Chinese1弓形蟲對雄性小鼠生殖系統(tǒng)的病理損傷

姜 楠，蘇瑞景，楊玉榮

(河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002)

弓形蟲是一種細胞內(nèi)寄生原蟲，廣泛感染多種恒溫動物，弓形蟲病是一種重要的人畜共患病[1]。免疫力正常的動物和人群感染弓形蟲通常沒有明顯的臨床變化，但常威脅免疫力低下個體的健康，孕婦和母畜感染弓形蟲可引起不孕、流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸形胎等[1-3]。宿主感染弓形蟲時，弓形蟲可在多器官的細胞內(nèi)分裂、繁殖，出現(xiàn)器官的結構和功能異常，包括生殖系統(tǒng)[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)患弓形蟲病雄性動物可通過性傳播將弓形蟲傳染給雌性和下一代，已在豬[6]、山羊[7,3]、綿羊[2,8]、狗[9]、兔[10]和人[11]的精液或生殖器官中檢測到弓形蟲，影響雄性動物的生育健康，出現(xiàn)不育，但關于弓形蟲對雄性生殖系統(tǒng)的損傷特點，蟲體的分布規(guī)律，影響不育的程度等少見報道。

從我國人和動物分離到的弓形蟲蟲株分型顯示，80%以上的蟲株基因型為ToxoDB#9，也稱為Chinese1[12]，但關于其對生殖系統(tǒng)損傷特點的研究少見報道。YANG等[13]從綿羊心臟分離到2株活的弓形蟲蟲株TgSheepCHn1和TgSheepCHn2，基因型均為Chinese1。人可因食入未煮熟的含有弓形蟲包囊的羊肉而感染弓形蟲。因人類弓形蟲病患者生殖系統(tǒng)樣品不易獲得，本試驗選用TgSheepCHn1株弓形蟲感染雄性BALB/c小鼠復制急性和慢性(磺胺嘧啶處理)弓形蟲病感染模型，分別在感染后2，4，6，8，10 d(days post infection,DPI)和6周，采集小鼠的血清、生殖器官和副性腺，研究弓形蟲的分布，以及弓形蟲對睪酮含量和生殖系統(tǒng)形態(tài)結構的影響，推測弓形蟲對雄性動物和男性生殖功能的影響，為進一步了解我國弓形蟲分離株的致病特性提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 弓形蟲蟲株和抗體Chinese1(TgSheepCHn1，ToxoDB#9)弓形蟲蟲株分離自河南省焦作市綿羊心肌[13]，蟲株經(jīng)Vero細胞培養(yǎng)獲得大量速殖子，采用一次性血球計數(shù)板計數(shù)至104個速殖子/mL。兔抗弓形蟲多克隆抗體、弓形蟲抗原均由美國農(nóng)業(yè)部Dubey試驗室饋贈;小鼠Specific HRP/DAB(ABC)Detection IHC kit 購自Abcam公司(貨號：ab64264)。

1.2 實驗動物及處理雄性BALB/c小鼠60只，≥45日齡，體質量≥25 g，弓形蟲檢測陰性，購自河南省實驗動物中心。小鼠隨機分為2組(感染組和對照組)，每組30只小鼠，自由采食清潔級全營養(yǎng)顆粒飼料，飲用高壓滅菌水。感染組小鼠腹腔注射104個TgSheepCHn1弓形蟲速殖子，對照組小鼠腹腔注射無菌生理鹽水，接種量均為1 mL/只。感染組小鼠隨機抽取5只單獨一籠喂養(yǎng)，3 DPI飲水給予磺胺嘧啶1 g/L飲水持續(xù)至10 DPI，復制弓形蟲感染慢性模型。每天觀察小鼠臨床表現(xiàn)并記錄。2組小鼠分別在2，4，6，8，10 DPI和 6周(飲水給予磺胺嘧啶)選取5只小鼠，面靜脈采血并分離血清，10%中性福爾馬林溶液固定小鼠的睪丸、附睪、精囊腺、尿道球腺、凝固腺和輸精管。對感染后死亡小鼠及剖檢小鼠的肺臟、胸水、腹水、腸系膜淋巴結和大腦涂片鏡檢是否出現(xiàn)弓形蟲。

