頭孢他啶/阿維巴坦單獨(dú)和聯(lián)合磷霉素碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌體外抗菌活性研究

陳 濤， 徐 曄， 董郭楓， 周 翠， 徐雯雅， 周鐵麗

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325000；2.襄陽(yáng)市第一人民醫(yī)院，湖北 襄陽(yáng) 441000）

革蘭陰性菌作為臨床最常見的機(jī)會(huì)致病菌，廣泛存在于醫(yī)院和自然環(huán)境中。近年來(lái)，隨著抗菌藥物的廣泛使用，以及革蘭陰性菌易獲得耐藥基因的特性，導(dǎo)致其耐藥性不斷增強(qiáng)，逐漸成為一種嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生威脅[1]。碳青霉烯類抗菌藥物是治療革蘭陰性菌感染的首選，近年來(lái)也出現(xiàn)越來(lái)越多的耐藥菌株，使抗感染形勢(shì)愈加嚴(yán)峻。產(chǎn)生各類β-內(nèi)酰胺酶是革蘭陰性菌對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥的主要原因[2]。阿維巴坦（avibactam，AVI）是一種新的非β-內(nèi)酰胺類β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，屬于二氮雜二環(huán)辛烷（diazabicyclooctane，DBO）類化合物，與臨床使用的抑制劑比較，AVI具有抑酶效果更好、抑菌譜廣的優(yōu)點(diǎn)。2015年2月，AVI與三代頭孢菌素——頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）在美國(guó)組合上市，主要用于治療復(fù)雜的泌尿道感染，以及聯(lián)合甲硝唑治療復(fù)雜的腹腔內(nèi)感染。該復(fù)合藥物對(duì)革蘭陰性菌感染有著良好的治療效果[3-4]，為臨床治療碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌感染提供了良好的治療選擇。磷霉素是一種可阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁合成的低分子化合物，在美國(guó)被批準(zhǔn)用于治療由革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性菌引起的尿路感染。磷霉素與β-內(nèi)酰胺類聯(lián)合治療多重耐藥（multi-drug resistance，MDR）革蘭陰性菌感染正引起研究者們的廣泛關(guān)注，有研究結(jié)果表明，磷霉素和β-內(nèi)酰胺類（碳青霉烯類和頭孢洛扎-他唑巴坦）之間具有協(xié)同作用[5-6]。

目前，我國(guó)CAZ/AVI對(duì)碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的抗菌作用鮮有報(bào)道，故本研究收集臨床感染最常見的3種革蘭陰性菌——大腸埃希菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），評(píng)價(jià)CAZ/AVI單獨(dú)和聯(lián)合磷霉素對(duì)這3種碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的體外抗菌活性，為臨床合理使用抗菌藥物提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

收集2014—2017年溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌（carbapenemresistantEscherichia coli，CREC）56株、碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌（carbapenem-resistantKlebsiella pneumoniae，CRKP）43株和碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（carbapenem-resistantPseudomonas aeruginosa，CRPA）53株，以碳青霉烯敏感大腸埃希菌（carbapenem-susceptibleEscherichia coli，CSEC）51株、碳青霉烯敏感肺炎克雷伯菌（carbapenem-susceptibleKlebsiella pneumoniae，CSKP）43株和碳青霉烯敏感銅綠假單胞菌（carbapenem-susceptiblePseudomonas aeruginosa，CSPA）51株作為對(duì)照，合計(jì)297株。56株CREC中，31株產(chǎn)NDM金屬酶，14株產(chǎn)KPC-2酶，11株不產(chǎn)碳青霉烯酶；43株CRKP中，40株產(chǎn)KPC-2酶，1株產(chǎn)IMP酶，2株同時(shí)產(chǎn)KPC-2和IMP酶；53株CRPA均不產(chǎn)碳青霉烯酶。所有菌株經(jīng)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀鑒定，根據(jù)VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）最新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類藥物中的任意一種耐藥即納入本研究。所有碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌都經(jīng)過(guò)CLSI推薦的改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（modified carbapenem inactivation method，mCIM）和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）確認(rèn)碳青霉烯酶表型和基因型[7]。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）和銅綠假單胞菌（ATCC 27853）購(gòu)自我國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心。

