天麻成分C血、腦微透析探針體內(nèi)外回收率分析

李孟云 何曉山

摘要：目的 采用微透析取樣技術(shù)研究口服給予天麻成分C后血-腦藥代動力學(xué)參數(shù)。方法 采用HPLC技術(shù)建立微透析樣品中天麻成分C的分析方法，采用正透析法和反透析法研究天麻成分C在大鼠體內(nèi)的血、腦微透析探針體內(nèi)外回收率，考察灌流速度、藥物質(zhì)量濃度對探針體內(nèi)外回收率的影響，以及探針回收率在大鼠體內(nèi)外的穩(wěn)定性。采用血-腦同步微透析進行體內(nèi)藥動學(xué)研究，HPLC測定透析液中天麻成分C的含量。結(jié)果 所建立的 HPLC分析方法，在要求范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，色譜的專屬性、精密度、基質(zhì)效應(yīng)等均符合要求。體內(nèi)外回收率試驗，采用正透析法和反透析法測得體外內(nèi)回收率顯示在恒定質(zhì)量濃度下，血、腦微透析探針體內(nèi)外回收率均隨著流速的增大而減小，體外回收率基本保持一致，體內(nèi)回收率低于體外回收率;恒定流速下，天麻成分C質(zhì)量濃度對血腦探針體內(nèi)外回收率均無影響;在恒定濃度和恒定流速的條件下，天麻成分C的血腦微透析探針在大鼠體內(nèi)回收率在12 h內(nèi)保持相對穩(wěn)定，血腦探針回收率分別為（45.32±2.83）%，（10.55±0.82）%。結(jié)論 反透析法可以用來研究天麻成分C在大鼠體內(nèi)的回收率，微透析技術(shù)能夠用于天麻成分C在大鼠體內(nèi)的血、腦藥代動力學(xué)同步研究。

關(guān)鍵詞：天麻;酚性成分;微透析;探針回收率;藥代動力學(xué)

中圖分類號：R285.5

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1007-2349（2020）10-0050-07

【Abstract】Objective： To study the blood-brain pharmacokinetic parameters after oral administration of Gastrodia elata component C by microdialysis sampling technique. Methods： HPLC was used to establish the analysis method of Gastrodia elata component C in microdialysis samples and the positive dialysis method and reverse dialysis method were used to study the recovery rate of Gastrodia elata component C in the blood-brain microdialysis probes in rats in vivo and in vitro， and to explore the effect of the perfusion speed and drug concentration on the recovery rate of the probe in vivo and in vitro and the stability of the recovery rate of the probe in vivo in rats. The pharmacokinetic study in vivo was carried out by blood-brain synchronous microdialysis and the content of Gastrodia elata component C in the dialysate was determined by HPLC. Results： The established HPLC analysis method had a good linear relationship within the required range and the specificity， precision and matrix effect of the chromatogram all meet the requirements. The recovery rate test in vivo and in vitro， by which the recovery rate was measured through positive dialysis method and reverse dialysis method， showed that the recovery rates in vivo and in vitro of blood-brain microdialysis probes all decreased with the increase of flow rate at a constant mass concentration. The recovery rate in vitro was basically the same， and the recovery rate in vivo was lower than the recovery rate in vitro. At a constant flow rate， the mass concentration of Gastrodia elata component C had no effect on the recovery rate of blood-brain probe in vivo and in vitro. Under the conditions of constant concentration and constant flow rate， the recovery rate of the blood-brain microdialysis probe of Gastrodiae elata component C in rats remained relatively stable within 12 hours. The recovery rate of the blood-brain probe was 45.32±2.83% and 10.55±0.82%， respectively. Conclusion： The reverse dialysis method can be used to study the recovery rate of Gastrodia elata component C in rats and the microdialysis technique can be used for the simultaneous study of the blood-brain pharmacokinetics of Gastrodia elata component C in rats.

【Key words】Gastrodia elata， phenolic components， microdialysis， recovery rate of probe， pharmacokinetics

天麻（Gastrodia elata Blume）為蘭科植物天麻干燥的塊莖，為我國常用名貴中藥之一，多產(chǎn)于云南、四川、陜西及貴州等地[1]。代藥理學(xué)研究表明其具有益智、腦保護、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、抗癲癇、抗暈眩、降壓、降血脂、抗氧化、保肝、抗腫瘤、增強免疫力等多種藥理作用[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)天麻具有較好的抗缺血性腦卒中的作用，主要的活性部位集中在乙酸乙酯部位，其中分離得到的一組酚性成分可通過抗神經(jīng)細胞凋亡[3]、抗血小板聚集[4]、減輕鈣超載[5]、抗自由基損傷及改善神經(jīng)元突觸可塑性[6-8]等機制發(fā)揮較強的抗大鼠腦缺血及腦缺血/再灌注損傷的作用[9];天麻系列酚性成分中，成分C結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定、活性強、安全性好[10]，有望開發(fā)成抗缺血性腦血管病的新藥。

