細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制及研究進(jìn)展

林文 曹珈琪 張燕

[摘要]細(xì)胞焦亡是一種由炎癥小體驅(qū)動的程序性非典型細(xì)胞死亡模式，由Caspase-1/-11/-4/5介導(dǎo)。Gasdermin家族蛋白是近年發(fā)現(xiàn)的致孔效應(yīng)蛋白家族，該家族蛋白通常處于自抑制狀態(tài)，被稱為是細(xì)胞焦亡的“劊子手”，其中最為重要的焦亡執(zhí)行蛋白是Gasdermin D和Gasdermin E。發(fā)生細(xì)胞焦亡時，激活的Caspases將GSDMD/GSDME切割為N端孔洞形成片段和C端抑制片段，造成膜穿孔，釋放炎癥因子等細(xì)胞內(nèi)容物引發(fā)細(xì)胞焦亡。隨著細(xì)胞焦亡的深入研究，發(fā)現(xiàn)其在多種疾病尤其是腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。本文總結(jié)了細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制及其在癌癥中的研究進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]細(xì)胞焦亡;細(xì)胞程序性死亡;炎癥小體;腫瘤;GSDMD

[中圖分類號] R737.25 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1674-4721（2020）9（c）-0025-05

[Abstract] Pyroptosis is a pattern of atypical cell death driven by inflammasome， mediated by Caspase-1/-11/-4/5. Gasdermin family proteins are identified as pore-forming proteins acting as the "executor" of pyroptosis， which usually remain in self-suppressed state. Gasdermin D and Gasdermin E are the most key palyers in pyroptosis. In the pathway of pyroptosis， GSDMD/GSDME is cleaved into N-terminal pore-forming fragments and C-terminal inhibitory fragments by activated Caspases， membrane perforation is initiated in turn， and cell contents such as inflammatory factors are released to trigger pyroptosis. Emerging evidences support that pyroptosis plays an important role in the development of various diseases， especially in tumors. This article summarizes the underlying molecular mechanism of pyroptosis and reviews the research progress in cancer.

[Key words] Pyroptosis; Programmed cell death; Inflammasome; Tumor; GSDMD

在生物個體的生長和發(fā)育期間，細(xì)胞死亡隨時都會發(fā)生，這是生物界普遍存在的生命現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物的生長、發(fā)育和體內(nèi)平衡中起著重要作用。細(xì)胞死亡的方式主要分為兩類，非程序性死亡和程序性死亡（programmed cell death，PCD）[1]，PCD又可分為非炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的自噬（autophagy）和凋亡（apoptosis）及炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡[2]。近年來，細(xì)胞焦亡成為PCD領(lǐng)域的研究熱點，隨著調(diào)控焦亡的信號通路逐漸闡明，研究人員也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡在人類多種疾病中所產(chǎn)生的巨大影響。

1細(xì)胞焦亡的研究歷史

細(xì)胞焦亡伴隨著炎癥反應(yīng)的細(xì)胞死亡方式早在20世紀(jì)90年代就已被關(guān)注，1992年Zychlinsky等[3]首次發(fā)現(xiàn)，用侵襲性志賀菌和鼠傷寒沙門菌感染巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞死亡，主要觀察到宿主細(xì)胞DNA片段化和膜起泡，最初認(rèn)為是凋亡所致，但由于Caspase-3被裂解是晚期事件，并且死亡過程需要Caspase-1的參與，從而引起廣泛的關(guān)注，隨后在1994～2000年，進(jìn)一步的分析表明，巨噬細(xì)胞的死亡獨特地依賴于Caspase-1而不是凋亡相關(guān)Caspase，并且伴隨著細(xì)胞膜的破壞和炎癥細(xì)胞因子和其他小分子的釋放[4-5]。2001年Cookson及其同事將這種依賴于炎性體的細(xì)胞死亡稱為“pyroptosis”，源于希臘語中與火或熱有關(guān)的“pyro”[6]，至此細(xì)胞焦亡被明確定義。此后，雖然有大量關(guān)于焦亡的報道，但直到2015年Gasdermin D（GSDMD）被發(fā)現(xiàn)為Caspase-1和Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11的切割靶點時，細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵因子才被發(fā)現(xiàn)，GSDMD被稱為焦亡的“劊子手”[7]。隨著研究的深入，Gasdermin超家族中其他蛋白，如Gasdermin E（GSDME），被Caspase-3激活，也會誘發(fā)細(xì)胞焦亡[8]。在2018年，細(xì)胞死亡命名委員會（Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD）定義細(xì)胞焦亡是由Gasdermin蛋白家族成員形成質(zhì)膜穿孔的炎癥細(xì)胞PCD[9]。如今細(xì)胞焦亡這種程序性細(xì)胞死亡方式已經(jīng)逐漸被人們所了解，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡在人類癌癥、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病中均發(fā)揮著重要的作用。

