基于盆栽試驗(yàn)的苯并噻唑硫酮對(duì)感染青枯病煙株根圍土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

向立剛，汪漢成，郭 華，李芝義，鄭 蘋(píng)，蔡劉體，余知和

1.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽(yáng)市龍灘壩路29號(hào) 550081 2.長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北省荊州市荊秘路88號(hào) 434025 3.貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴陽(yáng)市八鴿巖路101號(hào) 550004 4.荊州市荊州區(qū)馬山鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，湖北省荊州市荊州區(qū)馬山鎮(zhèn)馬南路28號(hào) 434031

煙草青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種典型的細(xì)菌性土傳病害［1］，該病傳播速度快、分布范圍廣，在我國(guó)各煙區(qū)均有發(fā)生，是煙草生產(chǎn)中常見(jiàn)的病害之一［2］。由于煙葉生產(chǎn)中的連作、農(nóng)藥化肥過(guò)量使用，造成土壤理化性質(zhì)改變、化感自毒物質(zhì)增加、病蟲(chóng)害發(fā)生加?。?-5］。研究表明，煙草連作年限越長(zhǎng)，煙田土壤細(xì)菌多樣性與均一度越低，青枯病發(fā)生越嚴(yán)重［6-8］。而合理輪作能提高煙田土壤品質(zhì)，改善土壤微生物環(huán)境［9-11］。常見(jiàn)輪作模式有烤煙—油菜［12］、烤煙—小麥［13］、烤煙—馬鈴薯［14］和烤煙—玉米［15］等。王欣英等［16］試驗(yàn)表明，玉米根系分泌物具有抑制煙草疫霉菌孢子萌發(fā)作用，通過(guò)烤煙—玉米輪作能調(diào)節(jié)土壤理化性質(zhì)、改善微生物群落結(jié)構(gòu)，減少煙田土壤病害的發(fā)生率。孟玉芳等［17］研究發(fā)現(xiàn)，玉米根系分泌物能在短時(shí)間內(nèi)殺死煙草疫霉游動(dòng)孢子，并抑制其萌發(fā)，進(jìn)而減輕煙草疫霉菌對(duì)煙株的侵染。玉米根系分泌物中對(duì)土壤病原菌起抑制作用的主要成分為苯并嗪類(lèi)化合物丁布及其降解產(chǎn)物［18］。3-甲基-2（3H）苯并噻唑硫酮（簡(jiǎn)稱(chēng)苯并噻唑硫酮）作為玉米根系分泌物之一，本課題組在前期青枯病防治研究中發(fā)現(xiàn)，其灌根處理對(duì)煙草青枯病有較好的防治作用，而目前有關(guān)苯并噻唑硫酮防治煙草青枯病應(yīng)用研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。細(xì)菌作為土壤微生物的重要組成部分，在物質(zhì)循環(huán)和能量代謝方面發(fā)揮著重要作用，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和多樣性與植物正常生長(zhǎng)發(fā)育及病害防治密切相關(guān)［19-20］。為此，采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)苯并噻唑硫酮灌根前后感染青枯病煙株根圍土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，旨在明確苯并噻唑硫酮對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為有效防治煙草青枯病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草品種為K326；青枯菌菌株由貴州省煙草科學(xué)研究院植保團(tuán)隊(duì)分離獲得；盆栽土壤采自貴州省煙草科學(xué)研究院福泉基地（107°30′41″E，26°44′48″N）近3年無(wú)土傳病害發(fā)生的煙田。苯并噻唑硫酮（M30000-25G，美國(guó)SIGMA-ALDRICH公司）；DNA試劑盒為 E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（D4015-1，美國(guó)OMEGA公司）；超微量核酸定量光譜儀（NanoDrop 2000，美國(guó) Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 盆栽試驗(yàn)