微透析（microdialysis）是近年發(fā)展起來的一種取樣技術(shù)[11-13]，主要原理將探針埋置在特點的靶組織或部位，藥物在探針半透膜兩側(cè)存在一定的濃度差，此時藥物會順濃度梯度擴散至半透膜內(nèi)，并被連續(xù)不斷地灌流液帶出[14-15]。探針上的半透膜具有一定截留分子量，因此微透析探針具有一定的透過率，所得樣品的藥物濃度并不是組織中藥物的真實濃度，需要通過探針回收率的矯正[16]，計算真實藥物濃度。對此，本研究通過考察探針回收率的影響因素，確定適宜的條件，建立適用于測定天麻成分C血-腦微透析探針回收率的分析方法。

1 試驗材料

1.1 試劑與藥品 天麻成分C對照品（百順化學(xué)科技有限公司，北京，批號：156765）;甲醇為色譜級（賽默飛世爾公司，批號：178500）;水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號：20100926）;復(fù)方氯化鈉注射液（即林格氏液，北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號1010A19，規(guī)格：500 mL）;娃哈哈純凈水;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）;電子天平（余姚市金諾天平儀器有限公司）;ZS-FD型大鼠立體定位儀（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司）;MD-2310/10 mm微透析血探針（美國BASi公司）;MD-2200/2 mm微透析腦探針及MD-2251套管（美國BASi公司）;MD1001 微量注射泵（美國BASi公司）;低溫微量收集器（美國Basi公司）。

1.3 動物 SPF級SD雄性大鼠，180～200 g湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號 SCXK（湘）2016-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定條件 色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18（StableBond Analytical 4.6×250 mm 5-Micron，Agilent公司）;流動相甲醇（B）：水（D）=20：80，等度洗脫。流速0.5 mL·min-1;柱溫25℃;進樣體積10 μL。

2.2 溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取天麻成分C對照品100 mg，置100 mL容量瓶中，加適量甲醇溶解定容至100 mL，混勻，得相應(yīng)濃度的對照品甲醇溶液，取1mL對照品甲醇溶液，甲醇依次稀釋為999.0，499.5，249.75，124.875，62.438，31.219，15.609，7.805，3.902和1.951 μg·mL-1的對照品儲備液。取對照品儲備液10 μL，分別加入90 μL的空白腦透析液中，渦旋混勻，得到含天麻成分C的標(biāo)準(zhǔn)品樣品。同法制備含天麻成分C的高、中、低質(zhì)控樣品。

供試品溶液的配制：精密稱取天麻成分C對照品10 mg置燒杯中，加適量林格氏液，超聲溶解，定容至100 mL容量瓶中，搖勻，制備成含天麻成分C濃度為0.1 mg·mL-1的供試品儲備液，精密吸取一定體積的供試品儲備液用林格氏液將其稀釋成質(zhì)量濃度為50，25，12.5，6.25和3.125 μg·mL-1的天麻成分C林格式液，臨用前新鮮配制。

2.3 腦、血液微透析探針的植入

2.3.1 腦微透析探針的植入 SD大鼠腹腔注射質(zhì)量濃度為100 g·L-1的水合氯醛麻醉，頭部剃毛，將大鼠頭部固定于立體定位儀上，沿腦正中剪開頭皮，用雙氧水去除頭骨上的膜，暴露頭骨，在大腦右側(cè)皮層對應(yīng)的點（前囟前后+3.2 cm，中縫左右+ 0.4 cm，顱骨平面上下-3.0 cm）標(biāo)記并用顱鉆打孔，另鉆兩孔擰入螺絲釘，在皮層對應(yīng)的點植入腦微透析探針套管，用牙科水泥將套管連同2個螺釘一并固定。待牙科水泥牢固后，松開立體定位儀，手術(shù)區(qū)域前后各縫皮1針。手術(shù)后恢復(fù)3 d，正常進食進水。進行微透析實驗前用林格氏液灌流10 min，排出探針半透膜上的甘油，取出大鼠腦部探針套管的假針，插入微透析探針，以一定的灌流速度開始灌流，平衡60 min后進行微透析取樣[17]。