2細(xì)胞焦亡分子機(jī)制

2.1模式識別受體與炎癥小體

免疫系統(tǒng)以天然免疫和適應(yīng)性免疫兩種免疫方式保護(hù)著人體，二者均依賴特異性受體對“非我”分子模式進(jìn)行識別，隨后利用不同的機(jī)制消除攜帶模式分子的病原體[10]。其中作為宿主防御的第一道防線的天然免疫通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識別病原體特有保守的關(guān)鍵模式分子，病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）以及內(nèi)源性危險信號分子模式（danger-associated molecular patterns，DAMPs），立即引發(fā)機(jī)體反應(yīng)，以遏制入侵的微生物，為激活隨后的適應(yīng)性免疫反應(yīng)奠定基礎(chǔ)[11]。胞漿中的PRRs包括Toll樣受體（TLRs）、細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域（NOD）樣受體（NLRs）和AIM2樣受體（ALRs）[12]。

炎癥小體在細(xì)胞質(zhì)中以多蛋白復(fù)合物狀態(tài)存在，由信號特異性傳感器蛋白，銜接子蛋白，以及效應(yīng)蛋白構(gòu)成[13]。信號特異性傳感器蛋白主要是富含中央核苷酸結(jié)合域（nucleotide binding domain，NBD）和亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR）的NOD-like receptor，NLR蛋白家族（NLRP1、NLRC4、NLRP3、NAIP2/5）和HIN-200蛋白家族（hematopoietic IFN-inducible nuclear antigen with 200 amino acid repeats），如（AIM2），銜接子蛋白則是含有Caspase激活募集域（Caspase activation and recruitment domain，CARD）的凋亡相關(guān)微粒蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC），Caspase為效應(yīng)蛋白[14]。

2.2 Caspase-1介導(dǎo)的經(jīng)典途徑細(xì)胞焦亡

Caspase（cysteinyl aspartate specific proteinase）是一種含有半胱氨酸的內(nèi)源性天冬氨酸蛋白水解酶，是生物體通過調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和炎癥來維持穩(wěn)態(tài)的重要基因家族[15]。Caspase已被廣泛分類為凋亡性（哺乳動物中Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8和Caspase-9）和炎癥性（人類Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-12和小鼠Caspase-1、Caspase-11和Caspase-129）[16]。細(xì)胞焦亡則是由Caspase所介導(dǎo)發(fā)生的，其中經(jīng)典途徑的細(xì)胞焦亡由Caspase-1介導(dǎo)，非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑由Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11介導(dǎo)。

Caspase-1在通常狀態(tài)下作為一種惰性酶原存在，是炎癥小體的重要組成部分。當(dāng)胞漿PRRs受到特定PAMPs和DAMPs的刺激下，PRR通過（或不通過）ASC和Pro-Caspase-1形成組裝成為炎癥小體，炎癥小體通過反平行二聚作用形成Caspase-1酶原激活平臺，該反向平行二聚作用使一個Caspase-1分子的催化結(jié)構(gòu)域與需要切割以激活該酶的兩個位點之一接近，隨后Caspase-1會自剪切激活，從酶原變?yōu)榫哂谢钚缘牡鞍姿饷?，這是細(xì)胞焦亡發(fā)生重要的一環(huán)[17]。激活后的Caspase-1不僅可以介導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）]的成熟和分泌，還可以直接作用于GSDMD[18]。Caspase-1在其中央連接區(qū)將自抑制狀態(tài)下的GSDMD切割為具有穿孔活性的31KDa氨基末端（NT）和22KDa的羧基末端（CT），隨后，GSDMD-N通過膜脂相互作用方式，與細(xì)胞膜內(nèi)表面的磷脂酰肌醇、磷脂酸和磷脂酰絲氨酸結(jié)合，并在脂質(zhì)雙層中形成內(nèi)徑10～20 nm寡聚孔，細(xì)胞膜上的穿孔可直接釋放被Caspase-1激活的分子直徑約為5 nm的IL-1β和IL-18以及其他小的胞漿蛋白，如小GTP酶、半乳糖凝集素或半胱氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑胱抑素等。除此之外，質(zhì)膜上大量的孔洞在膜的內(nèi)側(cè)和外側(cè)之間引起連通，形成了非選擇性的膜通道，使質(zhì)膜兩側(cè)離子濃度失衡，大量的水進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞腫脹，內(nèi)容物逸出，細(xì)胞最終死亡[7，19-20]。不僅如此，焦亡細(xì)胞所釋放的IL-1β、IL-18是內(nèi)源性免疫因子，引起發(fā)熱和刺激免疫細(xì)胞活化，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和分泌抗體。IL-1β和IL-18的失控釋放會導(dǎo)致廣泛的炎癥反應(yīng)和免疫性疾病[21]。

