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    高濃度HBsAg檢測化學發(fā)光微粒子免疫分析法的建立及性能評價

    2020-11-06 10:40:54張志平彭道榮宋瀏偉葛勝祥郝曉柯劉家云
    檢驗醫(yī)學 2020年10期
    關鍵詞:稀釋液微粒試劑

    劉 楊, 張志平, 彭道榮, 宋瀏偉, 葛勝祥, 郝曉柯, 劉家云

    (空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院,陜西 西安 710032)

    乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的外膜蛋白,主要用于HBV感染的篩查[1]。血清HBsAg定量檢測已成為臨床抗病毒治療療效監(jiān)測的重要指標。化學發(fā)光微粒子免疫分析法(chemiluminescent microparticle immunoassay,CMIA)是一種高特異性、高靈敏度、重復性好的檢測方法,無放射性污染,可快速檢測血清中的小分子物質(zhì)及腫瘤標志物等[2-3]。目前,我國臨床實驗室廣泛使用的是進口化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)。由于絕大部分慢性乙型肝炎患者血清HBsAg水平較高,目前臨床常用的檢測系統(tǒng)需對樣本先進行稀釋,然后再檢測,不僅降低了工作效率,也加大了檢測成本。為此,本研究擬建立定量檢測中、高值血清HBsAg的CMIA,并對其進行初步的性能評價。

    1 材料和方法

    1.1 研究對象

    選取2014年12月—2015年12月空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院就診的HBV感染患者268例,其中男135例、女133例,年齡21~67歲,無甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)、戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)、梅毒螺旋體(Treponema pallidum,TP)、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)等合并感染。選取同期空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院進行健康體檢的表觀健康者146名,其中男75名、女71名,年齡23~74歲。本研究所用的血清樣本均為常規(guī)檢測后的剩余血清,-20 ℃保存待檢。

    1.2 儀器和試劑

    重組HBsAg、羊抗HBsAg多克隆抗體Ab1和7株抗-HBsAg小鼠單克隆抗體(Ab2~Ab8)均購自廈門萬泰滄海生物技術有限公司,hepatitis E virus(HEV),human immunodeficiency virus(HIV),human T-lymphotropic virus(HTLV),cytomegalovirus(CMV)and Epstein-Barr virus(EBV)positive samples did not cross-react with this assay. The prepared reagent could be stable for 6 d at 37 ℃,it could be stable for 4 weeks after opening lid at 2-8 ℃,and it could be stable for 6 months when stored in a sealed container at 2-8 ℃. The correlation and consistency between self-established CMIA and electrochemiluminescence method were good(r=0.978,P<0.001).ConclusionsThe self-established CMIA has a wide linear range for determining HBsAg,high concentration samples can be directly determined without dilution,and the determination performance is good,which has certain clinical application prospects.

    Key words:Hepatitis B surface antigen;Hepatitis B virus;Chemiluminescent microparticle immunoassay;Performance evaluation純度均>90%。HBsAg突變株WT、G119R、P120T、C124Y、I126S、Q129R、S136P、C139R、T140I、P144A、G145A、G145R、M204U、M204I購自廈門大學國家傳染病與疫苗工程技術研究中心。磁微粒(直徑約3 μm,微粒表面為羧基修飾)購自上海立馳高化工有限公司。碳二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,EDC]和N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxy succinimide,NHS)購自美國Sigma公司。Caris 200全自動化學發(fā)光免疫分析儀(廈門優(yōu)邁克醫(yī)學儀器有限公司),cobas e601全自動電化學發(fā)光免疫分析儀(瑞士羅氏公司)及配套HBsAg試劑盒(電化學發(fā)光法)。

    1.3 自建CMIA試劑的制備

    自建CMIA主要有2種試劑,一種是磁微粒與鼠抗-HBsAg單克隆抗體偶聯(lián)制備的MB試劑,磁微粒與抗體的化學偶聯(lián)通過EDC和NHS兩者聯(lián)用進行,步驟參照磁微粒使用說明書;另一種是吖啶酯標記抗-HBsAg多克隆抗體,配制成SEA試劑,步驟如下:將50 μg抗體與5 μL吖啶酯溶液(5 mmol/L)在300 μL磷酸鹽緩沖液(pH值8.0)中避光反應30 min,加入終止緩沖液(5%甘氨酸)反應30 min,最后避光透析去除游離吖啶酯。

