影響超高溫滅菌乳貨架期品質(zhì)的相關(guān)蛋白酶類研究進(jìn)展

王春燕　任彩霞　任向東　關(guān)志涵　柳春洋　烏恩其　牛世禎　李洪亮

摘 要：超高溫滅菌乳（UHT乳）在貨架期內(nèi)發(fā)生的品質(zhì)劣變主要是由產(chǎn)品中殘存的內(nèi)源和（或）外源耐熱蛋白酶、脂肪酶水解內(nèi)容物發(fā)生的一系列物理、化學(xué)變化引起的。本文綜述了引發(fā)超高溫滅菌乳貨架期品質(zhì)劣變的主要蛋白酶及其作用原理，并就未來研究方向進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞：超高溫滅菌乳（UHT乳）;貨架期品質(zhì);蛋白酶

Abstract：The deterioration of UHT milk during its shelf life is mainly caused by a series of physical and chemical changes， due to the residual endogenous and / or exogenous heat-resistant proteases and lipase hydrolysates of the product. This review discussed the major proteases that cause the deterioration of UHT milk during its shelf life and the mechanisms of their function， and pointed out the future research of the field.

Key words：UHT milk; Shelf life quality; Proteases

中圖分類號：TS252.1

超高溫滅菌乳（UHT乳）是以生牛（羊）乳為原料，添加或不添加復(fù)原乳，在連續(xù)流動的狀態(tài)下，加熱到至少132 ℃并保持很短時間的滅菌，再利用無菌包材經(jīng)無菌灌裝等工序制成的液體產(chǎn)品。目前，市場銷售的純牛乳主要是巴氏殺菌乳和UHT乳兩大類，巴氏殺菌乳由于熱處理強(qiáng)度較低（72～75 ℃處理15～20 s），一般只殺滅乳中致病菌而殘留一定量的乳酸菌、酵母菌和霉菌;而UHT乳熱處理強(qiáng)度相對較高（135～150 ℃處理2～8 s），可以殺死乳中幾乎所有微生物（包括病原體、非病原體、芽孢等），且利用無菌包材進(jìn)行無菌灌裝，因此具有常溫儲存、攜帶方便、易于保存與貨架期長等優(yōu)勢，非常適合我國目前冷鏈不健全、運(yùn)輸半徑大等的市場消費(fèi)需求。不僅中國，全球范圍內(nèi)對超高溫加工和無菌包裝牛奶的需求也正在增長。對于許多發(fā)展中國家和熱帶國家而言，UHT乳是液體乳制品的最佳選擇，因?yàn)樗恍枰蜏匚锪骱痛鎯?，并且具有相對較長的保質(zhì)期（≥6個月），這些特征在乳制品出口國際貿(mào)易中具有明顯的商業(yè)開發(fā)優(yōu)勢。

目前，企業(yè)對UHT乳產(chǎn)品感官品質(zhì)的重要評價指標(biāo)有色澤、滋氣味和組織狀態(tài)[1]，優(yōu)質(zhì)液態(tài)乳產(chǎn)品在貨架期內(nèi)的品質(zhì)要求見表1。

盡管UHT乳市場廣闊，但其在貨架期內(nèi)經(jīng)常發(fā)生一些品質(zhì)劣變，如蛋白水解、苦味、老化凝膠、脂肪上浮、風(fēng)味劣化等。影響UHT乳質(zhì)量的因素有很多，其中來源于原料乳本身的纖維蛋白溶酶（Plasmin）及來源于原料乳中嗜冷菌的耐熱蛋白酶（Protease）對牛乳蛋白的水解作用是影響UHT乳品質(zhì)的重要因素。雖然UHT先進(jìn)的加工工藝與設(shè)備可殺死原料奶中幾乎所有的微生物而保證其產(chǎn)品的生物安全性，但無法在熱處理過程中將體細(xì)胞和一些細(xì)菌釋放的耐熱酶完全滅活，正常情況下會殘留20%～40%的酶活[2]。殘留的耐熱酶將在產(chǎn)品貨架期內(nèi)緩慢水解乳蛋白、脂肪等成分，導(dǎo)致產(chǎn)品出現(xiàn)老化凝膠、苦味、脂肪分層、風(fēng)味劣化等質(zhì)量缺陷，對消費(fèi)者健康及企業(yè)品牌造成巨大的不良影響[3]。

