CXCL6基因在大鼠睪丸組織發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)*

云 霞 陳 琪 周好樂(lè) 楊 錚 塔 娜 于泊洋 張 巖 張信來(lái) 劉陶迪**

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（內(nèi)蒙古呼和浩特010059）；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院

哺乳動(dòng)物青春期后睪丸開(kāi)始發(fā)育，生精細(xì)胞增殖分化，啟動(dòng)生精過(guò)程。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，10%的已婚夫婦患有不育癥,其中男性因素約占30-50%[1]。男性不育癥是人類(lèi)生殖研究的重要課題。導(dǎo)致男性不育的原因復(fù)雜，其中精子發(fā)生過(guò)程中，由諸多基因參與的調(diào)控機(jī)制異常是重要的因素[2，3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，揭示精子發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制已經(jīng)成為男性不育研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

CXCL6(C-X-C motif ligand 6)又名粒細(xì)胞趨化蛋白 -2(granulocyte chemotactic protein-2,GCP-2)，最初在骨肉瘤細(xì)胞株上被發(fā)現(xiàn)，是趨化因子的重要成員。研究表明CXCL6具有趨化粒細(xì)胞、參與炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用[4]。此外CXCL6促進(jìn)血管生成，與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)[5]。在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，雌性子宮中的研究當(dāng)中發(fā)現(xiàn)，CXCL6與羊膜腔中的免疫反應(yīng)以及抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞的移行和入侵有關(guān)[6，7]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CXCL6基因在2～65日齡大鼠睪丸組織中的表達(dá),進(jìn)一步探討CXCL6基因在精子發(fā)生過(guò)程中的作用。

材料與方法

一、材料

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

將購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)，10周齡左右的Wistar大鼠在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。將一只雄性和兩只雌性鼠合籠,自然交配,保證充足的飼料和干凈的飲水供給，每周換墊料，第8天后分籠。每日觀察雌鼠3次,將出生當(dāng)天的鼠，計(jì)數(shù)為第1天，即1日齡，編號(hào)飼養(yǎng)。將2～65日齡，21個(gè)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)3只不同窩別的，總計(jì)63只雄性Wistar大鼠頸椎脫臼法處死后，取下睪丸組織，-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

（二）實(shí)驗(yàn)試劑

總RNA提取試劑盒(DP419)購(gòu)自天根生化科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR），使用SYBR Prelnix Ex TaqTM試劑盒，購(gòu)自大連寶生物公司。引物由上海生物工程公司合成提供。免疫組織化學(xué)染色使用UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒（鼠/兔）(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，Kit-9710)，用DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，Kit-0014）顯色。 兔抗大鼠 CXCL6（GCP-2）抗體（JM7139）購(gòu)于北京嘉美生物技術(shù)有限公司。HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購(gòu)于Abcam公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）總RNA提取

取各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的50mg睪丸組織，按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，提取總RNA。用紫外分光光度儀測(cè)定RNA濃度和純度。RNA濃度測(cè)定3次，取平均值。RNA純度以A260/A280比值在1.95～2.10之間為合格?？俁NA提取物管-80℃冰箱保存。

（二）RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA

根據(jù)各樣品總RNA的濃度和純度值，將樣品制成體積 30μl，濃度為 0.2μg／μl的稀釋液，制作轉(zhuǎn)錄體系A(chǔ)液和B液。A液10μl，包括樣本總RNA 4.0μl，Oligo-dt(10umol/L)1.0μl，加入 RNase-Free dH2O 至 10μl。B 液 l0μl， 包 括 5 ×M-MLVbuffer 4.0μl，dNTP Mixture(10mmol/L)2.0μl，RNase Inhibiter(40U/μl)1.0μl，M-LV Reverse Transcriptase (5U/μl)0.5μl，RNase-Free H2O 2.5μl。按照說(shuō)明書(shū)操作步驟，混合A液與B液，制備成20μl反應(yīng)體系，42℃水浴60分鐘，72℃水浴10分鐘進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反轉(zhuǎn)錄成的cDNA-20℃冰箱保存。

