醬油中產(chǎn)氣代表性微生物的篩選和檢測方法的建立

張潔

摘 要：本文分析醬油產(chǎn)氣的誘發(fā)原因，篩選出醬油樣本中的產(chǎn)氣微生物，通過模擬脹袋環(huán)境，找出可疑菌株并進(jìn)行產(chǎn)氣驗證。采用RCM進(jìn)行目標(biāo)菌培養(yǎng)，在pH=7.5、37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)18 h，最終檢出引發(fā)醬油產(chǎn)氣的代表性微生物丁酸梭菌，且該檢測方法靈敏度較高、準(zhǔn)確性強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：醬油產(chǎn)氣;代表性微生物;微生物篩選

Abstract：This paper analyzes the causes of soy sauce gas production， comprehensively screens microorganisms in soy sauce samples， and finds out suspicious strains and conducts gas production verification by simulating the swelling environment. The target bacteria were cultured by RCM， and cultured under anaerobic conditions at pH=7.5 and 37 ℃ for 18 h. Finally， the representative microorganism Clostridium butyricum which caused soy sauce gas production was determined， and the detection method was proved to be highly sensitive and accurate.

Key words：Soy sauce gas production; Representative microorganisms; Microorganism screening

中圖分類號：TS264.2

醬油釀造是我國食品工業(yè)的重要構(gòu)成部分，產(chǎn)品存放過程中脹袋（瓶）、滲漏問題普遍存在，導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)降低并引發(fā)食品安全風(fēng)險，可能對生產(chǎn)企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益獲取及市場口碑造成不利影響。為有效避免上述問題，需要通過實驗分析，找出醬油脹袋（瓶）的誘發(fā)機(jī)理，為醬油產(chǎn)品質(zhì)量控制方案制定提供理論依據(jù)。

1 醬油產(chǎn)氣機(jī)理分析

研究表明，醬油產(chǎn)氣機(jī)理非常復(fù)雜，醬油脹袋（瓶）的原因可大致分為3種：①物理原因，如熱脹冷縮。②化學(xué)原因，如酸堿反應(yīng)。③生物原因，如微生物產(chǎn)氣。以上3種原因中，生物原因被大多數(shù)學(xué)者所認(rèn)可，主要是由于醬油產(chǎn)品采用微生物發(fā)酵的方式生產(chǎn)，其所處環(huán)境中微生物組成非常復(fù)雜，目前行業(yè)采用巴氏法進(jìn)行滅菌，很難將醬油內(nèi)微生物完全滅除。醬油成品中微生物的來源：①灌裝滅菌前空氣、設(shè)備系統(tǒng)內(nèi)存在的耐熱菌。②原材料中的微生物，如乳酸菌、酵母菌等[1]。

2 醬油產(chǎn)氣代表性微生物篩選與檢測

2.1 產(chǎn)氣微生物鑒定

2.1.1 樣本采集

實驗用醬油樣本來自某廠同一生產(chǎn)線同批次生產(chǎn)的高鹽稀態(tài)三級醬油產(chǎn)品，包括正常醬油和產(chǎn)氣醬油。

2.1.2 微生物分離

微生物分離在無菌條件下進(jìn)行，將產(chǎn)氣樣本充分搖勻后，取25 mL樣本加入到225 mL無菌生理鹽水當(dāng)中，得到10倍稀釋液。分別取100和10-1兩稀釋度樣本0.1 mL均勻涂抹在對應(yīng)培養(yǎng)基上，其中，細(xì)菌分離采用營養(yǎng)瓊脂，培養(yǎng)條件為36 ℃、48 h;霉菌、酵母菌分離采用孟加拉紅培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為28 ℃、5 d;厭氧菌分離采用MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為36 ℃、72 h。

各稀釋度均設(shè)置2組平行實驗和1組空白對照，形態(tài)不同菌株在培養(yǎng)基內(nèi)反復(fù)純化2～3次，純化菌種經(jīng)標(biāo)記后放置于甘油管內(nèi)，在-80 ℃條件下冷凍保存。

最終，產(chǎn)氣醬油樣本內(nèi)未分離出酵母菌和霉菌，營養(yǎng)瓊脂和MRS培養(yǎng)基中分別分離出部分細(xì)菌和厭氧菌。樣本稀釋梯度為100時，實驗分離出的細(xì)菌菌落數(shù)量較多、分布密集且黏連現(xiàn)象嚴(yán)重，因形態(tài)辨別困難，無法進(jìn)行產(chǎn)氣菌分離。樣本稀釋梯度為10-1時，分離出細(xì)菌相對分散、數(shù)量適中、便于觀察，可用于產(chǎn)氣菌分離。使用革蘭氏染色顯微鏡觀察菌體形態(tài)，合并相似菌株，完成菌株初步篩選，最終對營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的8株菌株（編號N1～8）和MRS培養(yǎng)基中分離出的1株菌株（編號M1）繼續(xù)做純化處理。

2.1.3 微生物驗證

在相應(yīng)培養(yǎng)基上刮取已編號純化微生物新鮮菌苔，放入無菌生理鹽水中，制成103 CFU·mL-1的菌懸液。取0.1 mL菌懸液添加至產(chǎn)氣驗證培養(yǎng)基當(dāng)中分別培養(yǎng)，觀察導(dǎo)管內(nèi)氣泡生成情況，判斷是否為產(chǎn)氣微生物。如表1產(chǎn)氣驗證結(jié)果。

驗證發(fā)現(xiàn)，N1～8菌株在14 d內(nèi)均未產(chǎn)氣，M1菌株的3支試管在7 d后產(chǎn)生一定氣量，14 d后產(chǎn)氣量明顯增加。而陽性對照組和厭氧培養(yǎng)下陽性對照組的3支試管均發(fā)生產(chǎn)氣現(xiàn)象，14 d的產(chǎn)氣量要高于7 d，且厭氧培養(yǎng)下陽性對照組的產(chǎn)氣現(xiàn)象更為明顯[2]。由此可以確定M1菌株為導(dǎo)致醬油產(chǎn)氣的微生物。

2.1.4 產(chǎn)氣微生物的鑒定方法

常規(guī)法。①細(xì)菌。觀察細(xì)菌菌落形態(tài)、大小、芽孢染色等情況，進(jìn)行生理特性及生化反應(yīng)試驗。②酵母菌。觀察菌落特征，進(jìn)行染色試驗和生理生化試驗。③霉菌。觀察菌落形態(tài)及特征。

VITEK2 Compact法。向一次性試管內(nèi)添加3 mL無菌生理鹽水，使用消毒棉簽沾取單一菌落配制菌懸液，濁度達(dá)到0.6～0.7后，停止攪拌，放入填充倉進(jìn)行測試。

飛行時間質(zhì)譜法。取純化和產(chǎn)氣驗證后的菌落，將新鮮菌落直接涂抹在MALDI靶板上，使其自然干燥。然后在菌層上添加1 ?L70%的甲酸水溶液，自然干燥后再添加1 ?L基質(zhì)溶液，干燥后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

顯微鏡觀察中發(fā)現(xiàn)，M1菌株呈現(xiàn)短桿形態(tài)，單個或成對出現(xiàn)，革蘭氏染色為陽性。按照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》中要求，對M1菌株做過氧化氫酶、硝酸鹽還原等試驗，觀察菌體變化情況。試驗結(jié)果如表2所示。