高效液相色譜法測定特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量

朱丹丹　洪輝　吳紅宇　吳芝岳　辛正杰

摘 要：本研究以食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中乳鐵蛋白的測定（征求意見稿）》為參考，優(yōu)化預(yù)處理步驟和梯度洗脫條件，建立了一種用紫外高效液相色譜測定特殊用途嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量的方法。色譜柱為C4，5 μm，300A，250 mm×4.6 mm，流動相A為乙腈，流動相B為0.1%三氟乙酸，檢測波長為280 nm。結(jié)果表明，乳鐵蛋白的檢出限為2.3 mg/100 g，定量限為3.9 mg/100 g，在乳鐵蛋白濃度為10～140 μg·mL-1范圍內(nèi)，檢測結(jié)果呈良好線性關(guān)系，回收率在98%～105%。用此方法檢測嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，精密度高，重現(xiàn)性好。

關(guān)鍵詞：乳鐵蛋白;高效液相色譜法;特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品;紫外檢測器

Abstract：This study was based on the national food safety standards food on the determination of lactoferrin， optimizing the pretreatment steps and gradient elution conditions， establishing a method with a HPLC to determin the lactoferrin containingin infant special medical purposes formula food Chromatographic conditions： the chromatographic column was C4， 5 μm， 300A， 250 mm×4.6 mm， the mobile phase A was acetonitrile， the mobile phase B was 0.1% trifluoroacetic acid， and the detection wavelength was 280 nm. The results showed that the detection limit of lactoferrin was 2.5 mg/100 g， and the determination limit was 4.0 mg/100 g which is in the range of lactoferrin concentration of 10～140μg·mL-1. The detection results showed a good linear relationship， and the recovery rate was 98%～105%. The method on determining lactoferrin content in infant formula has more convenient operation， higher precision， higher accuracy and better repeatability.

Key words：Lactoferrin; HPLC; Formula foods for infants and young children for special medical purposes; Ultraviolet detector

中圖分類號：O657.72

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品，市場購買;乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%），購自北京美正檢測技術(shù)有限公司;乙腈（CH3CN，色譜純，含量≥99.8%），購自美國天地試劑公司;磷酸氫二鈉（Na2HPO4，含量≥99.0%）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4，含量≥99.0%）、氯化鈉（NaCl，含量≥99.5%）、氯化鉀（KCl，含量≥99.5%），購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鹽酸（HCl，含量≥99.5%），購自浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司;三氟乙酸（CF3CO2H，含量≥99.0%），購自上海麥克林生化科技有限公司。

1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司生產(chǎn);MS105DU，瑞士梅特勒-托利多公司生產(chǎn);pH計(jì)（精度為0.01），瑞士梅特勒-托利多公司生產(chǎn);TGL-16M冷凍離心機(jī)，鹽城市安信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn);XW-80A渦旋混合器，上海醫(yī)大儀器有限公司生產(chǎn);C4色譜柱，沃特世科技（上海）有限公司生產(chǎn);乳鐵蛋白肝素免疫親和柱，北京美正檢測技術(shù)有限公司生產(chǎn);0.22 μm微孔濾膜，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理

樣品中的乳鐵蛋白經(jīng)磷酸鹽緩沖液提取，肝素親和柱凈化后，利用C4色譜柱分離，于280 nm波長處紫外檢測器檢測，外標(biāo)法定量。

1.2.2 試劑配制

（1）磷酸鹽緩沖溶液。稱取8.00 g氯化鈉、2.92 g

十二水磷酸氫二鈉、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化鉀，用900 mL水溶解后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.4，再加水至1 000 mL。

（2）結(jié)合緩沖液。稱取30.083 g十二水合磷酸氫二鈉，2.496 g二水合磷酸二氫鈉，加入20 mL試劑A（50×濃縮液），加入900 mL水溶解，最后定容至1 000 mL。試劑A為升級后此款肝素親和柱配套使用溶液，升級后產(chǎn)品測得回收率更高。

（3）洗脫液。稱取7.52 g十二水合磷酸氫二鈉、0.624 g二水合磷酸二氫鈉、29.2 g氯化鈉，加入400 mL水溶解，最后定容至500 mL。

（4）0.1%三氟乙酸溶液。取三氟乙酸1.00 mL，用水定容至1 000 mL，搖勻，過0.22 μm濾膜，超聲后備用。

如果磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為無水，需要進(jìn)行折算。

1.2.3 樣品處理

（1）提取。稱取3 g（精確至0.01 g）樣本于50 mL螺口塑料離心管中，先加入約30 mL結(jié)合緩沖液渦旋振蕩至樣本充分溶解，再加入結(jié)合緩沖液定容至刻度，混勻。于4 ℃，9 800 r·min-1轉(zhuǎn)速條件下離心20 min，離心后輕輕取出中間層，上層有脂質(zhì)，下面有沉淀，用大量程的移液器將中間液體部分吸出，注意不要吸取上層脂質(zhì)和下面沉淀。取其中的10～15 mL作為上樣液。

（2）凈化。取出肝素親和柱，注射器針筒直接穿透柱塞，連接肝素親和柱，去掉親和柱下方堵頭，加壓排出柱內(nèi)的保存液，待柱內(nèi)保存液與篩板齊平后，取5 mL結(jié)合緩沖液平衡親和柱。

