食品添加劑對(duì)兩種乳酸菌的抑菌作用

黃寶瑩，佘之蘊(yùn)，蘇妙儀，羅永潮，黃玲玲

（廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院廣東順德528000）

0 引言

酸奶含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、乳酸等[1]。酸奶除了富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還有多種保健功能，如減輕乳糖不耐癥、調(diào)整腸道菌群的生態(tài)平衡[2]、降低膽固醇[3]、降血壓、提高免疫力等[4]。酸奶的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和保健功能取決于乳酸菌的品種和活力。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和國(guó)際乳品聯(lián)合會(huì)（FAO、WHO/IDF）及GB 19302-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中均有規(guī)定，酸奶成品中必須含有大量的、相應(yīng)的活性乳酸菌[5]。上述國(guó)標(biāo)允許在風(fēng)味發(fā)酵乳中添加食品添加劑，本文主要研究多種香精、色素等食品添加劑對(duì)德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌的抑菌活力和最小抑菌濃度，探討其對(duì)乳酸菌的抑菌作用，以期對(duì)酸奶的生產(chǎn)控制提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，St）FSCC 225005；德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgari?cus，Lb）CICC 6045。

培養(yǎng)基為MRS瓊脂。

添加劑如表1所示。

1.2 儀器和設(shè)備

AC2-6S1生物安全柜，玻璃熱珠滅菌器，Easy?mix拍擊式均質(zhì)器，GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱，麥?zhǔn)媳葷醿x，牛津杯（內(nèi)徑6.0mm±0.1mm，外徑7.8mm±0.1mm，高10.0mm±0.1mm）。

2 方法

2.1 牛津杯法[6-7]

2.1.1 指示菌懸液的制備

菌株劃線于MRS瓊脂，36℃±1℃厭氧培養(yǎng)48 h活化，培養(yǎng)至生長(zhǎng)良好。取新鮮培養(yǎng)的菌株，用麥?zhǔn)媳葷醿x制備成2.40～2.60麥?zhǔn)媳葷岫龋s106mL-1）菌懸液，立即用于抑菌實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 抑菌液的配制

粉末狀添加劑：稱取一定質(zhì)量的添加劑，液體添加劑：吸取一定體積的添加劑，用無(wú)菌水溶解，定容至100mL，搖勻，制成一定濃度的抑菌液，4℃保存?zhèn)溆?，使用前搖勻。粉末狀添加劑以10.000 g/100 mL為初始質(zhì)量濃度，按二倍稀釋法制成5.000，2.500，1.250，0.625，0.313，0.156，0.078 g（每100 mL中）系列質(zhì)量濃度；液體狀添加劑以原液100.000%為初始體積分?jǐn)?shù)，按二倍稀釋法制成50.000%，25.000%，12.500%，6.250%，3.125%，1.563%，0.781%，0.391%系列體積分?jǐn)?shù)。

2.1.3 檢測(cè)平板的制備

每個(gè)平板加入20 mL的MRS瓊脂，凝固后待水份干燥，取0.2 mL菌懸液在平板上均勻涂布，以平板無(wú)可見水滴為準(zhǔn)，立刻進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

表1 食品添加劑

2.1.4 抑菌圈測(cè)定

以無(wú)菌水為空白對(duì)照，每個(gè)平板均勻放置3～4個(gè)牛津杯，將200 L抑菌液加入到牛津杯中，36℃±1℃下厭氧培養(yǎng)48 h。觀察牛津杯底周圍有無(wú)抑菌圈，每次試驗(yàn)至少作3次重復(fù)，測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值。

2.1.5 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

先以初始質(zhì)量濃度（或體積分?jǐn)?shù)）的添加劑溶液做初篩實(shí)驗(yàn)，根據(jù)初篩結(jié)果，挑選出有抑菌作用的添加劑，用牛津杯法測(cè)定其MIC，能產(chǎn)生抑菌圈的最小的質(zhì)量濃度（或體積分?jǐn)?shù)）定為MIC。其確定標(biāo)準(zhǔn)為：在該質(zhì)量濃度（或體積分?jǐn)?shù)）下抑菌圈直徑大于或等于8.0 mm。

