TET3在生殖配子發(fā)生和胚胎發(fā)育中的調控作用

傅高惠，楊天浩，李超，白銀山

DNA甲基化修飾是表觀遺傳學修飾最主要的方式之一， 主要通過DNA 甲基轉移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）將甲基轉運至胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）中胞嘧啶上的第五位碳原子上[1]，形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC），阻礙RNA聚合酶結合，進而限制基因轉錄。在哺乳動物細 胞 中，DNMTs 包 括DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L 5種[2]，它們可以分為從頭甲基化轉移酶和維持型甲基化轉移酶兩類。從頭甲基化轉移酶主要包括DNMT3A、DNMT3B 和DNMT3L 3種，在早期胚胎中表達較高，但是在向成體細胞分化過程中表達很低[2]，這類酶可以先將DNA的一條鏈進行甲基化，然后再對另一條鏈進行甲基化，最終完成雙鏈DNA甲基化。維持型甲基化轉移酶主要是DNMT1，其作用于DNA復制過程中，促使新合成的子鏈DNA按照母鏈的DNA甲基化位點進行甲基化，以維持分裂細胞基因組DNA的特定甲基化模式。DNMT1在成體細胞中持續(xù)表達，參與細胞增殖、器官發(fā)育和腫瘤發(fā)生等多方面調控[3]。研究表明這些DNMTs的功能有相互交叉作用，DNMT1也具有從頭甲基化的活性，DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L也具有維持DNA甲基化的作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)DNMT2不能進行DNA甲基化，而是一種RNA甲基化轉移酶，主要負責天冬氨酸t(yī)RNA的甲基化修飾，在胚胎期內臟、肌肉、卵巢和睪丸細胞中高水平表達[5]。DNA甲基化介導的表觀遺傳修飾作用，保證了胚胎和生殖發(fā)育的有序進行。

TET（ten-eleven translocation）家族介導的DNA去甲基化廣泛存在于各種生命活動調控過程。TET1在胚胎發(fā)育中率先被激活，對多能干細胞的干性維持具有重要作用，胚胎干細胞中TET1表達下調可導致干細胞分化和多能性喪失[6]。TET2在造血系統(tǒng)中高表達，影響造血干細胞的增殖與分化，TET2表達缺失將導致功能血液細胞分化受阻，引起惡性血液腫瘤[7]。研究顯示TET3在早期胚胎向神經分化過程中表達上調[8]，促進神經發(fā)育。也有證據(jù)顯示TET3在配子發(fā)育中持續(xù)表達[9]，介導配子基因組甲基化調控，TET3表達缺失可以引起早期胚胎發(fā)育延遲，出生后小鼠生存率低。綜述TET3在配子和胚胎發(fā)育中的調控作用，以期闡述TET3的生物學功能。

1 TET家族介導DNA去甲基化作用

DNA去甲基化作用一般可以通過兩種方式進行，一種是由于DNMTs活性降低或者入核受阻等原因[10]，使得DNA復制后產生的新鏈DNA無法進行甲基化修飾，并且不能維持舊鏈的甲基化模式導致總體DNA甲基化水平下降，這種方式稱為被動去甲基化；另一種去甲基化方式則是由TET家族（包括TET1、TET2和TET3）介導的5-mC氧化作用，這種方式主要以主動的方式進行（見圖1）[11]。

TET家族成員可以將5-mC氧化生成5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethyluracil，5-hmC）、5-甲酰基胞嘧啶（5 formylcytosine，5-fC）和5-羧甲基胞嘧啶（5 carboxylcytosine，5-caC）[11]，其中5-hmC在胞苷脫氨酶（activation-induced cytidinedeaminase，AID）作用下脫氨生成5-羥甲基尿嘧啶（5-hydroxymethyluracil，5-hmU），5-hmU被胸腺DNA糖化酶（thymine-DNA glycosylase，TDG）識別并切除，激活堿基切除修復（base excision repair，BER）途徑，實現(xiàn)DNA主動去甲基化。此外，AID也可促進5-mC生成胸腺嘧啶[12]，引起TDG切除完成主動去甲基化。5-fC和5-caC可被TDG識別并切除，啟動細胞內BER途徑，將其替換為胞嘧啶，最終完成DNA的主動去甲基化。TET家族氧化5-mC生成的5-hmC也會使DNMT1的活性降低，隨著DNA復制過程的進行，DNMT1不能維持DNA新鏈上的甲基化水平，導致被動去甲基化，而5-mC氧化生成的5-hmC、5-fC和5-caC在DNA復制過程中不斷被稀釋，最終完成被動去甲基化[13]。而在細胞分裂過程中DNMT1是否會抑制TET家族去甲基化作用從而維持DNA的甲基化狀態(tài)，目前尚無證據(jù)。