1.3 試驗方法采用化學發(fā)光法檢測小鼠血清睪酮含量。生殖器官和副性腺運用常規(guī)病理學技術制作連續(xù)石蠟切片，采用蘇木素與伊紅對比染色法(HE)觀察病理損傷，免疫組織化學(IHC)染色分析弓形蟲的分布。

1.4 圖像采集與數(shù)據(jù)統(tǒng)計選取全部小鼠生殖器官和副性腺制作的HE 和IHC染色的切片，采用Olympus BX43顯微鏡觀察和隨機攝片，每個組織器官鏡下計數(shù)橫斷面內(nèi)全部弓形蟲陽性蟲體數(shù)量，采用軟件Graph Pad Prism 5.0 (Graph pad Software Inc.,San Diego,CA,USA)對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 BALB/c小鼠感染TgSheepCHn1弓形蟲后的臨床表現(xiàn)小鼠腹腔接種104個TgSheepCHn1弓形蟲速殖子后，3 DPI出現(xiàn)被毛逆立、弓背蜷縮、呼吸窘迫和食欲降低等臨床表現(xiàn)，感染組小鼠在接種后8 DPI出現(xiàn)死亡，其中8，10 DPI小鼠的自然死亡率為40%(2/5)和80%(4/5)，對照組小鼠未見明顯異常。病理剖檢，感染組小鼠在接種后4 DPI，可觀察到腹液和腸系膜淋巴結，隨感染時間延長，腹液量增多，淋巴結呈灰白色、腫大；脾臟明顯腫大、顏色暗紅；肺臟淤血腫大、暗紅色；腹液黏稠、黃白色；腸系膜淋巴結和腹液涂片可見大量弓形蟲速殖子，陽性率為100%。感染組小鼠的生殖器官和副性腺，未見明顯眼觀病理變化。飲水給予磺胺嘧啶，存活至6周的小鼠，剖檢未見明顯病理變化(表1)。

表1 雄性BALB/c小鼠感染TgSheepCHn1弓形蟲后的病理變化

2.2 小鼠感染TgSheepCHn1弓形蟲后生殖器官的病理組織損傷及弓形蟲分布小鼠感染TgSheepHn1弓形蟲后2，4 DPI，睪丸、附睪、精囊腺、尿道球腺、凝固腺和輸精管的組織結構清晰、完整，細胞數(shù)量正常，沒有明顯的病理損傷，僅在被膜疏松結締組織內(nèi)可觀察到少量弓形蟲。

6～10 DPI，各器官的病理損傷逐漸增加，睪丸表現(xiàn)為曲細精管中生精細胞層數(shù)和數(shù)目減少，排列紊亂，曲細精管內(nèi)空隙明顯增大，僅見精原細胞層，不見次級精母細胞和精子層，呈空泡樣變化，精子數(shù)目減少(圖1A，B)，被膜和間質可見弓形蟲。附睪管飽滿，上皮細胞排列整齊，管腔可見精子，但數(shù)量少于對照組，附睪間質疏松、水腫，血管充血，含少量弓形蟲(圖1C，D)。附睪被膜疏松結締組織含大量弓形蟲，蟲體呈彌散性分布，局部組織壞死，IHC顯示為弓形蟲抗原陽性(圖1E，F(xiàn))。

精囊腺上皮脫落于管腔，固有層可見弓形蟲，腔內(nèi)分泌物減少，染色不均勻(圖1G，H)，被膜疏松結締組織內(nèi)血管充血，周圍浸潤大量巨噬細胞，IHC顯示浸潤的巨噬細胞含多量弓形蟲(圖1I，J)。凝固腺上皮細胞脫落于管腔，間質和被膜含多量弓形蟲(圖1K，L)。尿道球腺上皮細胞水腫，部分上皮細胞脫落于管腔，被膜含多量弓形蟲(圖1M，N)。輸精管上皮細胞腫脹，肌層細胞壞死、淡染，漿膜層炎癥反應嚴重，表現(xiàn)為血管充血，浸潤大量淋巴細胞、巨噬細胞和少量嗜中性粒細胞，炎癥中心可見多量弓形蟲聚集呈簇狀分布，IHC染色顯示為弓形蟲抗原陽性(圖1O，P)。

