半夏疏松愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖的研究

陶興魁，高貴珍，張興桃，王海潮

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

半夏Pinellia ternata(Thunb.) Breit.是天南星科半夏屬多年生草本植物，主要分布在我國長江流域以及東北、華北等地區(qū)。在《中國藥典》中收錄的半夏，以干燥塊莖入藥，是一種重要的中藥材。半夏含有多種化學(xué)成分，具有多種藥理活性，具有降逆止嘔，抗腫瘤、鎮(zhèn)咳、抗炎等藥理作用[1-2]。半夏野生資源由于連年過度采挖，瀕臨枯竭；傳統(tǒng)的人工栽培育種，周期長，繁殖系數(shù)不高，再加上受到病毒的侵害，導(dǎo)致藥材產(chǎn)量不足，質(zhì)量不高，藥效減弱等情況[3-4]。近些年，國內(nèi)外的學(xué)者利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)在繁育半夏以及品種改良工作上做了大量工作，一定程度上緩解了半夏藥材的供應(yīng)需求[5]。半夏懸浮培養(yǎng)是組織培養(yǎng)技術(shù)的有效途徑，本文通過誘導(dǎo)半夏莖段愈傷組織，以期獲得生長快、疏松型的愈傷組織，為半夏細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)材料和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

半夏采自安徽省淮北市濉溪縣飛龍中藥材科技開發(fā)研究所，經(jīng)淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院薛建平教授鑒定為天南星科植物半夏。

1.2 方法

1.2.1 半夏疏松愈傷組織的誘導(dǎo)

半夏塊莖播種于沙土中萌發(fā)，取3～5 cm 長的幼嫩葉柄，用75% 酒精浸30 s，無菌水沖洗3 次，再用0.1%升汞溶液泡8 min，無菌水沖洗4～6 次，無菌濾紙吸干表面水分，將其切成長1.0 cm 的小段，分別接種于單獨(dú)或配比使用2,4-D、KT 兩種植物生長物質(zhì)的MS基本培養(yǎng)基上（0.7%瓊脂，3%蔗糖，pH 5.8，培養(yǎng)室溫度溫度25±1 ℃）。35 d 后統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基上外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.2 半夏疏松愈傷組織的增殖培養(yǎng)

挑選質(zhì)地、顏色相似的疏松愈傷組織，在超凈工作臺(tái)上接種于附加不同植物生長物質(zhì)（2，4-D、NAA和6-BA）配比的培養(yǎng)基上，參照楊振堂等的方法按下式計(jì)算增長量：增長率=(W-W0)/W0[6]（W：25 d 后收獲的愈傷組織鮮重；W0：接種愈傷組織鮮重）。

2 結(jié)果與分析

2.1 半夏疏松愈傷組織的誘導(dǎo)

2.1.1 不同濃度的2，4-D對(duì)半夏愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

結(jié)果表明（表1），2，4-D 對(duì)半夏愈傷組織的誘導(dǎo)效果顯著，誘導(dǎo)的愈傷為淡黃色、疏松的愈傷組織。當(dāng)2,4-D 濃度為0 mg/L 時(shí)，外植體不形成愈傷組織，直接分化成小塊莖；當(dāng)2,4-D 的濃度為1.5 mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)率最高達(dá)89.8%，而且生長勢(shì)最好（圖1），當(dāng)2,4-D 的濃度超過2.0 mg/L 時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率急劇下降，而且愈傷組織質(zhì)地堅(jiān)實(shí)，生長勢(shì)差，褐化現(xiàn)象嚴(yán)重（圖2）。

表1 不同濃度2,4-D對(duì)半夏愈傷組織的誘導(dǎo)影響

圖1 1.5 mg/ L 2,4-D誘導(dǎo)形成的疏松愈傷組織

圖2 2.0 mg/ L 2,4-D誘導(dǎo)形成的褐化愈傷組織

2.1.2 不同濃度的KT對(duì)半夏愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

從表2 中可以看出，單獨(dú)使用KT 時(shí)對(duì)半夏葉柄誘導(dǎo)愈傷的整體效果不好，當(dāng)KT濃度為0 mg/L時(shí)，外植體不形成愈傷組織，直接分化成小塊莖；當(dāng)KT濃度為1.5 mg/L時(shí)，其誘導(dǎo)率僅有67.5%，生長勢(shì)較差，但誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織均為淡黃色、顆粒狀的疏松愈傷組織（圖3）。

表2 不同濃度的KT對(duì)半夏愈傷組織誘導(dǎo)的影響

圖3 1.5 mg/ L KT誘導(dǎo)形成的愈傷組織

2.1.3 KT與2,4-D對(duì)半夏愈傷組織的誘導(dǎo)效應(yīng)

當(dāng)KT 濃度為1.5 mg/L 時(shí)，采用不同濃度的2,4-D 研究愈傷組織的生產(chǎn)影響，其具體結(jié)果見表3。隨著2,4-D 的濃度增加，誘導(dǎo)的愈傷組織由堅(jiān)實(shí)變的疏松，顏色也由綠色變?yōu)榈S色，生長速度也加快。當(dāng)2,4-D 為2.0 mg/ L 時(shí)，誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率為82%；但當(dāng)2,4-D 的濃度達(dá)到3.0 mg/ L時(shí)，形成的愈傷組織褐化嚴(yán)重，生長緩慢。