圖1 TET家族介導DNA去甲基化過程

TET3在生殖發(fā)育中發(fā)揮重要調控作用，其在卵母細胞中高表達，介導受精卵中父系基因組和母系基因組的去甲基化調控。但研究發(fā)現(xiàn)在受精卵中TDG表達水平非常低，當DNA復制受阻時可以導致5-mC氧化產物的積累[14]，提示在受精卵中TET3介導5-mC生成的產物可能并不是通過TDG清除的，而是依賴于DNA復制完成的。此外，TET3也受到一些因子的修飾調控，如乙酰氨基葡萄糖轉移酶（O-linked β-N-acetyl glucosamine transferase，OGT）可以促使TET3向細胞核外轉運[15]，從而抑制其去甲基化調控作用；AID在初級卵母細胞中開始大量表達，在受精卵中可促進TET3的去甲基化作用[12]。

2 TET3的結構特征

TET3蛋白主要存在3種亞型（見圖2）[16]，分別為TET3（FL）、TET3（O）和TET3（S）。其中TET3（FL）結構最復雜，由一個保守的C端催化域和一個N端調節(jié)域組成，C端的催化域由富含半胱氨酸（Cys-rich）、雙鏈β螺旋依賴的雙加氧酶區(qū)（DSBH）及間隔區(qū)組成，稱為CD催化結構域，CD結構域可以與DNA上5-mC結合并氧化成為5-hmC；N端的調節(jié)域則由CXXC型鋅指結構域組成，可以介導TET3（FL）優(yōu)先識別和結合DNA中富含CpG的區(qū)域[17]。TET3（O）是由位于TET3（FL）起始密碼子上游約5 kb的另一種啟動子轉錄表達的，N端缺失CXXC結構域，但替代的是含有11個氨基酸的小肽[16]，這個小肽的作用機制尚不明確。TET3（S）和TET3（FL）是由同一個啟動子轉錄翻譯形成，但其N端的CXXC結構域序列被作為內含子選擇性剪切而被去除；TET3（S）的其他部分與TET3（FL）相同，與TET（O）相比少了11個氨基酸的小肽。研究發(fā)現(xiàn)TET3（S）和TET3（O）的氧化活性比TET3（FL）高，原因是CXXC結構域的優(yōu)先識別能力使TET3（FL）在基因序列上的轉移被限制，從而降低TET3（FL）對整體基因組的氧化活性[16]。TET3（S）和TET3（O）沒有CXXC結構域，因此沒有對特定基因組序列的識別能力。TET3（FL）和TET3（S）在胚胎干細胞向神經元分化過程中表達水平顯著上調，而TET3（O）僅特異性表達于卵母細胞[18]，提示TET3的3種亞型也具有組織和階段特異性，分布在不同組織細胞內可能發(fā)揮不同的調控作用。

圖2 TET3蛋白的亞型

3 TET3在生殖發(fā)育中的調控作用

哺乳動物胚胎發(fā)育時，基因組經歷了兩次大規(guī)模的建立甲基化和去甲基化過程，TET家族在這個過程中也呈現(xiàn)動態(tài)變化（見圖3）[19]，表明TET家族介導的DNA甲基化調控在胚胎發(fā)育中具有重要作用。TET家族通過DNA甲基化調控實現(xiàn)了基因表達的時序性，促進胚胎發(fā)育和不同組織器官的分化。

3.1 TET3在小鼠胚胎發(fā)育中的調控作用TET家族在不同組織器官中的分工和調控作用存在很大差異。Gu等[20]通過條件性基因敲除將原始生殖干細胞（primordial germ cells，PGCs）中的TET3基因敲除，這類缺失TET3基因表達的雌性小鼠性成熟后和野生型雄性小鼠交配，后代中產生TET3雜合小鼠胚胎，研究顯示這類胚胎可以正常發(fā)育至囊胚期，但在胚胎發(fā)育后期出現(xiàn)大量的死亡，只有少數(shù)小鼠出生，并且也存在很大比例的死亡。提示TET3在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用，猜測TET3表達不足造成早期胚胎基因組去甲基化水平不足[21]，引起關鍵組織器官分化障礙，造成胎兒早期和出生后死亡。

TET1敲除的小鼠可以存活并具有生育能力[22]，無形態(tài)和生育缺陷，但神經祖細胞增殖和神經發(fā)生相關的基因出現(xiàn)異常甲基化，小鼠表現(xiàn)出短期記憶和空間學習能力下降的現(xiàn)象。TET2敲除的小鼠同樣具有正常形態(tài)和生育能力[7]，但會引起造血干細胞或造血祖細胞的自我更新能力增強，使造血系統(tǒng)的發(fā)育出現(xiàn)異常，導致血液腫瘤的產生。

