個(gè)體化假體復(fù)合人工骨移植修復(fù)兔下頜骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

陳俊蘭 吳帶生 吳紀(jì)楠 陳覺堯 鄭巧儀 彭偉

【摘要】 目的：觀察快速成型（rapid prototyping，RP）技術(shù)輔助下制作的個(gè)體化假體復(fù)合珊瑚羥基磷灰石（coralline hydroxyapatite，CHA）、重組人骨形成蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）修復(fù)兔下頜骨缺損的成骨效果。方法：以27只新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，隨機(jī)均分為三組（n=9），全部建立下頜骨連續(xù)性缺損模型，并在兔下頜骨缺損區(qū)分別植入個(gè)體化假體+自體骨（A組）、個(gè)體化假體+CHA（B組）及個(gè)體化假體+CHA+rhBMP-2（C組）。分別于術(shù)后4、12、24周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物取材，進(jìn)行大體標(biāo)本觀察、骨密度檢測、最大抗壓力測試，分別比較各組修復(fù)骨缺損的能力。結(jié)果：術(shù)后24周，三組實(shí)驗(yàn)兔外形均對(duì)稱，骨缺損區(qū)均有大量新骨形成。術(shù)后12、24周，A、C組新骨密度值及最大抗壓能力均明顯高于B組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;術(shù)后24周時(shí)，A組與C組成骨效果大體一致，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：RP技術(shù)與組織工程技術(shù)相結(jié)合修復(fù)下頜骨缺損，成骨效能肯定，CHA復(fù)合rhBMP-2后成骨能力明顯增強(qiáng)，為臨床應(yīng)用個(gè)體化假體復(fù)合人工骨移植修復(fù)下頜骨缺損提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 下頜骨缺損 個(gè)體化假體 重組人骨形成蛋白-2 珊瑚羥基磷灰石 反求工程 快速成型

[Abstract] Objective： To study the bone-formal effect of individulized prosthesis combined with coralline hydroxyapatite （CHA） and recombinant human bone morphogenetic protein-2 （rhBMP-2） on repairing rabbits mandibular defect using rapid prototyping （RP）. Method： Twenty seven New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups （n=9）， all models of mandibular continuous defect were established， the three groups were treated with different materials： individulized prostheses and autogenous bone （group A）， individulized prostheses with CHA （group B） and individulized prostheses with CHA and rhBMP-2 （group C）. The animals were killed at 4， 12 and 24 weeks after operation， the gross specimen observation， bone mineral density test and maximum anti pressure test were performed to compare the ability of repairing bone defect in each groups. Result： At 24 weeks after operation， the shape of rabbits in three groups were symmetrical， and a large number of new bone formed in the bone defect area. At 12， 24 weeks after operation， the new bone mineral density and maximum compressive capacity of group A and C were significantly higher than those of group B （P<0.05）. At 24 weeks after operation， the effects of group A and group C were similar， there was no statistical significance （P<0.05）. Conclusion： The combination of RP technology and tissue engineering technology in the repair of mandibular defects has positive osteogenic efficiency. The osteogenic ability of CHA combined with rhBMP-2 is significantly enhanced， which provides a reliable experimental basis for clinical application of individualized prosthesis combined with artificial bone transplantation to repair mandibular defects.

[Key words] Mandibular defect Individulized prosthesis Recombinant human bone morphogenetic protein-2 Coralline hydroxyapatite Reverse engineering Rapid prototyping

First-authors address： Hospital of Stomatology， Peoples Hospital of Zhongshan City， Zhongshan 528400， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.24.006

下頜骨與咀嚼、吞咽、發(fā)音等功能密切相關(guān)。傳統(tǒng)的自體骨或人工骨移植的方式并沒有從根本上解決問題，如自體骨存活率高，但骨源有限;同種異體骨和異種骨因其抗原性而受限。組織工程學(xué)的興起為解決這一問題提供了新的思路[1]。組織工程學(xué)是以體外構(gòu)建、體內(nèi)重建的技術(shù)方式擺脫了傳統(tǒng)植骨模式[2]。由于目前生物材料強(qiáng)度一般較低，且以脆性材料居多，難以承受較大的載荷，因此金屬支架的支持成為必然的趨勢。目前臨床實(shí)踐中修復(fù)頜骨缺損的金屬材料常為手工彎制而成，塑型尤為困難，無法精確匹配。近年來，隨著影像學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，快速成型（rapid prototyping，RP）技術(shù)可較為精確的恢復(fù)患者的頜骨外形，精確度好，效率高，備受臨床關(guān)注[3-4]。