2.3非經(jīng)典途徑的細(xì)胞焦亡

非經(jīng)典的焦亡途徑，通常是細(xì)胞質(zhì)脂多糖（lipopoly-saccharide，LPS）直接激活Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11介導(dǎo)焦亡，Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11可以直接被細(xì)胞內(nèi)革蘭陰性細(xì)菌LPS刺激，以激活和水解自身的蛋白酶活性[22]。活化的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11也可以作用于GSDMD并產(chǎn)生與Caspase-1相同的裂解作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔。激活的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11在NLRP3和ASC存在下可以與Caspase-1相互作用，從而促進(jìn)其激活[23-24]。同樣的，Caspase-1裂解IL-1β和IL-18的前體以形成活性IL-1β和IL-18，通過GSDMD-NT形成的膜通道釋放并引起焦亡。與經(jīng)典途徑不同的是，在非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡中，僅IL-1β和IL-18前體的裂解取決于Caspase-1，GSDMD的切割則是由其他已激活的炎癥性Caspases完成的[25]。

3細(xì)胞焦亡與癌癥的發(fā)生

近年研究顯示，多種癌癥的發(fā)生及治療與細(xì)胞焦亡密切相關(guān)。Wang等[26]研究表明，細(xì)胞焦亡關(guān)鍵蛋白GSDMD可能通過抑制ERK、STAT3和PI3K通路，進(jìn)而抑制CyclinA2/CDK2復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞周期S/G2期阻滯，抑制胃癌增殖。Gao等[27]研究表明，與癌旁組織相比，非小細(xì)胞肺癌中的GSDMD蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，經(jīng)臨床數(shù)據(jù)分析，較高水平的GSDMD表達(dá)與患者腫瘤體積成正相關(guān)，并且影響著患者晚期的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。敲低GSDMD表達(dá)后抑制了小鼠腫瘤的生長。