TET1/2均敲除的小鼠也可以存活并具有生育能力[23]，但有一部分胚胎會在胚胎晚期及出生后死亡，存活的雌性小鼠卵巢變小、生殖能力降低，雄性卻表現(xiàn)正常。研究顯示在PGCs中，敲除TET1/2會導致減數(shù)分裂相關基因的缺陷，如聯(lián)會復合體蛋白1（synaptonemal complex protein 1，Sycp1）等基因表達下降[24]，從而導致雌鼠卵母細胞數(shù)量顯著減少、生殖能力降低和卵巢體積顯著變小。敲除TET1/2的PGCs印記基因會出現(xiàn)超甲基化，但敲除TET1/2雄性小鼠的后代中印記基因異常發(fā)生率較低[23]，這可能與TET3在出生后動物的精子發(fā)育中發(fā)揮主要調控作用有關，提示在TET1/2缺失的情況下，TET3在生殖細胞發(fā)育過程中起到補償作用，而在PGCs期TET3表達水平低，無法起到對TET1/2缺失的補償作用。敲除TET1/3的小鼠胚胎發(fā)育至10.5 d（embryonic day 10.5，E10.5）后均不能繼續(xù)發(fā)育，與正常胚胎相比出現(xiàn)發(fā)育延遲、胚胎期細胞凋亡等[25]，顯示TET1和TET3在早期胚胎發(fā)育中具有重要作用。這些實驗證實TET家族介導的去甲基化作用，促使小鼠胚胎正常發(fā)育和正常的配子發(fā)育功能，其中TET3在小鼠早期胚胎發(fā)育中起主要作用。

3.2 TET家族在PGCs中的調控作用在小鼠中，PGCs在胚胎發(fā)育至E6.25的上胚層中出現(xiàn)（見圖3）[26]，此后經歷遷移和定植，最終分化為精子或卵子。PGCs通過甲基化修飾建立印記和向配子分化，其發(fā)育過程經歷了兩個階段的全基因組去甲基化過程[27]。第一階段發(fā)生在PGCs增殖和遷移期間的E7.25～E9.5，雖然這個階段中TET1/2存在表達，而TET3的表達水平很低，但是研究表明這個時期5-mC去甲基化主要依賴于DNA復制被動去除[28]。第二階段在E9.5～E13.5，該階段TET1/2在PGCs中也存在表達，并在E10.5～E11.5達到峰值[26]，而TET3表達仍然處于很低的水平，研究證明在這個時期中TET1/2介導了PGCs基因組的主動去甲基化，但研究發(fā)現(xiàn)敲除TET1/2后PGCs發(fā)育過程中整體基因組的去甲基化并未受到影響[28]，表明這個階段PGCs基因組去甲基化也可以通過DNA復制來完成。

3.3 TET3在精子發(fā)育中的調控作用精子發(fā)育是一個極其復雜的細胞分化和形態(tài)改變的過程。雄性小鼠性腺中的PGCs在E13.5后開始建立父方印記，雄性小鼠出生之后PGCs 已分化為生殖母細胞（gonocyte）[29]，然后從曲細精管中間遷移至曲細精管基底膜上分化成為A型精原細胞，隨后精原細胞經過一系列分化生成精母細胞，再經過減數(shù)分裂后產生單倍體精子細胞，單倍體精子通過劇烈的形態(tài)變化形成成熟的精子（見圖3）。精子發(fā)育是逐漸建立甲基化和關閉功能基因的過程，DNA甲基化修飾在精子發(fā)育過程中起到了非常重要的作用。研究顯示小鼠精子發(fā)生過程中8個階段的精原細胞5-hmC的表達呈動態(tài)變化[9]，剛分化的精原細胞表達水平最高，然后逐漸降低，在所有類型的精原細胞里TET3的表達水平都顯著高于TET1/2，說明在精原細胞分化過程中5-hmC主要由TET3氧化產生，隨著精子發(fā)育的進行，精子基因組逐漸建立高甲基化的過程，TET家族和5-hmC表達水平都隨之降低。5-hmC在精子細胞的一些功能基因和piRNA（Piwi-interacting RNA）前體基因的啟動子區(qū)域呈現(xiàn)的高水平分布[9]，促進了這些功能基因和piRNA的轉錄，對維持精子發(fā)育起到了重要的調控作用。而TET家族對精原細胞分化的調控作用尚未有更好的闡釋，其中表達最高的TET3是否參與維持精子分化調控也沒有相關數(shù)據(jù)。