1.2 抗菌藥物

CAZ、阿維巴坦鈉（上海源葉生物科技有限公司），磷霉素、葡萄糖-6-磷酸二鈉（溫州康泰生物技術(shù)公司）。

1.3 儀器與試劑

VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物分析儀及配套細(xì)菌鑒定GNS卡和GN卡、比濁儀（法國(guó)生物梅里埃公司），10 μg美羅培南紙片、哥倫比亞血瓊脂、M-H瓊脂培養(yǎng)基和M-H肉湯培養(yǎng)基（英國(guó)OXOID公司）、PCR擴(kuò)增試劑盒（大連寶生物工程有限公司）、PCR反應(yīng)儀和脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)醫(yī)療器械廠）、90 mm 塑料平皿（溫州倍可特公司）、96孔板（美國(guó)康寧公司）、超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器公司）。

1.4 方法

1.4.1 瓊脂稀釋法檢測(cè)菌株對(duì)CAZ/AVI的敏感性 采用CLSI 2018年推薦瓊脂二倍稀釋法[7]測(cè)定待檢菌株對(duì)CAZ/AVI的敏感性。CAZ/AVI的濃度測(cè)定范圍為0.12/4 μg/mL～128/4 μg/mL。將分離純化后的臨床分離株及質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）接種于血平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育16～18 h后，從新鮮過(guò)夜的培養(yǎng)板上挑取單個(gè)菌落于2 mL M-H肉湯中，置于37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱200 r/min培養(yǎng)6～8 h，用無(wú)菌M-H肉湯將菌液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫群髮⑵?0倍稀釋，接種到M-H瓊脂平板上，每點(diǎn)接種量為1×104CFU，分別測(cè)定CAZ/AVI對(duì)各菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。結(jié)果依據(jù)2018版CLSI藥物折點(diǎn)判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷[7]，腸桿菌科細(xì)菌和銅綠假單胞菌對(duì)CAZ/AVI的MIC≥16/4 μg/mL判斷為耐藥，≤8/4 μg/mL則判斷為敏感。

1.4.2 微量棋盤稀釋法檢測(cè)CAZ/AVI和磷霉素的聯(lián)合抗菌作用 采用微量棋盤稀釋法測(cè)定CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素后的聯(lián)合抗菌作用[8]。將CAZ/阿維巴坦鈉按臨床使用的比例（4∶1）配成復(fù)合藥物，根據(jù)菌株的MIC值將CAZ/AVI和磷霉素分別配置成一定濃度的原液，使最終組合的藥物濃度分別為2/0.5 μg/mL～256/64 μg/mL和1 μg/mL～2 048 μg/mL，并保證每個(gè)孔里包含有25 μg/mL的葡萄糖-6-磷酸二鈉。按照棋盤法設(shè)計(jì)，每孔分別加入50 μL CAZ、AVI和磷霉素，同時(shí)加入100 μL稀釋后的菌液，37℃培養(yǎng)16～18 h后，記錄各組合和最佳組合時(shí)各種藥物的MIC（甲藥聯(lián)用的MIC和乙藥聯(lián)用的MIC）值，并計(jì)算部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）值。聯(lián)合用藥的兩藥相互作用效果主要采用FICI進(jìn)行評(píng)價(jià)，F(xiàn)ICI=FIC甲藥+FIC乙藥=MIC甲藥聯(lián)用/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)用/MIC乙藥單用[FIC為部分抑菌濃度（fractional ihibitory concentration）]。FICI判斷標(biāo)準(zhǔn)為：FICI≤0.5為協(xié)同作用，0.5＜FICI≤1.0為相加作用，1.0＜FICI≤2.0為無(wú)關(guān)作用，F(xiàn)ICI＞2.0為拮抗作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CAZ/AVI對(duì)碳青霉烯類耐藥和敏感革蘭陰性菌的體外抗菌活性