將供試煙草種子播種于裝有育苗基質(zhì)的專(zhuān)用漂浮育苗盤(pán)中，土壤風(fēng)干混勻后分裝至盆缽中，每盆9.5 kg，40 d后將育苗盤(pán)中的煙苗移栽至盆缽（外徑×高=31.2 cm×19.5 cm）中。盆栽煙株置于開(kāi)放的自然環(huán)境中，按常規(guī)進(jìn)行栽培管理，每5 d澆水和施肥1次。

1.2.2 試驗(yàn)處理與樣品采集

煙株移栽后第26天，選取20株長(zhǎng)勢(shì)均勻的煙株，用1.0×108CFU/mL的青枯菌菌液灌根，每株的菌液用量50 mL，沿?zé)熤昵o基部灌入，并用鐵锨在根部人為制造傷口，便于病菌侵染。接菌2 d后配制苯并噻唑硫酮藥液，取0.2 g苯并噻唑硫酮原藥溶于10 mL無(wú)水乙醇中，待藥劑完全溶解后加入990 mL滅菌蒸餾水配制成1 L藥液。將20株煙隨機(jī)分為2組，處理（JY）為100 mL苯并噻唑硫酮藥液灌根，對(duì)照（CK）為100 mL滅菌蒸餾水灌根。

處理與對(duì)照各隨機(jī)選取3株煙并作標(biāo)記，參照閆歡等［21］根圍土壤的采集方法，分別于灌根處理當(dāng)天（0 d）、灌根后2、7、20和40 d采集煙株根圍土壤樣品，采集樣品編號(hào)見(jiàn)表1。采集樣品迅速裝入無(wú)菌取樣袋中，帶回試驗(yàn)室置于-80℃冰箱中保存、備用。煙草青枯病等級(jí)分類(lèi)參照GB/T 23222—2008［22］。

表1 采集樣品編號(hào)Tab.1 Serial numbers of collected samples

1.2.3 樣品DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序

每個(gè)土壤樣品混合均勻后取0.5 g，采用DNA試劑盒提取樣品DNA，具體步驟按其操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用超微量核酸定量光譜儀檢測(cè)提取的DNA濃度與純度，并用無(wú)菌水將樣品DNA稀釋至20 ng/μL。

以樣品DNA為模板，采用引物338F（5'-ACTC CTACGGGAGGCAGCAG-3'）和 806R（5'-GGACT ACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)。PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序參照謝紅煉等［23］的方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。純化后樣品由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Miseq PE300平臺(tái)（美國(guó)Illumina公司）進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Trimmomatic軟件［24］對(duì)原始序列進(jìn)行過(guò)濾質(zhì)控去除低質(zhì)量的序列，然后使用FLASH軟件［25］進(jìn)行序列拼接。使用UPARSE軟件［26］對(duì)相似度≥97%的序列進(jìn)行操作分類(lèi)單元（OTU）聚類(lèi)，并在聚類(lèi)過(guò)程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier［27］將每條序列與 Silva數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行物種分類(lèi)與注釋。通過(guò)對(duì)樣品序列進(jìn)行Alpha多樣性分析和物種組成分析等評(píng)估苯并噻唑硫酮對(duì)青枯病發(fā)病煙株根圍土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯并噻唑硫酮對(duì)青枯病的防治效果

接菌后第9天（灌根處理第7天），對(duì)照的部分煙株出現(xiàn)明顯青枯病癥，第30天時(shí)對(duì)照煙株發(fā)病程度十分嚴(yán)重，到第40天時(shí)煙株已全部萎蔫變黃，對(duì)照的10株煙經(jīng)滅菌蒸餾水灌根后不同時(shí)期的病級(jí)和病情指數(shù)見(jiàn)表2。經(jīng)苯并噻唑硫酮灌根處理的煙株試驗(yàn)過(guò)程中未出現(xiàn)青枯病癥狀，且生長(zhǎng)良好。說(shuō)明苯并噻唑硫酮灌根處理對(duì)煙草青枯病有較好防治效果。

表2 對(duì)照煙株青枯病的病級(jí)調(diào)查T(mén)ab.2 Disease levels of tobacco bacterial wilt for the check tobacco plants

