北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子活性及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的分析

郭 敏，李寒妹，王瑞寧，鄭曉寧，劉錚鑄，彭永東，鞏元芳*，李祥龍*

(1.河北科技師范學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院 河北省特色動(dòng)物種質(zhì)資源挖掘與創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066004；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河北 保定 071000)

狐皮，因其色澤艷麗、絨毛稠密豐厚、御寒力強(qiáng)，極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值。毛色是影響狐皮經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一個(gè)重要因素，其形成是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，與黑色素的合成和分布有關(guān)。黑色素的生成受多種基因調(diào)控，MITF-M是調(diào)控動(dòng)物毛色形成信號(hào)下游通路中的一個(gè)重要功能基因，可調(diào)控多種其他黑色素基因的轉(zhuǎn)錄(如：AIM、MART1/MLANA、SILV/PMEL17、TRPM1和TYR家族等)[1]，引起動(dòng)物毛色的多樣化。

MITF具有一個(gè)bHLHZip(螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈)結(jié)構(gòu)，可識(shí)別靶基因啟動(dòng)子區(qū)E-box和M-box，進(jìn)而啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄[2]。該基因至少存在9種不同啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，調(diào)控編碼多種蛋白質(zhì)異構(gòu)體[3]，其中MITF-M基因在黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞中特異表達(dá)[4]。楊玉靜等[5]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊MITF-M過(guò)表達(dá)會(huì)使黑素細(xì)胞TYR和TYRP-1的表達(dá)量增加，揭示黑素細(xì)胞中TYR和TYRP-1的表達(dá)可能受MITF-M基因的調(diào)控。鄭嫩珠等[6]發(fā)現(xiàn)MITF-M和TYR mRNA在各組織間的表達(dá)量與黑色素含量呈顯著正相關(guān)。此外，張建一等[7]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛MITF-M基因mRNA在心臟、腎臟和皮膚等眾多組織中，僅在皮膚中特異性表達(dá)，且在黑色被毛皮膚中的表達(dá)量顯著高于白色被毛皮膚(P<0.01)。以上研究提示MITF-M基因與動(dòng)物被毛顏色關(guān)系密切。

眾所周知，啟動(dòng)子是基因表達(dá)的指揮棒[8]，啟動(dòng)子的順式作用元件和反式作用因子對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起重要作用。目前，MITF-M基因作為調(diào)控狐貍毛色形成的相關(guān)研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此，研究北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子活性及其相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，可為進(jìn)一步深入探究該基因調(diào)控狐貍毛色的遺傳機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑北極狐組織樣品來(lái)自河北省秦皇島市昌黎縣金島育種場(chǎng)；LA Taq DNA Polymerase、pMD19-T Vector、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、T4DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司；2×TransStart FastPfu PCR SuperMix、TransStart Taq DNA Polymerase購(gòu)自北京全式金公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取抽提試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒DNA大量提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司；DPBSD、MEM培養(yǎng)基(高糖型)購(gòu)自Hyclone公司；限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ和Mlu Ⅰ、0.25%胰蛋白酶、Opti-MEM培養(yǎng)基Lipofectamine?2000Transfection Reagent(Lip2000脂質(zhì)體)、胎牛血清購(gòu)自Thermo Fisher Science公司；質(zhì)粒載體pGL3-Basic、pRL-TK、人腎上皮細(xì)胞系(293T)、人惡性黑色素瘤細(xì)胞系(A375)均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 北極狐MITF-M基因核心啟動(dòng)子區(qū)的確定

1.2.1啟動(dòng)子的克隆及序列分析 參照文獻(xiàn)[9]所得北極狐MITF-M基因核苷酸序列以及該基因啟動(dòng)子區(qū)和調(diào)控元件的預(yù)測(cè)結(jié)果，在編碼區(qū)上游設(shè)計(jì)擴(kuò)增6個(gè)缺失片段的引物(表1,圖1)。通過(guò)NEB cutter?(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)在線分析限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，片段2 279 F、1 738 F、1 313 F、1 040 F、524 F和236 F上游引物引入酶切位點(diǎn)KpnⅠ(GGTACC)及保護(hù)堿基GG，下游引物引入酶切位點(diǎn)MluⅠ(ACGCGT)及保護(hù)堿基CC。