圖1 雄性BALB/c小鼠感染弓形蟲后生殖系統(tǒng)的病理損傷和弓形蟲分布(感染后10 d)(標尺=50 μm) A.弓形蟲感染組小鼠睪丸，HE；B.對照組小鼠睪丸，HE；C.弓形蟲感染組小鼠附睪，IHC；D.C圖局部放大；E.弓形蟲感染組小鼠附睪被膜，HE；F.弓形蟲感染組小鼠附睪被膜，IHC；G.弓形蟲感染組小鼠精囊腺，HE；H.弓形蟲感染組小鼠精囊腺，IHC；I.弓形蟲感染組小鼠精囊腺被膜，HE；J.弓形蟲感染組小鼠精囊腺被膜，IHC；K.弓形蟲感染組小鼠凝固腺，HE；L.弓形蟲感染組小鼠凝固腺，IHC；M.弓形蟲感染組小鼠尿道球腺，HE；N.M圖局部放大；O.弓形蟲感染組小鼠輸精管漿膜層，HE；P.弓形蟲感染組小鼠輸精管漿膜層，IHC

慢性弓形蟲感染期(6周)，睪丸、附睪、精囊腺、尿道球腺、凝固腺和輸精管的組織結構清晰、完整，細胞數(shù)量正常，未見明顯的病理損傷，被膜、實質和間質未見蟲體。

弓形蟲感染后，小鼠生殖系統(tǒng)的病理損傷情況表現(xiàn)為副性腺>生殖器官：精囊腺>凝固腺>尿道球腺>輸精管>睪丸>附睪。弓形蟲分布規(guī)律表現(xiàn)為各臟器均是由外膜到中心逐漸減少，弓形蟲數(shù)量表現(xiàn)為附睪>精囊腺>凝固腺>尿道球腺>睪丸>輸精管(表2)。弓形蟲侵入數(shù)量，2，4 DPI僅見少量蟲體，急性感染期隨感染時間延長，蟲體數(shù)量逐漸增多(6 DPI后，P<0.05)，其中附睪和精囊腺表現(xiàn)最為顯著(P<0.05)(表2，圖2)。弓形蟲感染后，炎癥反應主要表現(xiàn)為間質血管充血和巨噬細胞的浸潤。

表2 雄性BALB/c小鼠感染弓形蟲后侵入生殖系統(tǒng)的弓形蟲數(shù)量(x±sx) 個

2.3 小鼠感染TgSheepCHn1弓形蟲后血清睪酮含量變化分別在弓形蟲感染后2，4，6，8，10 DPI和6周采集小鼠血清，檢測睪酮含量的動態(tài)變化，結果見圖2。弓形蟲感染后，小鼠睪酮含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，8 DPI后，感染組小鼠的血清睪酮含量低于對照組小鼠(P>0.05)。與對照組小鼠血清睪酮含量比較，僅在4 DPI，弓形蟲感染誘導小鼠睪酮含量明顯升高(P<0.05)，其他感染時間均未見明顯差異(P>0.05)。

圖2 雄性BALB/c小鼠感染弓形蟲后侵入生殖系統(tǒng)的弓形蟲總數(shù)量(A)和血清睪酮含量變化(B) *.P<0.05

3 討論

弓形蟲以速殖子、包囊和卵囊的形式存在于自然界、人和動物宿主體內(nèi)，其傳播包括水平傳播和垂直傳播[1]。水平傳播主要包括食入被卵囊污染的水果、蔬菜和水，食入含有包囊的肉品或動物內(nèi)臟，速殖子經(jīng)輸血傳播，食入含有速殖子的乳汁或奶制品。垂直傳播指速殖子經(jīng)胎盤或精液傳遞給下一代，引起不育、流產(chǎn)、新生動物發(fā)育異常等[1]。本試驗中，從雄性BALB/c小鼠感染TgSheepCHn1弓形蟲后的臨床表現(xiàn)、病理剖檢和顯微鏡檢查結果，可以確定感染組小鼠全部成功感染弓形蟲，且8，10 DPI死亡小鼠是因弓形蟲感染而引起的。