本實(shí)驗(yàn)首次設(shè)想將成熟的三維重建和RP技術(shù)與現(xiàn)有的生物陶瓷材料相結(jié)合，達(dá)到外形與功能兼?zhèn)涞男迯?fù)效果，旨在為臨床應(yīng)用提供一條微創(chuàng)、高效、安全的治療途徑。珊瑚羥基磷灰石（coralline hydroxyapatite，CHA）因具有良好的組織相容性、骨引導(dǎo)活性、其理化性能與人體骨相似[5]，同時(shí)重組人骨形成蛋白-2（recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2）是具有較強(qiáng)骨誘導(dǎo)作用的多功能細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)大量新骨生成[6]。因此，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察個(gè)體化假體分別復(fù)合人工材料修復(fù)下頜骨連續(xù)性骨缺損的現(xiàn)實(shí)可能性，為今后臨床應(yīng)用提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭兔，雌雄不限，體重控制在2.5～3.0 kg，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)環(huán)境和術(shù)后處理均符合倫理審查的標(biāo)準(zhǔn)（合格證號(hào)為0061280，實(shí)驗(yàn)室設(shè)施環(huán)境合格證號(hào)為0034862）。

1.1.2 個(gè)體化假體的制作 隨機(jī)取1只實(shí)驗(yàn)兔，全麻后分層切開皮膚、皮下組織，去凈軟組織，電鋸截骨（圖1），造成下頜骨體部長寬為1.5 cm×1.0 cm的實(shí)驗(yàn)性箱狀骨缺損，建立兔下頜骨連續(xù)性缺損動(dòng)物模型（圖2）;采用Sensation16螺旋CT（Simens Somation Sensation16）掃描，獲得連續(xù)斷層影像，將掃描結(jié)果以DICOM格式輸入計(jì)算機(jī)，采用Mimics 10.0軟件進(jìn)行三維重建，記錄數(shù)字模型（圖3）;再根據(jù)鏡像原理、曲面重構(gòu)、有限元分析技術(shù)得到缺損區(qū)植入體的三維數(shù)字模型，通過快速成型機(jī)制作個(gè)體化假體的樹脂修復(fù)體（圖4～7），檢查匹配度，最后將樹脂模型澆鑄成個(gè)體化純鈦假體（圖8），消毒備用，參考文獻(xiàn)[7]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 珊瑚人工骨的準(zhǔn)備 將CHA加工成長3 mm、寬2 mm、厚2 mm的長方體，經(jīng)5%次氯酸鈉液浸泡0.5 h，流水沖洗和雙蒸水超聲清洗各3次后（3 min/次），烘干，備用。

1.2.2 復(fù)合珊瑚人工骨的制備 取27 mg rhBMP-2，溶于0.1 L溶度為4 mol/L鹽酸胍溶液中，放入1.08 g CHA內(nèi)，負(fù)壓真空，對(duì)蒸餾水透析，凍干，消毒備用。rhBMP-2和CHA的質(zhì)量比為1︰40（w︰w）。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 按術(shù)前設(shè)計(jì)全麻下建立27只實(shí)驗(yàn)兔下頜骨連續(xù)性缺損實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停▍⒄?.1個(gè)體化假體制作的建模過程分別制備27個(gè)個(gè)體化假體），隨機(jī)均分為三組：對(duì)照組（A組：個(gè)體化假體+自體骨，n=9）、實(shí)驗(yàn)1組（B組：個(gè)體化假體+CHA，n=9）與實(shí)驗(yàn)2組（C組：個(gè)體化假體+CHA+rhBMP-2，n=9）。

1.2.4 術(shù)后處理 術(shù)后每只實(shí)驗(yàn)兔常規(guī)抗感染，2次/d，持續(xù)4 d。術(shù)后以全流、半流質(zhì)飲食飼養(yǎng)各兩周，后常規(guī)飲食。術(shù)后4、12、24周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)處死3只），取缺損區(qū)標(biāo)本檢測。