2.2 高通量測(cè)序深度與數(shù)據(jù)分析

由稀釋曲線（圖1）可以看出，本試驗(yàn)中10組共30個(gè)樣品測(cè)序reads數(shù)均在30 000以上，樣本Sobs多樣性指數(shù)稀釋曲線在測(cè)序reads數(shù)為30 000時(shí)已趨于平緩，說(shuō)明此次測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，測(cè)序結(jié)果能夠滿(mǎn)足后續(xù)樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的比對(duì)分析要求，更多的reads只能產(chǎn)生少量的新OTU。

原始數(shù)據(jù)優(yōu)化處理后對(duì)照共獲得754 945條高質(zhì)量序列片段，21 974 378個(gè)堿基，單一樣品序列數(shù)在44 559～61 236條之間，平均序列數(shù)為50 329條，序列平均長(zhǎng)度為437 bp；處理共獲得868 433條高質(zhì)量序列片段，25 233 613個(gè)堿基，單一樣品序列數(shù)在51 463～69 131條之間，平均序列數(shù)為57 895條，序列平均長(zhǎng)度為436 bp。

2.3 OTU聚類(lèi)分析

表3顯示，通過(guò)對(duì)不同分類(lèi)水平上鑒定出的種系統(tǒng)計(jì)表明，對(duì)照樣品中共鑒定到細(xì)菌的37個(gè)門(mén)、99個(gè)綱、213個(gè)目、399個(gè)科、799個(gè)屬、1 686個(gè)種、4 882個(gè)OTU；處理樣品中鑒定到細(xì)菌的38個(gè)門(mén)、97個(gè)綱、213個(gè)目、402個(gè)科、814個(gè)屬、1 695個(gè)種、4 863個(gè)OTU。

圖1 稀釋曲線（OTU水平Sobs指數(shù)）Fig.1 Rarefaction curve（Sobs index at OTU level）

2.4 細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)分析

Alpha多樣性指數(shù)中Sobs和Chao1指數(shù)反映群落豐富度，香農(nóng)指數(shù)（Shannon）和辛普森指數(shù)（Simpson）反映群落多樣性［28］。表 4顯示，對(duì)照與處理根圍土壤細(xì)菌的Sobs和Chao1指數(shù)呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，試驗(yàn)第7天細(xì)菌豐富度達(dá)到最高，之后開(kāi)始降低。苯并噻唑硫酮灌根當(dāng)天處理細(xì)菌豐富度指數(shù)小于對(duì)照，試驗(yàn)第40天處理豐富度指數(shù)大于對(duì)照。土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)在處理后5個(gè)時(shí)期中除第40天外，其余4個(gè)時(shí)期的Shannon值均低于對(duì)照，處理5個(gè)時(shí)期的Simpson值均高于對(duì)照，表明前4個(gè)時(shí)期對(duì)照細(xì)菌群落多樣性高于處理，第40天時(shí)對(duì)照細(xì)菌多樣性低于處理。處理與對(duì)照5個(gè)時(shí)期的樣品覆蓋度指數(shù)（Coverage）均在97%以上，說(shuō)明樣品中序列被檢測(cè)出的概率高，測(cè)序結(jié)果能夠代表樣本中細(xì)菌群落的真實(shí)情況。

表3 灌根處理后不同時(shí)期煙株根圍土壤細(xì)菌總量比較Tab.3 Comparison of total amount of bacteria in rhizospheric soil of tobacco plants at different stages after root irrigation（個(gè)）

2.5 細(xì)菌群落分析

在門(mén)水平，對(duì)照與處理樣品的細(xì)菌群落組成相似。其主要菌門(mén)包括變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、Saccharibacteria、藍(lán)細(xì)菌門(mén)（Cyanobacteria）、硝化螺旋菌門(mén)（Nitrospirae）和疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）等，但在灌根處理后不同時(shí)期與對(duì)照各菌門(mén)相對(duì)豐度存在差異，見(jiàn)表5。