本試驗發(fā)現(xiàn)，雄性小鼠感染TgSheepCHn1弓形蟲后，血清睪酮含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，8 DPI 后，感染組小鼠的血清睪酮含量低于對照組小鼠。睪酮是由睪丸間質細胞受黃體生成素刺激后合成和分泌的，其主要作用是維持精子發(fā)生的微環(huán)境，促進精子發(fā)生和生殖器官的發(fā)育。弓形蟲感染雄性小鼠，可能會影響下丘腦-垂體-睪丸軸激素分泌調控過程，影響睪酮分泌，進而影響精子的生成。關于4 DPI睪酮含量增多的原因，推測可能是弓形蟲感染初期，睪酮發(fā)生了代償性反應，弓形蟲感染促進了睪丸間質細胞分泌睪酮，但還需要進一步研究。有關于弓形蟲對人和動物睪酮含量影響的報道，總體觀點認為弓形蟲僅暫時性調節(jié)睪酮表達水平，如急性弓形蟲感染誘導大鼠和男性患者血清睪酮含量暫時性的減少[14-16]，慢性弓形蟲感染誘導男性睪酮含量表達減少[17]，慢性弓形蟲感染升高男性和女性睪酮含量[18]。

雄性小鼠感染TgSheepCHn1弓形蟲后，睪丸曲細精管細胞層數(shù)減少，精子數(shù)目減少；附睪內(nèi)成熟精子數(shù)量減少；精囊腺上皮細胞壞死、脫落，分泌物質明顯減少。尿道球腺、凝固腺和輸精管上皮水腫、壞死。6 DPI后，雄性生殖器官和副性腺被膜疏松結締組織和間質浸潤大量弓形蟲蟲體。這些結果表明，急性弓形蟲感染可破壞睪丸、附睪和副性腺的組織結構，減少成熟精子數(shù)量和精子保護液，弓形蟲感染慢性期對雄性生殖系統(tǒng)未產(chǎn)生明顯病理損傷，炎癥反應輕微，說明弓形蟲可在一定程度抑制免疫反應。睪丸具有產(chǎn)生精子和分泌雄性激素的功能，附睪具有儲存和促使精子成熟，分泌液體供給精子營養(yǎng)的作用。精囊腺分泌的果糖可為精子提供營養(yǎng)物質，維持精子活力和染色質穩(wěn)定性。從形態(tài)結構推測，急性弓形蟲感染可影響雄性小鼠的繁殖功能。本試驗與ABDOLI等[14]的結果一致。弓形蟲感染大鼠，可暫時性影響雄性生殖系統(tǒng)的形態(tài)結構、分泌的激素量和功能。周永華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠感染弓形蟲后，睪丸有明顯的病理損傷(曲細精管上皮層數(shù)減少)，交配后產(chǎn)仔數(shù)量明顯減少。弓形蟲可入侵男性睪丸、附睪，出現(xiàn)疼痛和腫塊，引發(fā)睪丸弓形蟲病[11]。感染TgSheepCHn1弓形蟲急性期死亡小鼠的生殖系統(tǒng)的弓形蟲分布較多，該蟲株具有潛在的嗜生殖系統(tǒng)能力[4]，但關于弓形蟲嗜生殖系統(tǒng)的原因尚未見報道。

本試驗還發(fā)現(xiàn)，急性弓形蟲感染小鼠，生殖系統(tǒng)被膜抗原分布量高，推測與腹腔接種弓形蟲有關，速殖子通過各臟器被膜的疏松結締組織侵入各器官。副性腺的病理損傷嚴重于生殖器官這一現(xiàn)象還未見報道，推測與弓形蟲在長期進化過程中，逃避免疫監(jiān)控，成功進行垂直傳播有關。在研究綿羊分離株Chinese1(TgSheepCHn1)型弓形蟲對雄性小鼠生殖系統(tǒng)病理損傷以及抗原分布過程中，發(fā)現(xiàn)的這些現(xiàn)象還需進一步深入探討。本試驗為我國弓形蟲分離株對生殖系統(tǒng)的病理損傷及蟲體分布特點研究提供參考依據(jù)。