1.3 實(shí)驗(yàn)觀察

1.3.1 一般情況觀察 觀察三組兔的飲食、傷口愈合情況。

1.3.2 骨密度檢測 于術(shù)后4、12、24周三個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行大體標(biāo)本觀察后，取材，標(biāo)本范圍在缺損區(qū)周緣2 mm，即1.9 cm×1.0 cm線鋸截骨，去除個(gè)體化假體和周邊軟組織，觀察骨缺損區(qū)新骨形成情況，經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像分析，測量骨缺損區(qū)的骨密度（代表新骨密度）。將標(biāo)本置于雙能X線快速骨密度儀的掃描臺(tái)上（XR-46雙能X線快速全身骨密度診斷儀，NORLAND公司，美國），記錄缺損區(qū)新骨密度（g/cm2）。

1.3.3 最大抗壓力測試 行骨密度測試后，以標(biāo)本為中點(diǎn)施加載荷，電腦記錄新生骨最大破壞載荷即最大抗壓力值（N），代表新骨的抗壓強(qiáng)度，具體參考文獻(xiàn)[7]。

1.3.4 HE染色觀察 光鏡下觀察缺損區(qū)成成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，評(píng)估各組骨愈合效果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，重復(fù)測量設(shè)計(jì)資料的單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后一般情況 所有實(shí)驗(yàn)兔飲食及術(shù)后愈合良好（圖9），所有實(shí)驗(yàn)兔均進(jìn)入結(jié)果分析，無丟失。

2.2 骨密度檢測 三組標(biāo)本隨時(shí)間的延長骨密度逐漸增加，存在明顯的時(shí)間效應(yīng)。術(shù)后4周：三組骨密度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;術(shù)后12周：三組骨密度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），A組骨密度高于C組與B組（t=17.24，P=0.008;t=3.89，P=0.000），C組高于B組（t=13.35，P=0.000）;術(shù)后24周：A組與B組、B組與C組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.77，P=0.000;t=-12.14，P=0.000），A組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.62，P=0.060）。見表1。

2.3 最大抗壓力測試 三組術(shù)后標(biāo)本抗壓強(qiáng)度隨時(shí)間延長均呈上升趨勢，存在明顯的時(shí)間效應(yīng)。術(shù)后4周：三組最大抗壓力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;術(shù)后12周：三組最大抗壓力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;術(shù)后24周：三組最大抗壓力比較，A組高于B組，C組高于B組（t=4.26，P=0.005;t=4.44，P=0.005），A組與C組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.18，P=0.86）。見表2。

2.4 HE染色觀察 三組骨移植材料與骨斷端結(jié)合處，隨時(shí)間的延長，成骨細(xì)胞數(shù)量有不同程度增多，均有骨小梁出現(xiàn)，但排列分布不均，每組中可見編織骨向板層骨過度，但成骨速度不盡相同，A組、C組成骨效果相對(duì)B組明顯（圖10）。（1）術(shù)后4周：三組宿主骨與骨移植材料結(jié)合處見大量纖維組織，未見明顯骨組織。（2）術(shù)后12周：A組骨樣組織隱約可見編織骨向板層骨過度;B組大量成纖維細(xì)胞增生，可見部分骨小梁;C組明顯可見編織骨向板層骨過度。（3）術(shù)后24周：A組大量致密骨樣組織，可見成熟的板層骨形成;B組編織骨向板層骨過度，未見明顯骨陷窩結(jié)構(gòu);C組可見均勻致密的板層骨、大量骨髓腔形成，已連續(xù)性骨愈合。

注：（1）術(shù)后4周，圖A1、B1、C1三組均見成纖維細(xì)胞增生活躍，大量圓形和立方形成骨細(xì)胞。（2）術(shù)后12周，圖A2大量骨小梁形成，編織骨向板層骨過度;圖B2骨樣組織開始增多，部分骨小梁結(jié)構(gòu);圖C2編織骨向板層骨過度，大量成骨細(xì)胞包裹其中。（3）術(shù)后24周：圖A3成熟的板層骨形成，見哈弗氏系統(tǒng)形成;圖B3大量骨小梁形成，編織骨向板層骨過度;圖C3均勻致密的板層骨形成，大量骨髓腔形成。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)CHA鈣磷摩爾比為1.67，與天然骨接近，其中CaO/P2O5含量和CaO/P2O5比值與美國市場interpro-500和interpro-200相近;有學(xué)者認(rèn)為，最有利于成骨細(xì)胞滲透的內(nèi)部通道連接直徑要大于40 μm，而孔徑在150 μm時(shí)，能為骨組織的創(chuàng)建良好環(huán)境[8-9]。本實(shí)驗(yàn)材料的平均孔徑為250 μm，促進(jìn)了吸收生物因子及血管間的互動(dòng)，確保骨組織的有效生長。