297株革蘭陰性菌對(duì)CAZ/AVI的總耐藥率為18.18%，其中152株碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌對(duì)CAZ/AVI的耐藥率為30.26%，顯著高于碳青霉烯敏感菌株的5.52%（P＜0.05）。在大腸埃希菌和銅綠假單胞菌中，碳青霉烯類耐藥菌株對(duì)CAZ/AVI的耐藥率（39.29%和37.74%）顯著高于碳青霉烯敏感菌株（1.96%和7.84%）（P＜0.05）；然而在肺炎克雷伯菌中，CRKP對(duì)CAZ/AVI的耐藥率為9.30%，與CSKP（6.98%）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CRKP對(duì)CAZ/AVI的耐藥率（9.30%）顯著低于CREC和CRPA（39.29%和37.74%）（P＜0.05）。見表1。對(duì)CAZ/AVI敏感的CRKP的總體MIC分布要較CREC更接近于耐藥折點(diǎn)（P＜0.05），見表2。產(chǎn)NDM金屬酶的碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌對(duì)CAZ/AVI的耐藥率為67.74%，顯著高于產(chǎn)KPC-2酶（7.41%）和不產(chǎn)酶（32.81%）的碳青霉烯類耐藥菌株（P＜0.05），見表3。

2.2 CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素對(duì)碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的體外抗菌活性

從耐CAZ/AVI的3種碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌中各隨機(jī)挑選3株菌株（CREC：DC2003、DC7969、DC8085；CRKP：FK2784、FK2938、FK2993；CRPA：TL2855、TL2864、TL2867）進(jìn)行微量棋盤稀釋法藥物敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，9株碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌中，CAZ/AVI和磷霉素聯(lián)用后，2種藥物的MIC值較單用時(shí)均有所降低。在CREC中，CAZ/AVI與磷霉素聯(lián)用后的FICI均分布在0.5～1.0的范圍內(nèi)，均表現(xiàn)為相加作用。在CRKP與CRPA中，CAZ/AVI與磷霉素聯(lián)用后的FICI均≤0.5，均表現(xiàn)為協(xié)同作用。見表4。

表1 革蘭陰性菌對(duì)CAZ/AVI的耐藥情況

表2 CAZ/AVI敏感不同碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌MIC分布情況比較 株

表3 CAZ/AVI對(duì)不同表型/基因型革蘭陰性菌的耐藥情況

表4 CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素的MIC值及其FICI

3 討論

細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)是一個(gè)嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問(wèn)題，由耐藥細(xì)菌引起的感染有著較高的發(fā)病率和病死率。目前，MDR革蘭陰性菌，尤其是碳青霉烯類耐藥的革蘭陰性菌，是醫(yī)院和社區(qū)感染的一大威脅[9]。由于細(xì)菌對(duì)經(jīng)典抗菌藥物的耐藥率不斷增高，學(xué)者們開始關(guān)注臨床上新的抗菌藥物以對(duì)抗這些棘手的耐藥菌株。β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合因?qū)Ξa(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株具有良好的抑菌作用而得到研究者們的關(guān)注。早前使用的經(jīng)典酶抑制劑通過(guò)與β-內(nèi)酰胺酶結(jié)合，形成穩(wěn)定的非共價(jià)化合物達(dá)到抑酶作用，但同時(shí)自身結(jié)構(gòu)也遭到破壞。而新的酶抑制劑AVI卻具備獨(dú)特的抑酶機(jī)制，其與β-內(nèi)酰胺酶共價(jià)結(jié)合后，可再經(jīng)環(huán)合使自身結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變，因此具有更長(zhǎng)效的抑酶作用[10]。同時(shí)，AVI的抑酶譜更廣，可有效抑制Ambler A類、C類和部分D類β-內(nèi)酰胺酶[11]。CAZ/AVI作為新的β-內(nèi)酰胺/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑組合，對(duì)MDR革蘭陰性菌有著良好的抗菌作用[12]。因此，本研究對(duì)該復(fù)合藥物進(jìn)行研究，以期能應(yīng)對(duì)臨床棘手的碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌。