表1 CXCL6基因引物列表

（三）Real-time PCR

使用SYBR Prelnix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行，以cDNA樣本為模版對(duì)CXCL6基因進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。CXCL6基因引物通過(guò)Primer5軟件設(shè)計(jì)（表1）。根據(jù)試劑盒說(shuō)明及引物的條件設(shè)定RT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?預(yù)變性 95°C 10 min;95°C 30s；95°C 5s；55°C 30s；72°C 34s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系模版分別來(lái)自三組不 同 窩 別 出 生 2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 日齡的 21 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的大鼠睪丸組織cDNA。每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的樣品重復(fù)檢測(cè)兩管，以GAPDH做為內(nèi)參對(duì)照，以H2O做為陰性對(duì)照。用Ct方法分析CXCL6 mRNA的表達(dá)量，結(jié)果用基因mRNA相對(duì)表達(dá)倍數(shù)表示。計(jì)算方法用2-ΔΔCt法，數(shù)據(jù)和圖表使用Microsoft Excel分析。

（四）免疫組織化學(xué)染色

取65日齡大鼠的睪丸組織石蠟切片,烤片、脫蠟水化。PBS洗三次，每次5min，微波15 min進(jìn)行組織抗原修復(fù)。切片滴加過(guò)氧化酶抑制劑室溫處理10 min之后PBS洗三次，每次3min。滴加兔抗大鼠CXCL6（GCP-2）抗體（1：80），濕盒中 4℃過(guò)夜，以 PBS 替代一抗做為空白陰性對(duì)照。次日，PBS洗三次，每次3min，滴加HRP-羊抗小鼠／兔IgG,室溫孵育10min。PBS淋洗后，滴加H2O2-DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片。在顯微鏡下觀察，拍照。

結(jié) 果

一、Real-time PCR檢測(cè)CXCL6基因表達(dá)

引物的溶解曲線重合度高，可知其特異性好（圖1 A，C），擴(kuò)增曲線在PCR平臺(tái)期幾乎重合（圖1 B，D）。

圖1 CXCL6和Gapdh的基因擴(kuò)增熔解曲線與擴(kuò)增曲線

通過(guò)Real-time PCR反應(yīng)檢測(cè)三組不同窩別來(lái)源，出 生 2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 日齡，21 個(gè)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的大鼠睪丸組織中的CXCL6基因表達(dá)。三組不同窩別來(lái)源的大鼠睪丸組織中，CXCL6 mRNA水平表達(dá)變化趨勢(shì)基本相同，在大鼠出生的第2到65天呈動(dòng)態(tài)變化。

CXCL6 mRNA表達(dá)在出生后第2天呈高表達(dá)，隨后開(kāi)始迅速下降，在第8天下降到最低值，并且一直持續(xù)到第16天。從第20天起迅速線性升高表達(dá)，在第29天時(shí)達(dá)到整個(gè)發(fā)育過(guò)程的最高值，之后開(kāi)始下降。第35天起CXCL6基因的表達(dá)再次呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在第45天形成一個(gè)小高峰表達(dá)之后，維持一定的表達(dá)量持續(xù)至第 65 天（圖 2）。

圖2 CXCL6基因在3組不同窩別出生2至65日齡大鼠睪丸組織中mRNA的相對(duì)表達(dá)量

圖3 65日齡大鼠睪丸組織免疫組織化學(xué)染色

二、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)CXCL6蛋白在65日齡大鼠睪丸組織中的表達(dá)

65日齡大鼠睪丸組織免疫組織化學(xué)染色顯示，曲細(xì)精管內(nèi)可見(jiàn)CXCL6蛋白陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞。在精母細(xì)胞邊緣和圓形精子以及曲細(xì)精管管腔的成熟精子處均呈現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)（圖3）。

討 論

睪丸的曲細(xì)精管是精子生成的場(chǎng)所。精子發(fā)生包括精原干細(xì)胞的增殖與分化，減數(shù)分裂和成熟精子形成等三個(gè)階段[8]。每個(gè)階段都是多基因參與的復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程。Wrobel G等[9]研究表明，大鼠出生后1-8天以精原干細(xì)胞的自我增殖和分化為主；出生后14天左右開(kāi)始減數(shù)分裂，出現(xiàn)初級(jí)精母細(xì)胞；出生20天之后進(jìn)入圓形精子發(fā)生階段，此時(shí)第二次減數(shù)分裂完成，圓形精子首次出現(xiàn)；出生35天后完成圓形精子向長(zhǎng)形精子的變形，形成成熟的精子；出生56天后大鼠性成熟，達(dá)到成年?duì)顟B(tài)[10]。