1 影響UHT乳貨架期品質(zhì)的蛋白酶及其作用機(jī)理

1.1 纖維蛋白溶酶系統(tǒng)及其作用機(jī)理

1.1.1 纖維蛋白溶酶系統(tǒng)

牛奶中的內(nèi)源酶已經(jīng)被研究了100多年，到目前為止，已經(jīng)從牛奶中鑒定出約70種酶[4]，這些酶具有不同的特異性、穩(wěn)定性和對產(chǎn)品質(zhì)量的影響[5]。

牛乳中的纖維蛋白溶酶是一個復(fù)雜的酶系統(tǒng)，包含纖維蛋白溶酶（PL）、纖維蛋白溶酶酶原（PLG）、纖維蛋白溶酶酶原激活劑（PA）、纖維蛋白溶酶酶原激活劑抑制劑（PAI）以及纖維蛋白溶酶抑制劑（PI）。其中，牛乳纖維蛋白溶酶（EC3.4.21.7）是一種絲氨酸蛋白酶，其最適pH為7.5，最適溫度為37 ℃。纖維蛋白溶酶酶原是纖維蛋白溶酶在乳中的主要存在方式，是非活性形式，可被組織型（tPA）或尿激酶型（uPA）纖維蛋白溶酶酶原激活劑激活。鮮乳中的纖維蛋白溶酶酶原濃度為0.18～2.8 mg·L-1，是纖維蛋白溶酶（0.1～0.7 mg·L-1）的2～30倍。此外，該系統(tǒng)還受纖維蛋白溶酶和纖維蛋白溶酶酶原激活物抑制劑的調(diào)節(jié)，如圖1所示。

據(jù)報(bào)道，該酶系統(tǒng)與奶牛乳腺健康相關(guān)，即與體細(xì)胞計(jì)數(shù)（SCC）有關(guān)[6-7]，這是由于纖維蛋白溶酶酶原激活劑uPA通過uPA受體與體細(xì)胞結(jié)合[8]，并且在體細(xì)胞裂解時釋放，并與酪蛋白膠束結(jié)合，該酶系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶、纖維蛋白溶酶酶原和纖維蛋白溶酶酶原激活劑tPA也主要與酪蛋白膠束結(jié)合[9];纖維蛋白溶酶抑制劑和纖維蛋白溶酶酶原激活劑抑制劑存在于乳清相。

纖維蛋白溶酶系統(tǒng)具有很高的熱穩(wěn)定性，尤其是促進(jìn)蛋白水解的PL、PLG和PA，在UHT處理后可以保持部分活性。因此，纖維蛋白溶酶系統(tǒng)與UHT牛奶的物理化學(xué)降解密切相關(guān)[10]。

1.1.2 纖維蛋白溶酶水解酪蛋白機(jī)理

纖維蛋白溶酶在牛乳微觀結(jié)構(gòu)中與酪蛋白膠束底物結(jié)合，主要作用于β-酪蛋白（β-CN）和αs2-酪蛋白（αs2-CN），在較小程度上水解αs1-酪蛋白（αs1-CN），但對κ-酪蛋白和乳清蛋白幾乎沒有水解作用，且在直接UHT滅菌乳中纖維蛋白溶酶對酪蛋白的水解作用更為明顯，貨架期內(nèi)纖維蛋白溶酶對直接UHT滅菌乳中αs1-CN、αs2-CN和β-CN的水解產(chǎn)物信息分別如圖2～4和表2～4所示（Q值>1 400的肽具有潛在苦味）[11]。

UHT乳的老化膠凝現(xiàn)象被認(rèn)為是牛奶熱處理過程中κ-CN與變性β-lg絡(luò)合引起的。UHT乳儲存期間，該復(fù)合物的持續(xù)釋放和聚集可能導(dǎo)致凝膠化。據(jù)推測，通過水解酪蛋白將復(fù)合物錨定在酪蛋白膠束表面，蛋白水解可促進(jìn)κ-CN-β-lg復(fù)合物的釋放[12]。