3 結(jié)果與討論

3.1 添加劑的初篩結(jié)果

采用牛津杯法測(cè)試37種添加劑對(duì)兩種指示菌的抑制作用，初步篩選有抑菌效果的添加劑，其結(jié)果如表2所示。

表2 添加劑的初步篩選結(jié)果 mm

采用牛津杯法進(jìn)行添加劑的篩選，牛津杯中的試劑緩慢向四周擴(kuò)散，假若添加劑對(duì)指示菌有抑菌效果，在杯底周圍與培養(yǎng)基接觸面就出現(xiàn)抑制圈。抑菌圈的大小就代表添加劑抑菌力的高低。由表2可以看出，7種色素和4種甜味劑，除了甜蜜素對(duì)嗜熱鏈球菌產(chǎn)生了抑菌作用，其他均不產(chǎn)生抑菌圈，表明其對(duì)乳酸菌無(wú)抑菌作用。24種甜味香精中有21種對(duì)乳酸菌產(chǎn)生了大小不同的抑菌圈，同一風(fēng)味不同廠家的香精對(duì)乳酸菌的抑菌效果存在較大差異。兩種乳酸菌對(duì)檸檬酸和蘋果酸均十分敏感，都產(chǎn)生了較大的抑菌圈。對(duì)乳酸菌的抑菌作用由強(qiáng)到弱分別為酸度調(diào)節(jié)劑、香精、甜味劑、色素。

3.2 色素對(duì)乳酸菌的抑制作用

7種色素均為粉末狀添加劑，其初篩質(zhì)量濃度為10.000 g/100 mL。由表2可知，7種色素均沒(méi)有產(chǎn)生抑菌圈。此質(zhì)量濃度下，色素已是過(guò)飽和溶液，說(shuō)明7種色素對(duì)Lb和St無(wú)抑菌作用。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，色素均隨著牛津杯由里向外均勻擴(kuò)散，MRS培養(yǎng)基也隨之染上相應(yīng)顏色，但乳酸菌在其表面生長(zhǎng)良好。根據(jù)GB 19302-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》和GB 2760-2011《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，發(fā)酵乳中允許使用檸檬黃、日落黃、胭脂紅、亮藍(lán)色素，前三者最大使用量為0.05 g/kg，亮藍(lán)為0.025 g/kg，梔子黃、莧菜紅在食品中的最大使用量一般為0.3g/kg，姜黃按生產(chǎn)需要適量使用，而實(shí)際應(yīng)用中，出于生產(chǎn)需要和成本考量，實(shí)際使用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于最大使用量。說(shuō)明在使用范圍內(nèi)，7種色素對(duì)乳酸菌無(wú)抑制作用。

3.3 香精對(duì)乳酸菌的抑制作用

24種甜味香精的MIC測(cè)定結(jié)果如表3所示。

表3 香精對(duì)乳酸菌的MIC

由表3可以看出，24種甜味香精中，有21種對(duì)兩種乳酸菌產(chǎn)生了不同程度的抑制作用。13，18，19，23，24，26這6種香精對(duì)Lb的抑菌作用較強(qiáng)；13，18，19，20，23，25，26，29，30這9種香精對(duì)St的抑菌作用較強(qiáng)。MIC越小，說(shuō)明其抑菌效果越強(qiáng)，對(duì)于Lb，MIC：18=19=26＜13=23＜30。對(duì)于St，MIC：18=19=30＜13=20=26＜23=25=29。食用香精在食品中是按生產(chǎn)需要適量添加，一般添加量在0.01%～0.5%之間。兩種乳酸菌的MIC均低至1.563%，接近于實(shí)際添加量，說(shuō)明這幾種香精在低濃度下對(duì)乳酸菌有明顯的抑制作用，可能會(huì)影響發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程或保存期間乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖和生物活性。