生殖干細胞和胚胎干細胞基因組5-hmC表達水平相近[9]。有證據(jù)顯示TET3在小鼠精原干細胞中高表達[30]，而TET1/2則在胚胎干細胞中高表達[23]，這也說明TET3對精原干細胞的5-hmC起主要的調控作用，而胚胎干細胞中5-hmC表達水平則是依靠TET1/2氧化產生，揭示了TET家族在發(fā)育階段的特異性和細胞表達的差異性。

3.4 TET家族在成熟精子中的調控作用正常成熟精子的5-hmC含量只有血液的32.59%[31]，這與正常成熟精子基因組的低轉錄活性相一致，5-hmC的低表達使得成熟精子基因組的轉錄活性顯著低于血液。研究發(fā)現(xiàn)TET1和TET3在人圓形精子細胞至伸長型精子細胞中持續(xù)表達，并定位于細胞核中，患有弱精子癥的男性精子中TET1和TET3表達水平顯著低于正常男性，提示TET1和TET3的表達水平與精子活力和凋亡調控息息相關[32]。通過分析各年齡段成年男性成熟精子中5-mC和5-hmC的表達水平與精子質量的相關性，發(fā)現(xiàn)隨著男性年齡增長精子中5-mC的年增長率為1.76%，而5-hmC的年增長率約為5%，一般而言精子整體DNA甲基化模式是穩(wěn)定的，而老年男性精子中5-mC含量的增加導致精子活力變差[31]。同時，老年男性精子中5-hmC的增漲幅度比5-mC更大，意味著老年男性精子與青年男性精子相比，5-hmC在基因組中發(fā)生異常增加，從而可能導致成熟精子基因組中發(fā)生轉錄激活，這也說明成熟精子中5-hmC水平對于維持精子基因組甲基化模式的穩(wěn)定和受精能力同樣具有重要作用[33]，但目前尚無證據(jù)證明這些變化是否對后代產生變異，而精子中5-hmC表達水平是否由TET3調控產生也缺乏相關數(shù)據(jù)證明。

圖3 生命周期中TET3表達水平

3.5 TET3在卵母細胞中的調控作用與精子發(fā)育過程不同，卵母細胞發(fā)育過程建立的甲基化大約只有基因組的40%，大片的低甲基化區(qū)域與其高轉錄活性相對應[10]。卵母細胞內富含促進早期胚胎發(fā)育的功能蛋白的RNA，是胚胎發(fā)育的重要物質保證。研究顯示在體細胞核移植的胚胎中普遍存在異常甲基化的現(xiàn)象[34]，體細胞核移植后TET3在卵母細胞中過表達，可以啟動DNA去甲基化，提高了體細胞核移植胚胎的發(fā)育率。TET3的表達及調控功能在卵母細胞中受到諸多因子調節(jié)。在初級卵母細胞中TET3被Cullin-RING 泛素連接酶4 （Cullin-RING finger ligase-4，CRL4）復合物調控[35]，維持初級卵母細胞發(fā)育相關基因如Sohlh1/2、Nobox 和Figla 等的表達。PGC7作為重要的母源因子在卵母細胞中高表達[36]，其可以與TET3結合，抑制TET3的氧化活性，保護受精后母系基因組不受TET3介導的去甲基化作用，同時PGC7也可以促使印記基因（母系印記基因Peg1、Peg3、Peg5和父系印記基因H19和Rasgrf1）不被去甲基化。也有研究顯示PGC7缺失可使卵母細胞的基因組過甲基化[37]，達到與精子基因組甲基化相似的水平，導致成熟卵子質量降低。此外，延伸復合體3（elongator complex 3，ELP3）在卵母細胞中開始表達[38]，在受精卵基因組激活后表達下降，并參與了受精卵中雄原核的去甲基化，但其是否與TET3相互作用尚不清楚。

4 展望

隨著表觀遺傳修飾研究方法的不斷發(fā)展，已有研究揭示DNA甲基化在胚胎發(fā)育中的動態(tài)變化，而TET3在生殖發(fā)育過程中的表達提示TET3介導的DNA去甲基化在其中發(fā)揮了重要的調控作用，但其調控機制有待進一步明確。既往研究對TET1/2介導的DNA去甲基化調控在早期胚胎發(fā)育及腫瘤發(fā)生中的作用已經進行了很好的闡釋，但對TET3的調控功能還存在很多未知。本文重點對TET3介導甲基化調控在配子和胚胎發(fā)育中的作用進行闡述，以期促進TET3的功能性研究，完善在生殖發(fā)育中TET3介導的表觀遺傳學調控機制研究。