對(duì)照煙株根圍土壤中變形菌門(mén)和擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度顯著降低；綠彎菌門(mén)和厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度顯著提高；放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)和硝化螺旋菌門(mén)相對(duì)豐度略有上升，Saccharibacteria和疣微菌門(mén)相對(duì)豐度略有降低。苯并噻唑硫酮處理煙株根圍土壤中變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和Saccharibacteria相對(duì)豐度顯著降低；放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)和厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度顯著升高；酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、浮霉菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、硝化螺旋菌門(mén)和疣微菌門(mén)相對(duì)豐度略微升高。表明苯并噻唑硫酮能顯著提高放線菌門(mén)相對(duì)豐度，顯著降低Saccharibacteria菌門(mén)相對(duì)豐度，而對(duì)于其他細(xì)菌門(mén)類(lèi)影響較小。

表4 灌根處理后不同時(shí)期煙株根圍土壤細(xì)菌的Alpha多樣性指數(shù)比較①Tab.4 Comparison of Alpha diversity index of bacteria in rhizospheric soil of tobacco plants at different stages after root irrigation

表5 不同時(shí)期煙株根圍土壤細(xì)菌各菌門(mén)的相對(duì)豐度Tab.5 Relative abundances of bacteria phyla in rhizospheric soil of tobacco plants at different stages（%）

細(xì)菌屬水平的變化見(jiàn)表6。對(duì)照根圍土壤中Pseudarthrobacter、Flavisolibacter、雷 爾 氏 菌 屬（Ralstonia）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、Massilia和Bryobacter相對(duì)豐度顯著降低；芽孢桿菌屬（Bacillus）和產(chǎn)黃桿菌屬（Rhodanobacter）相對(duì)豐度顯著增加；鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和Micromonospora相對(duì)豐度略有降低；芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、類(lèi) 諾 卡 氏 屬（Nocardioides）、Roseiflexus和鏈霉菌屬（Streptomyces）相對(duì)豐度略微增加。處理組根圍土壤樣品中Pseudarthrobacter、鞘氨醇單胞菌屬、Flavisolibacter、鞘脂菌屬（Sphingobium）、雷爾氏菌屬和Massilia相對(duì)豐度顯著降低；芽孢桿菌屬、類(lèi)諾卡氏屬和鏈霉菌屬相對(duì)豐度顯著增加；芽單胞菌屬、Roseiflexus、Bryobacter和Micromonospora相對(duì)豐度略有增加；產(chǎn)黃桿菌屬在5個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)均未檢出。表明苯并噻唑硫酮能顯著增加類(lèi)諾卡氏屬和鏈霉菌屬的相對(duì)豐度，顯著降低鞘氨醇單胞菌屬的相對(duì)豐度，而對(duì)于其他菌屬影響較小。

圖2為屬水平下對(duì)照與苯并噻唑硫酮處理后不同時(shí)期土壤樣品細(xì)菌群落熱圖，通過(guò)顏色的變化直接反映出樣品中各菌屬相對(duì)豐度的高低。顏色分布表明，除Pseudomonas、鞘脂菌屬、雷爾氏菌屬、Pseudarthrobacter和Massilia外，其余菌屬在各樣本中的相對(duì)豐度無(wú)明顯差異。熱圖上方為灌根處理后不同時(shí)期樣品的層級(jí)聚類(lèi)樹(shù)。其中JY01、JY23、JY71和JY73聚為一類(lèi)，JY03、JY22和JY21聚為一類(lèi)，CK23、JY02、CK03、CK02和 CK01聚為一類(lèi)，CK71、CK22和 CK21聚為一類(lèi)，CK73、JY202、JY203、JY201和 CK72聚為一類(lèi)，CK403、JY401、CK401、CK203、CK202和JY72聚為一類(lèi)，CK201和JY403聚為一類(lèi)，CK402和JY402與其他樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，因而各自聚為一類(lèi)。處理后不同時(shí)期的樣品可聚集成為1個(gè)分支，處理相同時(shí)期3個(gè)樣品不能聚集為1個(gè)分支，說(shuō)明處理相同時(shí)期的3個(gè)土壤樣品間細(xì)菌群落存在較大差異。