1.2 嗜冷菌耐熱蛋白酶及其作用機(jī)理

1.2.1 嗜冷菌耐熱蛋白酶

除了纖維蛋白溶酶外，來源于細(xì)菌的耐熱蛋白酶對UHT乳貨架期品質(zhì)也可能是一個嚴(yán)重威脅，因?yàn)檫@些細(xì)菌在生奶中是不可避免的，其中有些細(xì)菌在低溫儲運(yùn)時產(chǎn)生的耐熱的蛋白酶和脂肪酶可以承受UHT熱強(qiáng)度過程。在所有的細(xì)菌中，假單胞菌產(chǎn)生的耐熱蛋白酶是導(dǎo)致UHT奶失穩(wěn)的最重要因素[13]。在假單胞菌屬中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種屬于AprX酶家族的胞外堿性金屬蛋白酶，這是造成牛奶變質(zhì)的原因[14]。據(jù)報(bào)道，熱穩(wěn)定蛋白酶是假單胞菌在細(xì)菌生長初期或指數(shù)晚期產(chǎn)生的，通常此時細(xì)菌數(shù)為107～108 CFU·mL-1[15]。這意味著AprX的產(chǎn)生取決于儲運(yùn)時間、溫度和原奶假單胞菌的數(shù)量。因此，AprX水平間接反映了農(nóng)場的衛(wèi)生管理情況和牛奶的儲運(yùn)歷史。Lei Yuan等[16]對中國11個城市共16個牧場的原奶進(jìn)行細(xì)菌菌群分離鑒定，并對這些微生物在不同貯存溫度下產(chǎn)生的耐熱酶特性進(jìn)行了深入研究[17]，其研究結(jié)果顯示，從中國11個城市共16個牧場中共分離得到涵蓋24個菌屬的76株嗜冷菌，其中有48株菌具有蛋白酶活性，分離得到的25株假單胞菌都具有蛋白酶活性，并且熒光假單胞菌所產(chǎn)生的蛋白酶是76株菌中活性最高的。

1.2.2 嗜冷菌耐熱蛋白酶水解作用機(jī)理

AprX不僅可以像凝乳酶一樣水解κ-酪蛋白的肽鍵Phe105-Met106[18]，而且可以非特異性地水解通常在可溶性親水性糖巨肽周圍呈現(xiàn)為“毛狀層”的區(qū)域[19]。因此，膠束表面親水尾部的裂解會減少空間排斥力和靜電排斥力，這可能會促進(jìn)凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成[14]。另外，水解β-和αs-酪蛋白的能力（即使程度低于纖維蛋白溶酶的程度）也可能破壞酪蛋白膠束的內(nèi)部，進(jìn)一步促進(jìn)膠凝的形成[20]。

張春月研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，與纖維蛋白溶酶不同，牛乳產(chǎn)品在AprX的作用下粒徑尺寸分布向較大尺寸轉(zhuǎn)移，這可能是因?yàn)锳prX可以較容易地水解κ-CN，一旦足夠量的κ-CN水解（超過95%），顆粒之間的碰撞將導(dǎo)致黏附和酪蛋白聚集體的形成[20]。κ-CN的氨基酸序列如圖5所示。

1.3 總結(jié)

UHT乳貨架期內(nèi)品質(zhì)劣變（苦味、凝膠、沉淀）是由嗜冷菌耐熱蛋白酶和纖維蛋白溶酶共同引起的，與纖維蛋白溶酶相比，嗜冷菌蛋白酶能夠以與凝乳酶相似的方式水解κ-CN，且嗜冷菌蛋白酶表現(xiàn)出更多的非特異性蛋白水解模式，通常會產(chǎn)生溶解性小肽，產(chǎn)生的副酪蛋白膠束聚集形成粗且硬的凝膠;而纖維蛋白溶酶水解產(chǎn)生較大的非溶解性衍生肽，產(chǎn)生的凝膠軟且細(xì)。乳品中蛋白質(zhì)凝膠老化模型如圖6所示。

當(dāng)嗜冷菌耐熱蛋白酶和纖維蛋白溶酶同時存在時，纖維蛋白溶酶對牛乳蛋白的水解作用更占優(yōu)勢，因此，與間接UHT殺菌工藝相比，使用直接UHT殺菌工藝時，與纖維蛋白溶酶相關(guān)的老化膠凝發(fā)生更頻繁，會產(chǎn)生細(xì)而軟的凝膠，且凝膠可以懸浮在乳清中;而對間接UHT殺菌工藝的滅菌乳來說，引發(fā)產(chǎn)品凝膠和沉淀的主要原因是嗜冷菌耐熱蛋白酶對酪蛋白的水解作用，產(chǎn)生的粗而硬的凝膠不能懸浮在乳清中而是沉淀在容器底部[23]，如圖7所示。圖7（a）中，B為空白對照，即正常滅菌乳，未添加酶;aprX為添加20 μg·mL-1 AprX的滅菌乳;PL為添加1.6 μL·mL-1纖維蛋白溶酶的滅菌乳。圖7（b）為含20 μg·mL-1 AprX和1.6 μL·mL-1纖維蛋白溶酶的膠凝樣品倒置圖像。