2.3.2 血液微透析探針植入 SD大鼠腹腔注射質(zhì)量濃度為100 g·L-1的水合氯醛麻醉，頸部剃毛，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺上，沿頸部中線靠右約0.5 cm處剪開約1.5 cm，鈍性分離頸靜脈，頸靜脈遠心端結(jié)扎，在遠心端剪一小口，將血液探針朝心臟方向插入，探針半透膜應(yīng)全部沒入血管內(nèi)，將探針上的網(wǎng)狀物與兩旁的肌肉組織縫合從而固定探針，縫皮，以一定的灌流速度開始灌流，平衡60 min后進行微透析取樣[18-19]。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性 分別取6只老鼠的空白血透析液和腦透析液10 μL采用HPLC進行檢測的色譜圖（A）和色譜圖（B），取含天麻成分C的對照品溶液10 μL按2.1項下條件進行檢測，得色譜圖（C），取含天麻成分C的血透析液樣品和腦透析液樣品10 μL按2.1項下條件進行檢測，得色譜圖（D）和色譜圖（E）和結(jié)果表明，在此色譜條件下，測定的天麻成分C峰形良好，保留時間約為13.4 min，測定不受干擾，如圖1。

2.4.2 線性及標(biāo)準(zhǔn)曲線 制備含天麻成分C濃度為99.90，49.95，24.98，12.49，6.24，3.12，1.56，0.78，0.39和0.20 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各取30 μL按2.1項下條件進行檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)（X），做回歸曲線，所得天麻成分C的回歸方程為：Y=27.46044+74.13301X（R2=0.99925）線性范圍為：0.20～99.90 μg·mL-1。

2.4.3 精密度和準(zhǔn)確度 按2.2項下配制含天麻成分C高（12.49 μg·mL-1）、中（6.24 μg·mL-1）、低（0.78 μg·mL-1）3個濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度平行配制5份，取30 μL，按2.1項下條件進行檢測。1 d內(nèi)平行操作，5次，考察日內(nèi)精密度。連續(xù)進樣3 d，考察日間精密度，其RSD值應(yīng)≤15%，RE應(yīng)≤15%。結(jié)果顯示，高、中、低日內(nèi)精密度的分別為4.31%，1.99%和4.73%，準(zhǔn)確度在85%～104%范圍內(nèi)。日間精密度分別為8.57%，7.04%和4.10%，準(zhǔn)確度在86%～110%范圍內(nèi)。均符合要求。結(jié)果見表1。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng) 按2.2項下配制含天麻成分C高（12.49 μg·mL-1）、中（6.24 μg·mL-1）、低（0.78 μg·mL-1）3個濃度濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度各3份，取30 μL，按2.1項下條件進行檢測，記錄峰面積A1。另取水代替空白透析液，按上述方法，配制含天麻成分C高（12.49 μg·mL-1）、中（6.24 μg·mL-1）、低（0.78 μg·mL-1）3個濃度濃度的質(zhì)控樣品各3份，渦旋混勻，取30μL，按2.1項下條件進行檢測，記錄峰面積A2。以上述方法所得峰面積比值（A1/A2）計算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，結(jié)果表明天麻成分C在低、中、高3個質(zhì)量濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別是109.69 %，98.26%，109.89 %;均在85%～120%范圍內(nèi)，且RSD≤15%，無明顯基質(zhì)效應(yīng)。

2.4.5 穩(wěn)定性 按2.2項下配制含天麻成分C高（12.49 μg·mL-1）、中（6.249 μg·mL-1）、低（0.789 μg·mL-1）三個濃度濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度各3份，分別考察室溫下8 h，-80℃下放置14 d，反復(fù)凍融3次，按2.1項下條件進行檢測，記錄峰面積，其RSD≤15%。結(jié)果顯示天麻成分C高、中、低三個質(zhì)量濃度在以上三種條件下均能保持穩(wěn)定，RSD均≤15%。結(jié)果見表2。

3 腦、血液微透析探針回收率試驗

微透析探針回收率的測定有2種常用的方法，即正透析法和反透析法，正透析法能夠反映透析針的真實回收率，反透析法則用于評價體內(nèi)回收率和真實回收率的一致性[20-21]。因此采用正透析法測定探針體外回收率，反透析法測定探針體內(nèi)回收率。微透析探針回收率受到多種因素的影響，本次實驗選擇灌流速度，濃度、探針穩(wěn)定性等因素考察血-腦微透析探針的體內(nèi)外回收率。