    1.3.1 自建CMIA的檢測程序 自建CMIA檢測原理為雙抗體夾心法,檢測程序:(1)向反應杯中加入一定量的樣本、MB試劑和反應稀釋液,混勻后37 ℃孵育15 min;(2)儀器內(nèi)置磁鐵對反應杯中的磁微粒進行集磁,然后對磁微粒洗滌2次;(3)加入SEA試劑混勻重懸磁微粒,37 ℃孵育10 min;(4)儀器內(nèi)置磁鐵對反應杯中的磁微粒進行集磁,然后對磁微粒洗滌4次;(5)反應杯中加入預激發(fā)液和激發(fā)液,并檢測光子信號。

    1.3.2 反應的最佳體系 取重組HBsAg抗原用20%嬰牛血清(newborn bovine serum,NBS)進行梯度稀釋,得到10份陽性系列標準品(依次編號為S1~S10)。5份表面健康者血清樣本依次編號為N1~N5。觀察S1~S10的相對發(fā)光強度(relative light unit,RLU)值與樣本濃度的線性關系。將S1~S10的平均RLU值(記為P值)除以N1~N5的平均RLU值(記為N值),得出P/N比值,綜合分析上述線性關系及P/N比值,篩選出最佳反應體系。

    1.3.3 抗體篩選 將羊抗HBsAg多克隆抗體Ab1標記吖啶酯制備成SEA試劑,7株抗-HBsAg小鼠單克隆抗體(Ab2~Ab8)包被磁微粒制備為MB試劑,將MB試劑與SEA試劑配對檢測1例HBsAg陽性血清樣本(P)、1例HBsAg陰性樣本(N),以及不同HBsAg突變株,評估不同原料對不同樣本的檢出能力。

    1.3.4 抗體最適濃度的篩選 將不同濃度的磁微??贵w(0.2、0.4、0.8 mg/mL)與不同稀釋比例的吖啶酯抗體(1∶100、1∶200和1∶500)進行兩兩配對篩選,通過P/N比值及標準品的RLU與濃度的線性關系篩選出抗體的最適濃度。

    1.3.5 反應稀釋液的用量 分別設置0、25、50、100 μL反應稀釋液用量,對S1~S10系列標準品進行檢測,通過P/N比值及標準品的RLU與濃度的線性關系篩選出反應稀釋液的最適用量。

    1.3.6 樣本加樣量的選擇 分別設置20、50、80 μL樣本加樣量,對S1~S10進行檢測,通過P/N比值及標準品的RLU與濃度的線性關系篩選出樣本最適加樣量。

    1.3.7 試劑用量的選擇 設置25、50、100 μL試劑用量,分別評價MB試劑與SEA試劑的用量對試劑檢測范圍的影響,通過P/N比值及標準品的RLU值與濃度的線性關系篩選出試劑最適用量。

    1.3.8 標準曲線的建立 將HBsAg純品梯度稀釋,制備成6個不同濃度(100 000、20 000、4 000、800、160、32 IU/mL)的標準品(依次編號為S0~S5),測定S0~S5的RLU值,用四參數(shù)擬合方式對校準品的檢測結果進行擬合,得到標準曲線。

    1.4 自建CMIA的性能評價

    參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(the Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)EP6-A文件[4]、EP15-A2文件[5]、EP5-A2文件[6]、EP7-A2文件[7]評價自建CMIA的檢測性能。

    1.4.1 線性范圍 將高濃度HBsAg標準品梯度稀釋,得到10個濃度(100 000、50 000、10 000、5 000、1 000、500、100、20、10、5 IU/mL)的標準品,每個濃度樣本平行檢測4次,計算。將每個濃度的和RLU值采用Log-Logit數(shù)學模型處理后得到劑量-反應曲線及r值。

    時間等不起,造價出不起。只有一個辦法,自己動手。工程師劉家林、施工隊長李德銘和大家一起,研究出一個新的方案:原設計要求在路基2.5米以下用直徑1560毫米的鋼筋混凝土保護管穿越路基,改用直徑377毫米的鋼管代替混凝土管,可把管底深度由4.04米減少到2.88米,穿越長度由70米縮短到35米。但是,長距離穿越,稍有疏忽就會造成彎曲,即使縮短為30多米,仍有相當長的距離,如稍有彎曲就會損傷路基。因此,大家仍是提心吊膽,兢兢業(yè)業(yè),采取了非常嚴密的措施,并自己設計制造了一個24米長的頂推滑道,以避免管道穿彎,還選用D80推土機,挑選駕駛技術最熟練的推土機手,把頂推的位置固定死。