圖1 北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子缺失片段示意圖

PCR擴(kuò)增體系為50 μL：基因組DNA 1 μL，10×PCR Buffer(Mg2+Plus)5 μL，dNTP Mix(2.5 mmol/L)8 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，LA Taq DNA聚合酶(5 U/ μL)0.5 μL，滅菌ddH2O 33.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，退火30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)(退火溫度和延伸時(shí)間見(jiàn)表1)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 MITF-M基因啟動(dòng)子區(qū)缺失片段和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)引物

1.2.2缺失片段載體構(gòu)建及鑒定 將缺失片段X 的PCR產(chǎn)物克隆至載體pMD19-T中，再將重組載體(pMD19-X)轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鑒定為陽(yáng)性的菌液PCR樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。對(duì)重組克隆載體pMD19-X及pGL3-Baisc載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切，將回收產(chǎn)物進(jìn)行連接構(gòu)建pGL3-Baisc-X重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)菌液PCR、測(cè)序和雙酶切3種方法依次鑒定重組載體，對(duì)陽(yáng)性重組載體進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒的提取。

1.2.3突變載體的構(gòu)建及鑒定 以pGL3-Basic-524質(zhì)粒為模板，分別以引物524F和Mut-CREB-1-Rm、Mut-CREB-1-Fm和R、524F和Mut-Sp1-2-Rm、Mut-Sp1-2-Fm和R、524F和Mut-Sp1-3-Rm、Mut-Sp1-3-Fm和R(表1)通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)擴(kuò)增上、下游引物。重疊延伸PCR擴(kuò)增體系為40 μL：野生型質(zhì)粒模板2 μL，2×TransStart FastPfu Super Mix 20 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，滅菌ddH2O 16 μL。將擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收并等比例混合，用此混合物為模板，以引物524F和R擴(kuò)增突變載體全長(zhǎng)片段。PCR擴(kuò)增體系為50 μL：混合物模板2.5 μL，10×TransStart Taq Buffer 5 μL，TransStart Taq DNA Polymerase 0.5 μL，dNTP Mix(10 mmol/L)1 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，滅菌ddH2O 39 μL。重疊延伸和全長(zhǎng)片段PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性 30 s，退火30 s，72℃延伸共35個(gè)循環(huán)(退火溫度和延伸時(shí)間見(jiàn)表1)；72℃最終延伸10 min，4℃保存。通過(guò)菌液PCR和測(cè)序鑒定突變載體，并提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒。

1.2.4細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)293T和A375細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞接種于24孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)覆蓋率至70%～80%時(shí)，分別將重組報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-Baisc-X(293T：0.95 μg；A375：0.9 μg)、內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK(293T：0.05 μg；A375：0.1 μg)和lip2000脂質(zhì)體2.0 μL加入至50 μL Opti-MEM培養(yǎng)基中得到質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合物，然后轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。生物學(xué)重復(fù)至少3次，每次3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.5雙熒光素酶活性鑒定 根據(jù)雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行啟動(dòng)子活性檢測(cè)，用DPBS洗細(xì)胞2次，每孔加入150 μL細(xì)胞裂解液，振蕩30 min 至細(xì)胞完全裂解，向1.5 mL EP管中添加10 μL 裂解好的細(xì)胞待測(cè)樣品和20 μL LAR Ⅱ試劑，通過(guò)發(fā)光儀檢測(cè)pGL3質(zhì)粒中螢火蟲熒光素酶活性，檢測(cè)10 s時(shí)的化學(xué)發(fā)光值，讀值為F，隨后加入20 μL Stop&Glo試劑，混勻后檢測(cè)pRL-TK質(zhì)粒中海腎熒光素酶活性，同樣檢測(cè)10 s時(shí)的化學(xué)發(fā)光值，讀值為R。啟動(dòng)子相對(duì)活性值=F/R，即螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.2.6統(tǒng)計(jì)分析 所有樣品在轉(zhuǎn)染293T和A375細(xì)胞株時(shí)進(jìn)行至少3次生物學(xué)試驗(yàn)重復(fù)，將試驗(yàn)所得活性值數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化并利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同檢測(cè)片段的啟動(dòng)子活性數(shù)據(jù)用單因素ANOVA進(jìn)行分析(LSD和Duncan法)，P<0.05 表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析通過(guò)在線軟件WWW Signal SCAN、Cluster、Nsite、JASPAR和AliBaba 2.1等預(yù)測(cè)北極狐MITF-M基因核心啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，詳細(xì)情況見(jiàn)表2。