3.1 灌流速度對探針體內(nèi)外回收率的影響 分別采用正透析法和反透析法測定并計算天麻成分C的血-腦微透析探針的體外回收率。采用正透析法考察灌流速度對天麻成C血、腦微透析探針體外回收率的影響。將血探針和腦探針分別浸沒在含有12.5 μg·mL-1天麻成分C的林格式液中，水溫維持在 37 ℃，用空白林格式液分別以流速1，1.5，2和3 μL·min-1灌注探針，每組先平衡60 min后，收集5次微透析樣品（每次30 μL），再取含藥的林格式液為原藥液為原藥液，經(jīng)HPLC測定得透析液濃度（Cdialysate）和原液濃度（C0），并計算正向回收率（positive recovery），Rpositive=Cdialysate/C0×100%，結(jié)果見圖2。采用反透析法考察灌流速度對天麻成C血、腦微透析體外探針回收率的影響。將血探針和腦探針分別浸沒在空白林格式液中，水溫維持在 37 ℃，用含有12.5 μg·mL-1天麻成分C的林格式液分別以流速1，1.5，2和3 μL·min-1灌注探針，每組先平衡60 min后，收集5次微透析樣品（每次30 μL），再取含藥的林格式液為原藥液，經(jīng)HPLC測定得透析液濃度（Cdialysate）和原液濃度（C0），并計算反向回收率（reverse recovery），Rreverse=（C0-Cdialysate）/C0× 100%。結(jié)果見圖2，以上結(jié)果顯示當(dāng)流速在1～3 μL·min-1時血、腦微透析探針體外回收率均隨著流速的增大而減小，表明探針回收率與流速密切相關(guān)，且相同探針其正透析法和反透析法所測得的體外回收率基本一致，血探針回收率始終大于腦探針回收率。

采用反透析考察灌流速度對天麻成C血、腦微透析體外探針回收率的影響。按照2.3項下方法植入腦、血液微透析探針，用含有12.5 μg·mL-1的天麻成分C林格式液分別以1，1.5，2，3 μL·min-1的流速灌注探針，平衡60 min后開始收集，收集5次微透析樣品（每次30 μL）再取含藥的林格式液為原藥液，經(jīng)HPLC測定得透析液濃度（Cdialysate）和原液濃度（C0），并計算反向回收率（reverse recovery），Rreverse=（C0-Cdialysate）/C0× 100%。結(jié)果見圖3，結(jié)果顯示當(dāng)流速在1～3 μL·min-1時血、腦微透析探針體內(nèi)回收率均隨著流速的增大而減小。

3.2 質(zhì)量濃度對探針體內(nèi)外回收率的影響 采用正透析法分別將腦、血探針置于含有一定質(zhì)量濃度25，12.5，6.25和3.125 μg·mL-1的天麻成分C林格式液中，恒溫37℃，用空白林格式液以2 μL·min-1的流速灌注探針，每個濃度在平衡60 min后，開始收集樣品，連續(xù)收集5份樣品，每份30 μL。取含藥的林格式液為原藥液，經(jīng)HPLC測定得透析液濃度（Cdialysate）和原液濃度（C0），并計算正向回收率（positive recovery），Rpositive=Cdialysate/C0×100%。 結(jié)果見圖4，結(jié)果顯示當(dāng)灌流速度一定時，在4種不同濃度的含藥林格式液中，血腦微透析探針回收率基本保持一致，體外探針回收率不會隨著濃度的改變有太大變化，表明天麻成分C濃度為3.125～25 μg·mL-1時，血、腦微透析探針對天麻成分C的體外回收率與濃度無關(guān)。

采用反透析法對探針體內(nèi)回收率的穩(wěn)定性進行考察。按照2.3項下方法植入腦、血液微透析探針，用含有一定質(zhì)量濃度25，12.5，6.25和3.12 μg·mL-1的天麻成分C林格式液以2 μL·min-1的流速灌注探針，平衡60 min后開始收集，收集5次微透析樣品（每次30 μL），取含藥的林格式液為原藥液，經(jīng)HPLC測定得透析液濃度（Cdialysate）和原液濃度（C0），并計算反向回收率（reverse recovery），Rreverse=（C0-Cdialysate）/C0× 100%。結(jié)果見圖4，結(jié)果表明結(jié)果顯示當(dāng)灌流速度一定時，在4種不同濃度的含藥林格式液中，血腦微透析探針回收率基本保持一致，體內(nèi)探針回收率不會隨著濃度的改變有太大變化，表明天麻成分C濃度為3.125～25 μg·mL-1時，血、腦微透析探針對天麻成分C的體內(nèi)回收率與濃度無關(guān)。

