[11]。