表6 不同時(shí)期煙株根圍土壤細(xì)菌各菌屬相對(duì)豐度Tab.6 Relative abundances of bacteria genera in rhizospheric soil of tobacco plants at different stages （%）

圖2 土壤樣品中細(xì)菌屬水平群落熱圖Fig.2 Heatmap of bacterial community in soil samples at genera level

3 討論

土壤微生物多樣性的增加在維持土壤健康和抑制植物病害方面起著十分重要的作用［29-30］。有研究表明土壤微生物多樣性的降低是導(dǎo)致土傳病害發(fā)生的重要原因［31］。Shiomi等［32］發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌很難在土壤微生物多樣性高的土壤中定殖。本研究中，苯并噻唑硫酮灌根處理后煙株根圍土壤的細(xì)菌豐富度與多樣性增加，而用滅菌蒸餾水灌根的煙株根圍土壤的豐富度與多樣性降低。因此，推測(cè)苯并噻唑硫酮灌根可能是通過(guò)增加煙株根圍土壤細(xì)菌群落多樣性，從而降低青枯雷爾氏菌在土壤中的定殖，進(jìn)而達(dá)到抑制煙草青枯病的發(fā)生。

樣品細(xì)菌群落基本組成和結(jié)構(gòu)分析表明，煙株根圍土壤中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和綠彎菌門(mén)。這與施河麗等［33］試驗(yàn)的青枯病發(fā)病煙株根際土壤和曹毅等［34］分析的煙草青枯病病圃土壤的研究結(jié)果基本一致。放線菌門(mén)含量通常被視為土壤健康與否的指標(biāo)［35］，同時(shí)放線菌也是產(chǎn)生抗生素的主要菌門(mén)，經(jīng)苯并噻唑硫酮灌根處理后煙株根圍土壤中放線菌門(mén)的含量顯著增加?？梢?jiàn)苯并噻唑硫酮灌根促進(jìn)煙株根圍土壤中有益微生物大量增殖，這在一定程度上可減輕煙草青枯病的危害。

為使煙株感染青枯病，試驗(yàn)前期人為在土壤中加入了青枯雷爾氏菌。在苯并噻唑硫酮灌根處理后2 d，雷爾氏菌屬在苯并噻唑硫酮處理中的衰減速度高于對(duì)照；在2 d后苯并噻唑硫酮處理中雷爾氏菌屬衰減速度低于對(duì)照；20 d后苯并噻唑硫酮灌根和滅菌蒸餾水灌根煙株根圍土壤均未能檢測(cè)出雷爾氏菌屬。以此推測(cè)苯并噻唑硫酮處理的雷爾氏菌屬衰減速度先快后慢，可能與苯并噻唑硫酮的藥效有關(guān)，前期藥效高抑制雷爾氏菌屬能力強(qiáng)，雷爾氏菌屬衰減速度快，后期藥效減弱，抑制效果降低。但該推測(cè)有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。煙株接種青枯菌后，滅菌蒸餾水灌根的煙株根圍土壤中雷爾氏菌屬相對(duì)豐度降低，原因目前尚不清楚，有待進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

4 結(jié)論

盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，苯并噻唑硫酮灌根能顯著抑制煙草青枯病的發(fā)生，對(duì)煙草青枯病有較好防治效果。苯并噻唑硫酮灌根增加了煙株根圍土壤細(xì)菌群落的豐富度與多樣性，并顯著提高了放線菌門(mén)、類(lèi)諾卡氏屬和鏈霉菌屬等有益細(xì)菌的相對(duì)豐度，顯著降低了Saccharibacteria菌門(mén)和鞘氨醇單胞菌屬等的相對(duì)豐度。但苯并噻唑硫酮灌根并未改變煙株根圍土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)和菌屬，灌根后不同時(shí)期煙株根圍土壤中細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)均為放線菌門(mén)、變形菌門(mén)和綠彎菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌屬均為Pseudarthrobacter、鞘氨醇單胞菌屬和芽單胞菌屬。