（3）上樣。待結(jié)合緩沖液液面接近篩板后取凈化步驟處理完畢后樣品提取液15 mL過柱（若樣本量大可分次加入，用SPE流速調(diào)節(jié)閥控制上樣流速，約0.3 mL·min-1），棄去全部流出液。

（4）淋洗。待樣品提取液加完，液面與篩板齊平后，加10 mL結(jié)合緩沖液，進(jìn)行親和柱的洗雜。

（5）洗脫。進(jìn)行洗雜后，排干柱內(nèi)結(jié)合緩沖液，向肝素親和柱內(nèi)加入4 mL洗脫緩沖液，靠重力流速滴出，流速≤1滴/s，收集全部洗脫液，并定容至4 mL，將收集液過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)儲備液（10 000 μg·mL-1）：在已購買的10 mg乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)品小瓶中準(zhǔn)確加入1.00 mL磷酸鹽緩沖溶液，渦旋混勻1 min。該標(biāo)準(zhǔn)溶液在-20 ℃下可保存6個(gè)月。

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作液（1 000 μg·mL-1）：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液50 μL于進(jìn)樣小瓶中，再準(zhǔn)確加入450 μL結(jié)合液渦旋混勻。該標(biāo)準(zhǔn)工作液在0～4 ℃冰箱中可保存2周。

乳鐵蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)工作液10、30、50、70 μL和140 μL于5個(gè)進(jìn)樣小瓶中，再分別加入990、970、950、930 μL和860 μL洗脫緩沖液，渦旋混勻，得到10～140 μg·mL-1系列濃度標(biāo)準(zhǔn)液。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做曲線回歸方程。

乳鐵蛋白含量計(jì)算：

（1）

式（1）中，W-乳鐵蛋白含量，單位為mg/100 g;ρ-樣液檢測濃度，單位為μg·mL-1;4-洗脫體積，單位為mL;V-定容體積，單位為mL;15-上樣體積，單位為mL;m-樣品稱樣量，單位為g;1 000-濃度單位換算系數(shù);n-稀釋倍數(shù)。

1.2.5 高效液相色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry300tm C4 5μm，4.6×250 mm

Column;柱溫30 ℃;進(jìn)樣體積30 μL;流速

1.0 mL·min-1;檢測波長280 nm;流動相：0.1%三氟乙酸溶液和乙腈。流動相梯度洗脫程序如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳鐵蛋白的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及標(biāo)準(zhǔn)品

將濃度為10、30、50、70 μg·mL-1和140 μg·mL-1工作液分別進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作曲線回歸方程。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.878 1x-14.337 4，

線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0，線性關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜見圖1，標(biāo)準(zhǔn)品圖譜見圖2，樣品圖譜見圖3。

2.2 檢出限和定量限

依據(jù)藥典2010版第二部附錄XIX A《藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》，認(rèn)為信噪比為3∶1時(shí)相應(yīng)濃度為方法檢出限，信噪比為10∶1相應(yīng)濃度為方法定量限。從曲線最低點(diǎn)開始分別稀釋至1、3、5、7 μg·mL-1和9 μg·mL-15個(gè)濃度，分別得到信噪比約為0.86、3.35、9.08、14.49和21.49，故認(rèn)為本方法的檢出限為3 μg·mL-1，定量限為5 μg·mL-1。用公式

（1）換算得到相應(yīng)乳鐵蛋白含量，

（2）

式（2）中：X-試樣中乳鐵蛋白的含量，單位mg/100 g;C-待測液中乳鐵蛋白的濃度，單位μg·mL-1;3.5-洗脫液體積;V-定容體積;15-上樣液體積;m-稱樣量，單位g。計(jì)算檢出限時(shí)稱樣量以3 g計(jì)，定容體積為100 mL。

故本研究中乳鐵蛋白檢出限為2.3 mg/100 g，定量限為3.9 mg/100 g。

2.3 方法回收率

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》

（GB/T 27404-2008）的要求，結(jié)合實(shí)際檢測樣品中的乳鐵蛋白含量以及親和柱的柱容量，對樣品進(jìn)行3水平的加標(biāo)測定，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)?；厥章试?8%～105%，表明本方法準(zhǔn)確度較高。加標(biāo)回收結(jié)果見表2。

2.4 方法精密度

利用特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品同一天進(jìn)行同一樣品進(jìn)行6個(gè)平行試驗(yàn)，RSD結(jié)果1.61%，小于10%，表明本方法的精密度較好，測定見表3。

2.5 方法重現(xiàn)性

對同一批特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品分別進(jìn)行6次獨(dú)立測定，RSD結(jié)果小于10%，表明本方法的重現(xiàn)性較好。測定結(jié)果見表4。

3 結(jié)論

本方法采用肝素免疫親和柱凈化，C4色譜柱分離，外標(biāo)法定量。初步建立了一種準(zhǔn)確、高效的特殊醫(yī)學(xué)用途嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的含量測定方法，結(jié)果表明：在10～140 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，方法的檢出限為2.3 mg/100 g，定量限為3.9 mg/100 g，平均回收率為102%，同一天同一樣品檢測結(jié)果RSD為1.61%，耐受性實(shí)驗(yàn)中檢測結(jié)果的RSD為3.58%。各數(shù)據(jù)均符合相應(yīng)國家標(biāo)準(zhǔn)，且結(jié)果良好，能滿足目前大部分市面上嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量測定。