表3 不同濃度2,4-D對(duì)半夏葉柄誘導(dǎo)愈傷組織的影響

當(dāng)2,4-D濃度為2.0 mg/L時(shí)，不同濃度KT對(duì)誘導(dǎo)半夏葉柄形成愈傷組織的影響，其具體結(jié)果見表4。

表4 不同濃度KT對(duì)半夏葉柄誘導(dǎo)愈傷組織的影響

綜合表3 和表4 可知，不同植物激素誘導(dǎo)半夏莖段產(chǎn)生愈傷組織，其質(zhì)地、顏色、生長速度和誘導(dǎo)率均有差異。MS+2.0 mg/L 2,4-D+2.0 mg/L KT 組合誘導(dǎo)愈傷組織效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)98 %。在這種培養(yǎng)基上接種3～5 d后，外植體切口處開始出現(xiàn)膨大、兩端翹起，顏色變淺，1周后看到膨大處出現(xiàn)瘤狀突起（圖4），愈傷組織逐漸延及整個(gè)外植體邊緣，最終培養(yǎng)35 d 左右，得到的愈傷組織為淡黃色、顆粒狀的疏松型愈傷組織，而且生長速度最快(圖5)。

圖4 半夏葉柄形成的瘤狀突起

圖5 半夏葉柄形成的疏松愈傷組織

2.2 半夏疏松愈傷組織的增殖培養(yǎng)

2.2.1 NAA與6-BA對(duì)半夏愈傷組織增殖效應(yīng)的影響

表5 結(jié)果表明，NAA 和6-BA 組合增殖的愈傷組織，較低濃度配比時(shí)增長率較高，高濃度配比時(shí)增長率逐漸降低，而且均為團(tuán)狀、塊狀，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)的愈傷組織。1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA 組合對(duì)愈傷組織的增殖效果最好，增殖率為3.97，不過誘導(dǎo)的愈傷組織多為黃綠色、團(tuán)狀，有的還有綠色芽點(diǎn)出現(xiàn)（圖6）。此種愈傷組織適宜作為半夏組織分化的材料，不適合做懸浮培養(yǎng)的材料。

表5 NAA與6-BA對(duì)半夏愈傷組織增殖效應(yīng)的影響

圖6 在1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA上增殖培養(yǎng)的愈傷組織

2.2.2 2,4-D與6-BA對(duì)半夏愈傷組織增殖效應(yīng)的影響

由表6 可知，2,4-D 和6-BA 組合增殖的愈傷組織大都呈淡黃色、無芽點(diǎn)的愈傷組織。1.5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA 對(duì)于愈傷組織的增殖效果最好，增殖率可達(dá)4.13，而且為疏松、顆粒狀、分散性好的愈傷組織，此種愈傷組織適合作為半夏懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的材料（圖7）。

表6 2,4-D與6-BA對(duì)半夏愈傷組織增殖效應(yīng)的影響

圖7 在1.5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA上增殖培養(yǎng)的愈傷組織

3 討論

半夏組織培養(yǎng)中，獲得生長速度快、疏松型愈傷組織是植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)。為了達(dá)到大量生產(chǎn)的目的，理想的途徑是建立半夏無性系快速繁殖系統(tǒng)。通過對(duì)疏松愈傷組織的增殖培養(yǎng)，為大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物質(zhì)提取提供材料。萬美亮等研究表明，不同植物激素比對(duì)半夏的愈傷組織誘導(dǎo)有著明顯的差異，單一使用生長素和細(xì)胞分裂素效果都不好，需二者適當(dāng)?shù)拇钆涫褂茫?,4-D效果最好，NAA次之[7]。2,4-D濃度超過2.0 mg/L以上愈傷組織的長勢(shì)逐漸漸弱，細(xì)胞分裂素的濃度適宜在0.2～1.0 mg/L。不同學(xué)者研究的結(jié)果也不盡相同，郝會(huì)軍等研究表明，0.5 mg/L 2,4-D 與1.0 mg/L KT 組合有利于愈傷組織形成，誘導(dǎo)率最高[8]。范美華等研究表明，雙因子1.5 mg/L KT +2.0 mg/L 2,4-D組合誘導(dǎo)效果最好，為淡黃色或乳白色的疏松型愈傷組織，也沒有根和芽的分化，適于擴(kuò)大增殖培養(yǎng)[9]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)單獨(dú)使用2,4-D 時(shí)，可以誘導(dǎo)出愈傷組織，而且是淡黃色疏松型的；單獨(dú)使用KT 時(shí)，誘導(dǎo)效果不好。不過也均為疏松型愈傷組織；當(dāng)KT 與2,4-D 組合使用時(shí)，誘導(dǎo)效果較好，KT 與2,4-D 的濃度相對(duì)越高，誘導(dǎo)率越高，當(dāng)2.0 mg/L KT+2.0 mg/L 2,4-D 時(shí)誘導(dǎo)率最高可達(dá)98%。采用6-BA 與2,4-D、NAA 配比使用研究愈傷組織的增殖效應(yīng)，結(jié)果表明，1.5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA 增殖的愈傷組織均為疏松型，淡黃色，無芽點(diǎn)，適合用作細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的材料。這與夏海威等人的研究結(jié)果基本一致[10]。

在繼代增殖過程中，我們既要考慮愈傷組織的生長速度，同時(shí)還要考慮愈傷組織的松散程度、色澤等因素。本試驗(yàn)在愈傷組織增殖過程中，發(fā)現(xiàn)1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L 6-BA 組合對(duì)愈傷組織的增殖效果很好，但誘導(dǎo)的愈傷組織為綠色、團(tuán)狀、有綠色芽點(diǎn)，此種愈傷組織雖然不適合作為細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的材料，但可以為半夏的器官分化和快繁提供材料。另外，還發(fā)現(xiàn)部分愈傷組織出現(xiàn)水分散失，愈傷變得越來越干的現(xiàn)象。因此在半夏愈傷組織的增殖培養(yǎng)過程中，如何既能夠保證增殖率，又能夠提高疏松度、防止水分散失等方面，值得進(jìn)一步深入探討。