不同香精配方成分差異很大，相同風(fēng)味的香精，由于需求不同，其配方也不盡相同。香精是由各種酸、醇、醛、酮、酯類等組成的混合物，一般含有二、三十種化學(xué)成分。天然香精或人工香精可能含有抑制乳酸菌活性的物質(zhì)，具體機(jī)理尚不清楚。表3中挑選了5種不同廠家生產(chǎn)的草莓香精，其中4種都對(duì)乳酸菌產(chǎn)生了明顯的抑菌作用。張丹[8]等用氣質(zhì)法分析草毒香精中成分，共鑒定出29種化學(xué)成分，其中乙醇占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)的26.979%，丙二醇占66.165%，揮發(fā)性成分中乙基麥芽酚占1.979%，葉醇占1.272%。草莓香精的抑菌效果可能源自其主要組成成分。

3.4 其他添加劑對(duì)乳酸菌的抑制作用

4種甜味劑、2種酸度調(diào)節(jié)劑的MIC實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

由表4可以看出，甜味劑在10.000 g/100mL質(zhì)量濃度下對(duì)兩種乳酸菌基本無(wú)抑菌作用。根據(jù)GB 19302-2010和GB 2760-2011，發(fā)酵乳中允許使用安賽蜜和三氯蔗糖，其最大使用量分別為0.35 g/kg和0.3 g/kg（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其在使用范圍對(duì)乳酸菌無(wú)抑菌作用。

表4 其他添加劑對(duì)乳酸菌的MIC g/100mL

兩種酸度調(diào)節(jié)劑對(duì)乳酸菌均產(chǎn)生明顯的抑菌作用。St比Lb對(duì)酸更敏感。乳酸菌是一類以乳酸為唯一或主要代謝產(chǎn)物的細(xì)菌，故它們對(duì)酸性環(huán)境比較適應(yīng)。乳桿菌屬的最適pH值為5.5～6.2，最低生長(zhǎng)pH值為4.5。鏈球菌屬生長(zhǎng)pH值范圍較廣，對(duì)酸較不敏感。但當(dāng)乳酸菌接種到初始pH偏離最適pH較遠(yuǎn)的培養(yǎng)條件下時(shí)，生長(zhǎng)速度很低。10.000%一水檸檬酸的pH值為1.69，在此酸性條件下，各種乳酸菌的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，隨著一水檸檬酸濃度稀釋，pH值逐漸上升，0.078%一水檸檬酸的pH值為2.96，此pH值仍低于乳酸菌最適pH值，但已無(wú)抑菌圈產(chǎn)生。當(dāng)介質(zhì)pH值在2.96時(shí)，菌體內(nèi)pH值可能高于此值，故其新陳代謝沒(méi)有收到抑制。

4 結(jié)束語(yǔ)

7種色素在初篩濃度下，對(duì)Lb和St均無(wú)抑制作用。多種甜味香精對(duì)乳酸菌產(chǎn)生明顯的抑制作用，不同菌株對(duì)不同香精敏感性不同，同一風(fēng)味不同廠家的香精，對(duì)同一菌株的抑菌效果也存在差異。這可能與其化學(xué)成分和組成差別有關(guān)。其中18草莓香精、19草莓香精、26特濃草莓香精對(duì)Lb的抑菌作用最強(qiáng)，MIC均為1.563%；18、19、30酸奶香精對(duì)St的抑菌作用最強(qiáng)，MIC均為3.125%。

兩種乳酸菌對(duì)4種常用甜味劑不敏感。DL-蘋果酸、一水檸檬酸在食品中常用作酸度調(diào)節(jié)劑或防腐劑，兩種乳酸菌對(duì)其十分敏感。其對(duì)Lb的MIC均為0.313%，對(duì)St的MIC均為0.156%，St對(duì)酸的耐受性更差。

抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，酸度調(diào)節(jié)劑對(duì)乳酸菌的抑菌力最高，香精其次，色素和甜味劑基本無(wú)抑菌力。添加劑對(duì)乳酸菌的抑菌機(jī)理有待于進(jìn)一步的研究和探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明多種添加劑對(duì)乳酸菌產(chǎn)生抑菌作用，可能對(duì)酸奶發(fā)酵過(guò)程及保質(zhì)期間活乳酸菌數(shù)量產(chǎn)生影響。

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