GSDMD/GSDME是細(xì)胞焦亡發(fā)生的關(guān)鍵蛋白，因此大量研究靶點在于小分子或藥物觸發(fā)GSDMD介導(dǎo)的焦亡作用而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力等。Wang等[28]發(fā)現(xiàn)二甲雙胍（Metformin）可誘發(fā)GSDMD介導(dǎo)的焦亡。Pizato等[29]發(fā)現(xiàn)Omega-3 二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）可以在MDA-MB-231三陰性乳腺癌細(xì)胞中引發(fā)焦亡，與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，經(jīng)DHA處理的乳腺癌細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞焦亡，Caspase-1、GSDMD被激活，IL-1β分泌增加。Deng等[30]最近的一項研究發(fā)現(xiàn)，BIX-01294，一種二氮雜-喹唑啉-胺衍生物可誘導(dǎo)自噬通量，并且當(dāng)BIX聯(lián)合順鉑（Cis-platinum，Cis）處理胃癌細(xì)胞，可以誘導(dǎo)GSDME介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞發(fā)生焦亡。Chen等[31]的一項研究發(fā)現(xiàn)，與結(jié)直腸癌一樣，洛鉑會通過Caspase-3/GSDME信號傳導(dǎo)途徑在鼻咽癌細(xì)胞中誘導(dǎo)焦亡。海洋耐寒細(xì)菌假海變單胞菌TAC125產(chǎn)生的4-羥基苯甲酸（4-hydroxybenzoic acid，4-HBA），可誘導(dǎo)A549肺上皮癌細(xì)胞焦亡。研究發(fā)現(xiàn)4-HBA處理A549細(xì)胞后，可以激活Caspase-1，促使IL-18和IL-1表達(dá)增加，誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞焦亡，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞死亡[32]?；ㄇ嗨厥菍儆陬慄S酮家族的天然著色劑，其抗癌特性引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注[33]。Yue等[34]注意到花青素降低了口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）細(xì)胞的活性，抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲能力?；ㄇ嗨靥幚鞳SCC時，NLRP3、Caspase-1和IL-1的表達(dá)增強(qiáng)，激活細(xì)胞焦亡，同時，在Caspase-1抑制劑的作用下，花青素激活的細(xì)胞焦亡被抑制，而細(xì)胞活力、遷移和侵襲率隨之提高?；熌退幨锹殉舶┗颊咦畛Ｒ姷乃劳鲈蛑?，確定新型抗腫瘤藥物是當(dāng)務(wù)之急。Qiao等[35]研究發(fā)現(xiàn)新型分子α-NETA[2-（anaphthoyl）ethyltrimethylammonium iodide]通過GSDMD/Caspase-4途徑誘導(dǎo)上皮性卵巢癌（EOC）細(xì)胞焦亡。此外，Caspase-4或GSDMD的敲低都會影響細(xì)胞α-NETA細(xì)胞的抑制活性，表明α-NETA通過焦亡途徑發(fā)揮作用。最近的另一研究發(fā)現(xiàn)[36]，大氣壓冷等離子體（cold atmospheric plasma，CAP）已被提出作為一種新的有前途的抗癌治療方法。在CAP誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡中已經(jīng)揭示了細(xì)胞凋亡和壞死，但是CAP是否誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡仍然未知。Yang等[36]研究發(fā)現(xiàn)CAP通過線粒體途徑的激活（JNK/細(xì)胞色素C/Caspase-9/Caspase-3）和GSDME的裂解，在高表達(dá)GSDME的腫瘤細(xì)胞系中以劑量依賴性方式有效誘導(dǎo)了細(xì)胞焦亡，揭示了GSDME可能是未來癌癥CAP治療中預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。在結(jié)直腸癌中，Yu等[37]發(fā)現(xiàn)，洛鉑呈劑量依賴性降低了HT-29和HCT116細(xì)胞的活力，從形態(tài)學(xué)上看，洛鉑處理的HT-29和HCT116細(xì)胞在顯微鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹，細(xì)胞膜上出現(xiàn)大氣泡，透射電鏡顯示細(xì)胞膜上有多個孔。機(jī)制上，洛鉑誘導(dǎo)活性氧（reactive oxygen species，ROS）升高和JNK磷酸化?；罨腏NK將Bax引入線粒體，刺激細(xì)胞色素c向細(xì)胞質(zhì)釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)Caspase-3和Caspase-9裂解，從而發(fā)生細(xì)胞焦亡。Wang等[38]研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MKN-45中使用5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-FU）可以誘導(dǎo)Caspase-3的裂解，從而使GSDME的N末端片段積累，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞焦亡。此外，CRISPR-Cas9敲除GSDME可將5-FU誘導(dǎo)的Caspase-3依賴性焦亡轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲?。真核延伸因?2激酶（eukaryotic elongation factor-2 kinase，eEF-2K）是一種蛋白合成的負(fù)調(diào)控因子，已被證明在各種應(yīng)激下腫瘤細(xì)胞自噬和凋亡中發(fā)揮重要作用[39]。在最近的一項研究中，eEF-2K在阿霉素誘導(dǎo)的人類黑色素瘤細(xì)胞焦亡中發(fā)揮重要作用，eEF-2K沉默導(dǎo)致焦亡作用增強(qiáng)，從而使黑色素瘤細(xì)胞對阿霉素敏感，表明靶向eEF-2K可能增強(qiáng)阿霉素的抗腫瘤作用，為腫瘤化療提供了新的方向[40]。

4小結(jié)

細(xì)胞焦亡是新近發(fā)現(xiàn)的一種促炎性、程序性細(xì)胞死亡方式。經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑依賴于Caspase-1的介導(dǎo)，非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑依賴于Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11的介導(dǎo)。經(jīng)過近年的研究，焦亡的特征已有較一致的認(rèn)識，機(jī)制研究也取得的重大突破，多項研究也表明了細(xì)胞焦亡參與了各種疾病的發(fā)展。目前對于不同疾病中細(xì)胞焦亡發(fā)生的機(jī)制尚未完全明確，進(jìn)一步探究細(xì)胞焦亡在不同疾病，特別是腫瘤中的效應(yīng)機(jī)制，以及相關(guān)上下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的蛋白，對于全面認(rèn)識這一新型的細(xì)胞死亡方式，對于新型藥物的開發(fā)，尋找疾病治療的新靶點具有重要意義。

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（收稿日期：2020-06-22）