引起發(fā)UHT乳老化凝膠的第一個關(guān)鍵因素是蛋白的水解度。張春月研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，含ApX和纖維蛋白溶酶的樣品發(fā)生凝膠的蛋白質(zhì)水解的臨界水平分別為1.3%和2.1%，與酶濃度或儲存溫度無關(guān)[20]。第二個影響因素是UHT乳的儲存溫度。在低溫（<20 ℃）儲存下凝膠化緩慢，在20～25 ℃加速，>30 ℃下不會發(fā)生凝膠或凝膠發(fā)生延遲，這是由于貯藏溫度>30 ℃條件下，纖維蛋白溶酶的蛋白水解速度大于多肽聚集的速度，無法形成凝膠[23]。因此，為避免UHT乳在貨架期內(nèi)發(fā)生品質(zhì)劣變，應(yīng)從這兩個關(guān)鍵因素著手進(jìn)行控制。

蛋白水解度與原奶質(zhì)量（嗜冷菌和體細(xì)胞數(shù)量及儲運(yùn)溫度和時間）密切相關(guān)，提高牧場環(huán)境衛(wèi)生，并保障原奶低溫短時儲運(yùn)是降低產(chǎn)品蛋白水解度的源頭保障，選擇合適的殺菌工藝平衡、活性營養(yǎng)成分保留和微生物/酶滅活是過程保障;最終產(chǎn)品的儲運(yùn)溫度是終端保障。只有源頭、過程、終端節(jié)節(jié)把關(guān)，才能保障滅菌乳產(chǎn)品在貨架期內(nèi)的品質(zhì)。

2 展望

隨著優(yōu)質(zhì)乳工程在行業(yè)內(nèi)的深入推行，企業(yè)對滅菌乳產(chǎn)品品質(zhì)升級的需求已經(jīng)受到前所未有的重視，為使終產(chǎn)品營養(yǎng)價值得到最大限度提高，企業(yè)不斷在提升原奶品質(zhì)和優(yōu)化加工工藝方面做出巨大努力，如刪減不必要的工藝環(huán)節(jié)帶來的設(shè)備閑置損失和/或重新設(shè)定合理工藝參數(shù)增加的設(shè)備改造成本;此外，企業(yè)還面臨著工藝優(yōu)化（熱處理強(qiáng)度降低）后帶來的終產(chǎn)品貨架期品質(zhì)安全風(fēng)險(xiǎn)，如微生物和酶的滅活效率降低而帶來的品質(zhì)劣變及貨架期縮短。

因此，未來超高溫滅菌乳貨架期品質(zhì)的研究方向重在源頭、過程、終端。①源頭，即如何進(jìn)行牧場管理，保障原奶品質(zhì)達(dá)到優(yōu)質(zhì)乳工程條例中明確規(guī)定的不同等級原料乳標(biāo)準(zhǔn)。②過程，即如何選擇合適的殺菌工藝，以達(dá)到平衡活性營養(yǎng)成分保留和保障貨架期品質(zhì)的微生物/酶滅活的效果。③終端，即終產(chǎn)品儲運(yùn)溫度及在該溫度下的存放時間。3個宏觀研究方向又包含多個微觀研究焦點(diǎn)，包括微生物、體細(xì)胞、酶、蛋白質(zhì)水解等。這需要各高校、研究機(jī)構(gòu)和乳品企業(yè)密切配合，相互支持，只有將滅菌乳生產(chǎn)全鏈條研究透徹，才能科學(xué)合理的運(yùn)用到實(shí)際生產(chǎn)中，將本土生產(chǎn)的牛奶打造成為真正的優(yōu)質(zhì)奶。

參考文獻(xiàn)：

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 25190-2010 中華人民共和國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 滅菌乳[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[2]RAUH V M，SUNDGREN A，BAKMAN M，et al.Plasmin activity as a possible cause for age gelation in UHT milk produced by direct steam infusion[J].International Dairy Journal，2014，38（2）：199-207.