信號(hào)分子（骨生長因子、骨誘導(dǎo)因子）是組織工程骨的三個(gè)關(guān)鍵要素之一。國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究證明BMP和rhBMP均能誘導(dǎo)骨再生，具有修復(fù)臨界骨缺損、促進(jìn)骨折愈合的特點(diǎn)，其中rhBMP-2和rhBMP-7具有很高的活性備受關(guān)注[10-11]。rhBMP-2能使未分化的間質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過趨化、增殖和分化，可明顯促進(jìn)骨缺損區(qū)的骨組織愈合。Lee等[12]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rhBMP-2具有很強(qiáng)的成骨能力，但BMP單純植入體內(nèi)，易被蛋白酶水解，喪失一定的活性。因此筆者通過CHA體外復(fù)合的方式充分發(fā)揮生物材料的引導(dǎo)和誘導(dǎo)機(jī)制，加速新骨的形成，原理與上述一致。

新生骨的力學(xué)強(qiáng)度是其功能重建的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，而骨力學(xué)強(qiáng)度可以通過測量BMD和最大抗壓力值來判定[13]。本研究結(jié)果顯示：隨時(shí)間延長，新骨組織逐漸增多，缺損區(qū)骨強(qiáng)度明顯提高，且植入C組高于B組，三組標(biāo)本骨密度、最大抗壓強(qiáng)度均隨時(shí)間延長明顯上升。因此本實(shí)驗(yàn)CHA、rhBMP-2組織工程材料成骨效果確切。然而目前，生物材料強(qiáng)度一般較低，以脆性材料居多，難以承受較大的載荷，如下頜骨大面積骨缺損的修復(fù)，且遠(yuǎn)期形態(tài)難以控制，因此金屬支架的支持成為必然的趨勢[14-15]。傳統(tǒng)的骨科重建植入物很難實(shí)現(xiàn)骨缺損的個(gè)體化精確修復(fù)，此外手工塑形勞動(dòng)強(qiáng)度大、時(shí)間長，不利于感染的控制[16-17]。本實(shí)驗(yàn)在三維重建基礎(chǔ)上，利用RP技術(shù)的鏡像原理制作單側(cè)下頜骨缺損的個(gè)體化鈦支架，高精度、效率及強(qiáng)度，大大簡化了手術(shù)操作[18-20]，為臨床頜骨缺損修復(fù)方法提供新的途徑。

本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新采用RP技術(shù)制作的個(gè)體化假體復(fù)合CHA、rhBMP-2修復(fù)下頜骨缺損，結(jié)合兩種修復(fù)方式的優(yōu)勢，既可以充分利用組織工程材料有高度仿生、微創(chuàng)安全及生物材料本身的優(yōu)越性能，又可以克服生物材料難以固定、強(qiáng)度不足、外形欠佳、體積受限等缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)生物性的“骨愈合”，達(dá)到外形與功能兼?zhèn)涞膶?shí)驗(yàn)效果，不失為一種有意義的嘗試。本實(shí)驗(yàn)中骨密度檢測、最大抗壓力測試、組織學(xué)觀察均顯示C組成骨效果優(yōu)于B組，24周時(shí)達(dá)到了自體骨愈合的“金標(biāo)準(zhǔn)”。說明個(gè)體化假體的加強(qiáng)并未影響組織工程骨的修復(fù)效果，相反其個(gè)體化的設(shè)計(jì)不僅達(dá)到形態(tài)上的完美效果，同時(shí)其鏤空的立體結(jié)構(gòu)，加速內(nèi)部新生骨的改建，刺激了移植骨材料與宿主骨的整合。

綜上所述，個(gè)體化鈦支架復(fù)合CHA/rhBMP-2修復(fù)兔下頜骨缺損，實(shí)現(xiàn)了生物性的“骨愈合”，兩者結(jié)合達(dá)到了個(gè)體化、彈性化、仿生化的修復(fù)效果，為今后的臨床應(yīng)用和推廣奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2020-02-05） （本文編輯：程旭然）