    1.4.2 檢測限 檢測HBsAg零濃度值的標準品,重復檢測20次,計算RLU的和s,將+2s代入劑量-反應曲線方程,求出對應的濃度值,即為最低檢測限。

    1.4.3 精密度 分別重復檢測高、低值HBsAg陽性樣本10次,連續(xù)檢測10 d,計算批內(nèi)和批間精密度[以變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)表示]。

    1.4.4 準確度 檢測配制的準確度參考品,測量相對偏差=(實測值-理論值)/理論值×100%。

    1.4.5 交叉反應 選擇可能與自建CMIA檢測HBsAg發(fā)生交叉反應的其他病毒陽性樣本,如HAV、HCV、HIV、人類嗜T淋巴細胞病毒(human T-lymphotropic virus,HTLV)、巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)、EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV),通過檢測特異性觀察自建CMIA是否會發(fā)生交叉反應。

    1.4.6 干擾實驗 在HBsAg陽性樣本中加入不同濃度的干擾物質(zhì)(血紅蛋白、膽紅素、三酰甘油、類風濕因子、抗凝劑)制備成干擾樣本,對照樣本加入同等體積的0.9%氯化鈉溶液,同時檢測干擾樣本和對照樣本,計算相對偏差,相對偏差=(干擾樣本-對照樣本)/對照樣本×100%。如相對偏差≤10%,可認為該濃度的干擾物質(zhì)對檢測無干擾。

    1.4.7 穩(wěn)定性實驗 將配制好的試劑在37 ℃條件下放置6 d,評估試劑的熱穩(wěn)定性。將試劑2~8 ℃密封保存6個月,每3個月檢測1次,觀察試劑的長期保存穩(wěn)定性。將試劑在儀器上冷藏(2~8 ℃)保存4周,每周檢測1次,評價試劑的機上保存穩(wěn)定性。穩(wěn)定性評估通過檢測系列標準品、陰陽性參考品及高值、低值樣本,以線性、準確度、檢出限、精密度等指標體現(xiàn)。

    1.5 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 16.0軟件和Graphpad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。采用Pearson相關分析及Bland-Altman一致性檢驗評價2種方法的相關性和一致性。

    2 結果

    2.1 抗體篩選

    7株抗HBsAg小鼠單克隆抗體中Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6和Ab8對陽性樣本和陰性樣本的區(qū)分度較好。進一步檢測不同HBsAg突變株,結果顯示Ab3、Ab4、Ab6和Ab8對不同突變株具有互補檢出能力,可用于包被磁微粒,制備MB試劑。見圖1、圖2。

    圖1 不同抗體反應性評估

    圖2 不同抗體對不同HBsAg突變株的檢測能力

    2.2 最適反應條件

    2.2.1 抗體最適濃度的篩選 磁微??贵w最適濃度為0.4 mg/mL,吖啶酯抗體最適稀釋比例為1∶200(濃度為250 ng/mL)。

    2.2.2 反應稀釋液最適用量 當反應稀釋液用量為100 μL時,試劑檢測范圍最優(yōu)。見圖3。

    圖3 不同反應稀釋液用量下RLU與HBsAg濃度的關系

    2.2.3 樣本加樣量 隨著樣本加樣量的增加,試劑檢測上限逐漸降低,檢測范圍逐漸縮小,故樣本最適加樣量選擇20 μL。見圖4。

    圖4 不同樣本加樣量下RLU和HBsAg濃度的關系

    2.2.4 試劑用量 MB試劑用量和SEA試劑用量對檢測范圍的影響較小,因此2個主要試劑的用量均為50 μL。

    2.3 性能評價結果

    2.3.1 線性范圍 自建CMIA檢測HBsAg的線性范圍為20~100 000 IU/mL,線性回歸方程為Y=0.722X+3.591(r=0.993,P<0.001)。見圖5。

    圖5 自建CMIA檢測HbsAg的劑量-反應曲線

    2.3.2 最低檢測限 將零濃度標準品的RLU代入劑量-反應方程,得到自建CMIA的最低檢測限為9.9 IU/mL。

    2.3.3 精密度 自建CMIA檢測高、低值HBsAg樣本的批內(nèi)CV分別為8.2%、8.4%,批間CV分別為8.9%、8.7%,均符合要求(CV<10.0%)。