3.3 微透析探針體內(nèi)外回收率的穩(wěn)定性考察 采用反透析法分別對血腦微透析探針體內(nèi)回收率的穩(wěn)定性進行考察。按照2.3項下方法植入腦、血液微透析探針，用含有12.5 μg·mL-1的天麻成分C林格式液以2 μL·min-1的流速灌注探針，平衡60 min后開始收集，每60 min收集一次，連續(xù)收集12 h，取含藥的林格式液為原藥液，經(jīng)HPLC測定得透析液濃度（Cdialysate）和原液濃度（C0），并計算反向回收率（reverse recovery），Rreverse=（C0-Cdialysate）/C0× 100%。結(jié)果見圖5，結(jié)果表明，在恒定流速恒定濃度的情況下，血-腦微透析探針的體內(nèi)外回收率在12h內(nèi)有較小的波動，總體保持相對穩(wěn)定。血、腦微透析探針對天麻成分C的體內(nèi)回收率分別 10.55% 和45.32%。

4 討論

微透析是一門可以對動物靶組織或靶器官進行活體研究的技術(shù)，完整的微透析系統(tǒng)由微量泵、探針、收集器組成，作為其核心部分的探針在整過實驗中起關(guān)鍵作用。將探針埋置于特定靶組織或靶器官時，此時由于灌流也不斷地經(jīng)過半透膜，此時半透膜外側(cè)的物質(zhì)會順濃度梯度透過半透膜，被連續(xù)不斷的灌流帶出，這是一個透過的過程，由于物質(zhì)透過的并不完全，因此在使用此技術(shù)進行定量分析，就要先解決探針透過率即回收率的問題。本實驗為了天麻成分C的后續(xù)研究，首先對天麻成分C血、腦微透析探針的體內(nèi)外回收率進行研究，分別考察了灌流速度、質(zhì)量濃度對探針回收率的影響，同時對探針體內(nèi)穩(wěn)定性進行了研究。表明當(dāng)灌流流速為2 μL·min-1時，天麻成分C血、腦微透析探針的體內(nèi)回收率分別為45.32%和10.55%，說明微透析技術(shù)是可以用于天麻成分C在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究。從灌流速度的考察結(jié)果中可以看出灌流速度越快，探針的回收率會越低，這是由于微透析取樣是在非平衡狀態(tài)下進行的，灌流速度越快，半透膜兩側(cè)物質(zhì)達平衡時間越短，回收率也就越低。降低流速，探針的回收率也會增大，但此時樣品量也會隨之減小，需要和一些靈敏度較高的檢測手段配合使用，因此要綜合考慮，確定適宜的灌流速度。本次實驗采用正透析法和反透析考察了體外回收率，采用反透析法考察了體內(nèi)回收率，結(jié)果表明在1～3 μL·min-1的流速范圍內(nèi)正透析法和反透析法所測得體內(nèi)外回收率均隨著流速的增大而減小，且正透析法和反透析法所測得體外回收率基本保持相似，體外回收率高于體內(nèi)回收率，分析其原因有可能是探針植入過程中對探針半透膜造成的磨損，且動物處于清醒轉(zhuǎn)態(tài)，活動期間也會造成血液微透析的磨損。其次也有可能是探針植入體內(nèi)后，探針半透膜處于一個內(nèi)環(huán)境中，膜外的細胞外液有蛋白類的大分子物質(zhì)，有可能會吸附在半透膜上，造成體內(nèi)回收率低于體外回收率。在此過程中血液探針回收率始終大于腦探針回收率，這是由于半透膜本身材質(zhì)問題，血液探針半透膜長10 mm而腦探針的半透膜長2 mm，因此血液探針回收率始終大于腦探針回收率。

由于機體內(nèi)藥物濃度是一個動態(tài)變化的過程，因此研究恒定流速下，不同藥物濃度對血、腦微透析探針的一致性，可得知透析液中藥物濃度是否能準(zhǔn)確反映待測部位的實際濃度。本實驗以恒定流速2 μL·min-1，考察不同濃度3.125，6.25，12.5和25 μg·mL-1的天麻成分C對血、腦探針回收率的影響。結(jié)果表明不同質(zhì)量濃度的天麻成分C所測得的探針回收率基本保持相似，其波動較小，說明在3.125～25 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，天麻成分C的質(zhì)量濃度對探針回收率無影響。有研究表明探針回收率還會隨著溫度的增加而增加。因此為了保持體內(nèi)外環(huán)境的一致性，在研究體外探針回收率的過程中始終保持在37℃的環(huán)境下，以保證回收率的準(zhǔn)確性。

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