表2 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件

1.4 核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變體活性分析將轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變載體轉(zhuǎn)染至A375和293T細(xì)胞，用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果與野生型對(duì)比分析轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變前后啟動(dòng)子活性的變化。

2 結(jié)果

2.1 北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子缺失片段的擴(kuò)增以北極狐基因組DNA為模板，利用所設(shè)計(jì)引物對(duì)MITF-M基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行缺失片段的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，與預(yù)期片段大小(2 279，1 738，1 313，1 040，524和236 bp)基本一致(圖2)。隨后將擴(kuò)增所得各缺失片段連接到pMD19-T載體上。

圖2 北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子區(qū)缺失片段PCR擴(kuò)增結(jié)果 M1.DL2000 DNA Marker;M2.DL5000 DNA Marker;1～6.引物為2279F、1738F、1313F、1040F、524F和236F的擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子熒光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建使用T4DNA連接酶對(duì)雙酶切后回收的片段X和雙酶切后pGL3-Basic質(zhì)粒進(jìn)行連接(pGL3-basic-X)，將構(gòu)建的MITF-M基因啟動(dòng)子熒光素酶表達(dá)載體進(jìn)行菌液PCR(圖3)、雙酶切鑒定(圖4)和測(cè)序，對(duì)其依次進(jìn)行鑒定，結(jié)果與預(yù)期基本一致，表明北極狐MITF-M基因重組表達(dá)載體pGL3-basic-X構(gòu)建成功。

圖3 北極狐MITF-M基因重組表達(dá)載體pGL3-basic-X菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果 M1.DL2000 DNA Marker;M2.DL5000 DNA Marker;1～6.引物為2279F、1738F、1313F、1040F、524F和236F重組表達(dá)載體pGL3-basic-X菌液PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4 北極狐MITF-M基因重組表達(dá)載體pGL3-basic-X雙酶切鑒定結(jié)果 M1.DL5000 DNA Marker;M2.DL10000 DNA Marker;1～6.分別為重組表達(dá)載體pGL3-basic-X雙酶切鑒定產(chǎn)物

2.3 北極狐MITF-M基因5′端調(diào)控序列的活性分析利用啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體(pGL3-Basic-X)無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(A375和293T)，測(cè)定MITF-M基因雙熒光素酶活性(圖5)。結(jié)果顯示，6個(gè)啟動(dòng)子報(bào)告基因無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2種細(xì)胞的活性值高低趨勢(shì)一致，A375細(xì)胞活性值均低于293T細(xì)胞；293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示6個(gè)啟動(dòng)子報(bào)告基因的活性與pGL3-basic對(duì)照組比較均差異極顯著(P<0.01)；A375細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)果表明除片段1 040 bp(-1 026 bp/+13 bp)和236 bp(-222 bp/+13 bp)啟動(dòng)子活性與pGL3-basic對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異外(P>0.05)，2 279 bp(-2 265 bp/+13 bp),1 738 bp(-1 724 bp/+13 bp),1 313 bp(-1 299 bp/+13 bp)和524 bp(-510 bp/+13 bp)4個(gè)報(bào)告基因活性值與pGL3-basic對(duì)照組相比均呈極顯著性差異(P<0.01)?？v觀全圖發(fā)現(xiàn)片段524 bp(-510 bp/+13 bp)區(qū)域在2種細(xì)胞間的活性值均最高，且與其他5個(gè)片段活性相比，均呈極顯著性差異(P<0.01)，提示此處MITF-M基因的啟動(dòng)表達(dá)作用最強(qiáng)。當(dāng)啟動(dòng)子片段縮短至236 bp(-222 bp/+13 bp)時(shí)，熒光素酶相對(duì)活性值明顯下降，推測(cè)-510 bp/-222 bp可能是北極狐MITF-M基因的核心啟動(dòng)子區(qū)。