[3]張書文.原料乳中耐熱蛋白酶對UHT乳品質(zhì)的影響研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.

[4]OMAHONY JA，F(xiàn)OX PF， KELLY AL. Indigenous Enzymes of Milk[M].2013.

[5]KELLY A L，F(xiàn)ox P F. Indigenous enzymes in milk：A synopsis of future research requirements[J].International Dairy Journal，2006，16（6）：707-715.

[6]RAMOS C，PINTO，PINTO，et al. Effect of Somatic Cell Count on Bovine Milk Protein Fractions[J].Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques，2015，6（5）：1-7.

[7]MUSAYEVA K，SEDEREVI?IUS A，?ELVYT? R，et al. Relationship between somatic cell count and milk casein level obtained by two different methods[J].Czech Journal of Food Sciences，2016，34（1）：47-51.

[8]Heegaard C W，L K Andreasen，P A. The plasminogen activation system in bovine milk： differential localization of tissue-type plasminogen activator and urokinase in milk fractions is caused by binding to casein and urokinase receptor[J].Biochimica Et Biophysica Acta，1994，1222（1）：45-55.

[9]WANG L H，K D MAUER，L J. Fluorescent Labeling Study of Plasminogen Concentration and Location in Simulated Bovine Milk Systems[J].Journal of Dairy Science，2006，89（1）：58-70.

[10]RAUH V M S，ANJA，BAKMAN， et al. Plasmin activity as a possible cause for age gelation in UHT milk produced by direct steam infusion[J]. International Dairy Journal，2014，38（2）：199-207.

[11]RAUH V M J，LENE B，IPSEN，et al. Plasmin Activity in UHT Milk：Relationship between Proteolysis，Age Gelation，and Bitterness[J]. agricultural and food chemistry，2014，62（28）：6852-6860.

[12]DATTA N D H C. Age Gelation of UHT Milk—A Review[J]. Food Bioproducts Processing，2001，79（4）：197-210.

[13]VITHANAGE N R Y，THOMAS R，JADHAV，et al. Comparison of identification systems for psychrotrophic bacteria isolated from raw bovine milk[J].International Journal of Food Microbiology，2014，189：26-38.

[14]AURéLIE MATéOS M G-N，F(xiàn)RAN?OIS BAGLINIèRE.Proteolysis of milk proteins by AprX，an extracellular protease identified in Pseudomonas LBSA1 isolated from bulk raw milk，and implications for the stability of UHT milk[J].International Dairy Journal. 2015.

[15]STOECKEL M L，MELANIE，STRESSLER，et al. Heat stability of indigenous milk plasmin and proteases from Pseudomonas：A challenge in the production of ultra-high temperature milk products[J]. International Dairy Journal，2016，61：250-261.

[16]YUAN L S，F(xiàn)AIZAN A LIU，TONGJIE FLINT，et al. Psychrotrophic bacterial populations in Chinese raw dairy milk[J].LWT Food Science & Technology，2017，84：409-418.

[17]Yuan L，Sadiq F A，Liu T J，et al. Spoilage potential of psychrotrophic bacteria isolated from raw milk and the thermo-stability of their enzymes[J].Journal of Zhejiang University-SCIENCE B，2018，19（8）： 630-642.

[18]RECIO I G-R，MóNICA R，RAMOS，et al. Characterization of peptides produced by the action of psychrotrophic proteinases on κ-casein [J]. Journal of Dairy Research，2000，67（4）：625-630.

[19]GAUCHER I T G，F(xiàn)AUQUANT J.Proteolysis of casein micelles byPseudomonas fluorescensCNRZ 798 contributes to the destabilisation of UHT milk during its storage [J]. Dairy Science & Technology，2011，91（4）：413-429.

[20]ZHANG C B E，HETTINGA K. Destabilization of UHT milk by protease AprX from Pseudomonas fluorescens and plasmin[J].Food Chemistry，2018，263：127-134.

[21]FOX PFM，PLH McSweeney. Dairy chemistry and biochemistry[J].Molecular Aspects of Medicine，1998，24（1-3）：3-9.

[22]Johannes A Nieuwenhuijse，Martinus A J S van Boekel. Protein Stability in Sterilised Milk and Milk Products[J].Advanced Dairy Chemistry-proteins，2003：947-974.

[23]RAUH V M. Impact of plasmin activity on the shelf life and stability of UHT milk[D].Aarhus University，2014.