    2.3.4 交叉反應 自建CMIA對其他病毒陽性樣本均無明顯交叉反應,HBsAg均<20 IU/mL,特異性為100%。

    2.3.5 干擾實驗 Hb<400 mg/L、膽紅素<4 mg/L、類風濕因子<800 IU/mL、三酰甘油<2 mg/L、檸檬酸鈉<22 mmol/L、乙二胺四乙酸(ethylenediamineteraacetic acid,EDTA)<8 mmol/L對自建CMIA檢測HBsAg無干擾,相對偏差均<10%。見表1。

    表1 自建CMIA干擾實驗結果

    2.3.6 穩(wěn)定性實驗 配制好的試劑在37 ℃可穩(wěn)定6 d,開蓋后上機(2~8 ℃)保存可穩(wěn)定4周,2~8 ℃密封保存可穩(wěn)定6個月。見表4。

    表4 自建CMIA試劑的穩(wěn)定性實驗結果

    2.3.7 方法學比較 自建CMIA與電化學發(fā)光法檢測HBsAg的相關性良好,線性回歸方程為Y=1.001X-0.018(r=0.978,P<0.001),見圖6。Bland-Altman散點圖顯示266份樣本中僅有3份(1.13%)樣本在95%一致性界限外,低于臨床可接受要求(2.5%),2種方法的一致性良好,見圖7。

    圖6 自建CMIA與電化學發(fā)光法檢測HBsAg的相關性

    圖7 自建CMIA與電化學發(fā)光法檢測HBsAg的Bland-Altman散點圖

    3 討論

    HBV是一種嗜肝性DNA病毒,60%的肝硬化和80%的肝癌是由HBV感染所致[8]。HBsAg是慢性乙型肝炎患者診斷和治療監(jiān)測重要的血清學指標,HBsAg由陽性轉為陰性是患者免疫清除的最終目標[9]。有研究結果顯示,血清HBsAg基線水平和治療后血清HBsAg水平的下降幅度都可較好地預測患者抗病毒治療的療效和預后[10-11]。根據(jù)電化學發(fā)光法試劑說明書的聲明,611例HBV感染者中約有80%的患者血清HBsAg水平分布于100~100 000 IU/mL。ARCHITECT iR2000全自動免疫分析系統(tǒng)(美國雅培公司)的靈敏度較高,但線性范圍很窄,僅為0.05~250 IU/mL,高于250 IU/mL的樣本需設置500倍稀釋重檢或手工稀釋后重檢,這大大降低了檢測效率。cobas e601全自動電化學發(fā)光免疫分析儀在首次檢測HBsAg時需強制進行400倍稀釋,線性范圍為20~52 000 IU/mL,低于20 IU/mL的樣本需原倍重檢,高于52 000 IU/mL的樣本需手工稀釋后重檢。有研究結果顯示,與ARCHITECT i2000全自動免疫分析系統(tǒng)相比,cobas e601全自動電化學發(fā)光免疫分析儀對HBsAg突變株的檢測能力具有明顯優(yōu)勢[12-13]。

    綜上所述,本研究建立的檢測血清HBsAg的CMIA在精密度、特異性、穩(wěn)定性等方面均符合臨床檢測要求,與電化學發(fā)光法有較好的相關性和一致性。自建CMIA的優(yōu)勢是具有更寬的線性范圍(20~100 000IU/mL),可覆蓋臨床上絕大部分乙型肝炎患者血清HBsAg水平的范圍,既降低了因稀釋樣本造成的實驗誤差,又降低了檢測成本,提高了檢測效率。該法的不足之處在于檢測<20 IU/mL的低值樣本時有一定的局限性,但這是在提高檢測上限時無法避免的問題。臨床上血清HBsAg<20 IU/mL的HBV感染患者很少,針對這部分樣本本研究建立了針對低值樣本的檢測方法。在指導慢性乙型肝炎患者抗病毒治療的用藥選擇上,臨床對高值樣本的檢測需求遠高于低值樣本,因此該局限性并不影響自建CMIA的臨床應用價值。另外,自建CMIA的試劑原料大部分為國產(chǎn),成本較低,獲取方便。因此,自建CMIA具有較好的臨床應用前景。

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