圖5 北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性值 注：大小寫字母分別表示在P=0.01和P=0.05 水平的顯著性

2.4 北極狐MITF-M基因核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的生物信息學(xué)分析通過(guò)在線軟件WWW Signal SCAN、Cluster等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)MITF-M基因核心啟動(dòng)子區(qū)(-510 bp/-222 bp)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)(表3)，為避免出現(xiàn)假陽(yáng)性，取至少3個(gè)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果。由表3可知，該區(qū)域可能存在CREB(-312 bp/-319 bp)，Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

表3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.5 北極狐MITF-M基因核心啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變體活性分析圖6是以pGL3-524為模板預(yù)測(cè)得到的3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)CREB(-312 bp/-319 bp)，Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)點(diǎn)突變圖，以此構(gòu)建了突變體(圖7)，突變前后序列情況見(jiàn)表4，分別轉(zhuǎn)染至A375和293T細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果(圖8)表明，-312 bp/-319 bp，-295 bp/-307 bp和-249 bp/-262 bp位置CREB、Sp1和Sp1轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的活性與野生型524 bp(-510 bp/+13 bp)均呈極顯著性差異(P<0.01)，表明以上3個(gè)區(qū)域的突變使北極狐MITF-M基因的啟動(dòng)子活性上升。

表4 MITF-M基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變前后的序列情況

圖6 北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)突變圖 注：■表示轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；表示突變

圖7 北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子突變體的克隆 M.DL2000 DNA Marker;1,2.mut-CREB-1上、下游片段;3,4.mut-Sp1-2上、下游片段;5,6.mut-Sp1-3上、下游片段;7～9.mut-Sp1-1、mut-Sp1-2和mut-Sp1-3全長(zhǎng)片段

圖8 北極狐MITF-M基因突變啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性值 注：大小寫字母分別表示在P=0.01和P=0.05水平的顯著性

3 討論

MITF-M基因?qū)τ趧?dòng)物的毛色形成是必不可少的[10]，狐皮的毛色作為重要的質(zhì)量性狀直接影響其品質(zhì)及價(jià)格[11]。因此，MITF-M基因啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究對(duì)于揭示北極狐被毛顏色的分子遺傳機(jī)制具有十分重要的意義。啟動(dòng)子的克隆方式大致分為基因組文庫(kù)篩選法、利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子和基于PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子法等，這些技術(shù)都已得到廣泛的應(yīng)用[12]。相關(guān)研究顯示，克隆片段若僅含有TSS上游區(qū)域易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，但選擇包含TSS、ATG及部分CDS區(qū)可提高陽(yáng)性率[13]。

本試驗(yàn)利用PCR和熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)等確定了北極狐MITF-M基因的核心啟動(dòng)子區(qū)在-510 bp/-222 bp區(qū)間，結(jié)果與POINDEXTER等[14]的研究結(jié)果基本一致。

真核動(dòng)物功能基因啟動(dòng)子中多種順式作用元件如CAAT框(GGCTCAATCT)、TATA框(TAT-AATAAT)和GC框(GTGGGCGGGGCAAT)等參與基因的轉(zhuǎn)錄。GC框主要分布在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前-128 bp/-23 bp區(qū)域內(nèi)，一般位于CAAT框的兩側(cè)和TATA框上游，能夠結(jié)合調(diào)節(jié)特異性蛋白Sp1[15]，Sp1已被證實(shí)是一種能影響轉(zhuǎn)錄起始的反式激活子[16]。郭敏等[9]發(fā)現(xiàn)北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子區(qū)-302 bp處存在GC框，本試驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)該區(qū)域-295 bp/-307 bp和-249 bp/-262 bp位置各存在1個(gè)Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，提示GC框(-302 bp)可能與Sp1(-295 bp/-307 bp)蛋白結(jié)合調(diào)控北極狐MITF-M基因的轉(zhuǎn)錄。通過(guò)對(duì)這2個(gè)Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變處理，發(fā)現(xiàn)北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子的活性顯著性上升，推測(cè)Sp1對(duì)北極狐MITF-M基因的轉(zhuǎn)錄激活起一定調(diào)控作用。柳云霞等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Sp1抑制小鼠MEPE基因的轉(zhuǎn)錄活性，且抑制MEPE基因的表達(dá)水平。而田宏攀[18]在研究乳腺癌中DNA甲基化對(duì)SP1調(diào)控FOXF2轉(zhuǎn)錄時(shí)，發(fā)現(xiàn)SP1可以增強(qiáng)FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，SP1轉(zhuǎn)錄可促進(jìn)FOXF2啟動(dòng)子低甲基化的乳腺癌細(xì)胞中FOXF2的表達(dá)，但DNA甲基化后SP1可抑制FOXF2啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。綜合柳云霞等[17]和田宏攀[18]的研究結(jié)果，推測(cè)本試驗(yàn)的2個(gè)Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)可能對(duì)北極狐MITF-M基因的轉(zhuǎn)錄激活起負(fù)調(diào)控作用；也可能是2個(gè)Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)對(duì)北極狐MITF-M基因的轉(zhuǎn)錄激活起正調(diào)控作用，只是由于DNA發(fā)生甲基化，抑制了其轉(zhuǎn)錄激活MITF-M啟動(dòng)子的活性，但當(dāng)甲基化的Sp1被點(diǎn)突變后，抑制作用被破壞，使得其對(duì)北極狐MITF-M基因轉(zhuǎn)錄激活的正調(diào)控作用發(fā)揮出來(lái)，啟動(dòng)子活性上升。