本研究對(duì)大鼠出生后第 2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 天的睪丸組織進(jìn)行CXCL6基因表達(dá)檢測(cè)。觀察到CXCL6基因在大鼠精子發(fā)生過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化。在大鼠出生后第2天CXCL6基因mRNA呈高表達(dá)，隨后迅速下降，在第8天下降到最低值，一直持續(xù)到第16天。根據(jù)Wrobel G等和劉陶迪[11]等的研究結(jié)果，該時(shí)期是大鼠精原干細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵時(shí)期，推測(cè)CXCL6基因可能通過(guò)調(diào)低表達(dá)，參與精原干細(xì)胞的增殖過(guò)程。

從第20天起CXCL6基因表達(dá)量迅速線性升高，在第29天時(shí)可達(dá)到整個(gè)發(fā)育過(guò)程的最高值，之后開(kāi)始下降。研究表明大鼠出生20天之后進(jìn)入圓形精子發(fā)生階段，此時(shí)第二次減數(shù)分裂剛完成，圓形精子首次出現(xiàn)[12]。第20天后CXCL6 mRNA水平升高，提示減數(shù)分裂以后，CXCL6可能通過(guò)高表達(dá)參與與圓形精子的形成。從第35天到大鼠性成熟，圓形精子細(xì)胞核發(fā)生聚縮和塑性，經(jīng)過(guò)復(fù)雜的變態(tài)發(fā)育，向長(zhǎng)形精子變形，形成成熟的精子。第35天可見(jiàn)CXCL6基因的表達(dá)再次呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，在第45天形成一個(gè)小高峰之后，維持一定的表達(dá)量持續(xù)至第65天。由此推測(cè)CXCL6基因可能與圓形精子細(xì)胞變態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)形精子以及長(zhǎng)形精子的成熟有關(guān)。65日齡大鼠睪丸組織免疫組織化學(xué)染色顯示曲細(xì)精管內(nèi)可見(jiàn)CXCL6蛋白陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞。CXCL6蛋白位于精母細(xì)胞邊緣和圓形精子處，提示CXCL6在減數(shù)分裂后期表達(dá)，支持該基因參與圓形精子形成的推斷。CXCL6蛋白在長(zhǎng)形精子處表達(dá)也提示CXCL6基因在長(zhǎng)形精子成熟的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

臨床研究提示男性生殖能力降低與頂體發(fā)生及頂體反應(yīng)異常有關(guān)[13]。 田洪艷[14]等報(bào)道，圓形精子細(xì)胞期是頂體發(fā)生的重要時(shí)期，此期內(nèi)圓形精子細(xì)胞核變形的同時(shí)，頂體從無(wú)到有，逐漸變大，從圓形變成帽形，經(jīng)歷復(fù)雜的演變，形成正常結(jié)構(gòu)和功能的頂體。頂體伴隨著精子形成過(guò)程，也對(duì)精子形成過(guò)程發(fā)揮重要的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)CXCL6陽(yáng)性信號(hào)表達(dá)部位與頂體發(fā)生的部位相似[16]。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果也支持CXCL6基因在減數(shù)分裂之后圓形精子形成階段升高表達(dá)，可達(dá)到整個(gè)精子發(fā)生過(guò)程的最高峰值，提示CXCL6基因可能通過(guò)與頂體形成相關(guān)，對(duì)精子形成產(chǎn)生影響，具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究認(rèn)為CXCL6基因可能參與精原干細(xì)胞的增殖；可能與頂體形成相關(guān)，在圓形精子的形成以及精子成熟的過(guò)程中發(fā)揮作用，可能是大鼠精子發(fā)生過(guò)程，分子調(diào)控機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)，為揭示該基因男性生殖相關(guān)的作用提供了初步的線索。