有研究指出，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)CREB和CRE結(jié)合能提高下游基因的轉(zhuǎn)錄活性，部分基因轉(zhuǎn)錄水平可提高20倍，但若CRE缺失則會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性下降[19-20]。本試驗(yàn)在北極狐MITF-M基因的核心啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)(-312 bp/-319 bp)篩查到CREB，前期研究在-317 bp和-310 bp處分別篩查到CRE[9]，提示CREB(-312 bp/-319 bp)可能與CREs(-317 bp，-310 bp)結(jié)合調(diào)控北極狐MITF-M基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)CREB(-312 bp/-319 bp)點(diǎn)突變處理后，北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子的活性顯著性上升。肖慧[21]研究發(fā)現(xiàn)，CREB可通過(guò)結(jié)合在TNFAIP1基因近端啟動(dòng)子上的CREs位點(diǎn)負(fù)調(diào)控TNFAIP1基因的表達(dá)，CREs元件缺失突變后對(duì)TNFAIP1基因啟動(dòng)子活性的抑制作用減弱。湯必奎[22]研究發(fā)現(xiàn)IL-6基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化程度影響CREB和IL-6的結(jié)合，DNA甲基化水平低時(shí)，二者結(jié)合能力增強(qiáng)，CREB和基因活性相關(guān)；DNA甲基化水平高時(shí)，二者結(jié)合能力減弱，CREB和基因沉默相關(guān)。綜上，推測(cè)本試驗(yàn)的CREB可能和CREs結(jié)合對(duì)北極狐MITF-M基因的轉(zhuǎn)錄激活起負(fù)調(diào)控作用。但也可能是CREB和CREs結(jié)合對(duì)北極狐MITF-M基因的轉(zhuǎn)錄激活起正調(diào)控作用。當(dāng)北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化時(shí)抑制了CREB轉(zhuǎn)錄激活MITF-M啟動(dòng)子的活性，但當(dāng)甲基化的CREB被點(diǎn)突變后，破壞了這種抑制作用，增強(qiáng)了CREB和MITF-M的結(jié)合，MITF-M啟動(dòng)子活性顯著上升。為了確證CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)對(duì)北極狐MITF-M基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的具體功能，后期需對(duì)以上3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行DNA甲基化檢驗(yàn)，進(jìn)而用CHIP和EMSA等手段進(jìn)一步分析驗(yàn)證。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了北極狐MITF-M基因啟動(dòng)子區(qū)不同長(zhǎng)度缺失片段熒光素酶表達(dá)載體，確定了-510 bp/-222 bp區(qū)是北極狐MITF-M基因的核心啟動(dòng)子區(qū)，該區(qū)域存在CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，它們被點(diǎn)突變后，能使北極狐MITF-M基因的啟動(dòng)子活性上升，說(shuō)明這3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)對(duì)北極狐MITF-M基因的轉(zhuǎn)錄激活起到一定的調(diào)控作用。