本研究結(jié)果顯示，3種革蘭陰性菌對(duì)CAZ/AVI的總耐藥率為18.18%，較國(guó)外報(bào)道的耐藥率更高[13]。此外，碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌對(duì)CAZ/AVI的總耐藥率高達(dá)30.26%，顯著高于碳青霉烯敏感菌株的5.52%（P＜0.05）。CAZ/AVI作為除多黏菌素以外最有前景的復(fù)合藥物，目前已存在這么高比例的耐藥菌株，提示臨床上革蘭陰性菌的耐藥形勢(shì)已經(jīng)非常嚴(yán)峻。CREC對(duì)CAZ/AVI的耐藥率高達(dá)39.29%，與大腸埃希菌主要產(chǎn)AVI無(wú)法抑制的NDM金屬酶有關(guān)，本研究中，產(chǎn)NDM金屬酶的碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌對(duì)CAZ/AVI的耐藥率為67.74%，與國(guó)外的研究結(jié)果相似[14]；CRPA的耐藥率達(dá)37.74%也與銅綠假單胞菌幾乎不產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)；而CRKP對(duì)CAZ/AVI展現(xiàn)出了良好的敏感率，這與AVI可以顯著抑制KPC-2酶有著密切的關(guān)系，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道相符[15-16]。本研究結(jié)果還顯示，在腸桿菌科細(xì)菌中，雖然CRKP對(duì)CAZ/AVI的耐藥率明顯低于CREC，但對(duì)CAZ/AVI敏感的CRKP的總體MIC分布卻較CREC更接近于CLSI規(guī)定的耐藥折點(diǎn)。這可能意味著未來(lái)幾年，同時(shí)耐碳青霉烯和CAZ/AVI的肺炎克雷伯菌將會(huì)不斷出現(xiàn)，造成可供使用的抗菌藥物進(jìn)一步減少。

磷霉素對(duì)革蘭陰性菌具有良好的殺菌作用。在一些國(guó)家，靜脈注射磷霉素已被用于治療包括肺炎在內(nèi)的各種類型的感染[17-18]。同時(shí)，磷霉素因其單獨(dú)使用時(shí)耐藥性突變產(chǎn)生的頻率較高，因此經(jīng)常被選作聯(lián)合用藥的對(duì)象之一。有研究結(jié)果表明，合理的聯(lián)合用藥比單藥治療更靈活，并且可降低單藥治療時(shí)發(fā)生的單藥耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)，緩解臨床治療壓力[19]。因此，為了解決單獨(dú)使用CAZ/AVI時(shí)耐藥率較高的問(wèn)題，以及避免新的CAZ/AVI耐藥菌株的出現(xiàn)，本研究考慮了一種聯(lián)合用藥方案——CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素，并進(jìn)行了棋盤實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證該方案的可行性，結(jié)果表明CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素在體外對(duì)CRKP和CRPA表現(xiàn)為協(xié)同作用，不存在無(wú)關(guān)和拮抗作用，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[8，20]相符，證實(shí)了本研究對(duì)CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素抗菌效果的猜想，通過(guò)AVI靶向抑制β-內(nèi)酰胺酶，CAZ和磷霉素可以無(wú)阻礙地破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，從而使用2種不同的策略殺死細(xì)菌。但本研究中CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素對(duì)2株產(chǎn)NDM金屬酶的CREC只顯示出相加作用，也從側(cè)面反映了該聯(lián)合方案的局限性是缺乏對(duì)產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的有效作用。為了克服這一困境，有研究人員提出了CAZ/AVI聯(lián)合氨曲南的策略。氨曲南是一種單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，由于其對(duì)青霉素結(jié)合蛋白的強(qiáng)效和特異性親和力，因此不會(huì)被金屬β-內(nèi)酰胺酶水解，同時(shí)保留了對(duì)許多革蘭陰性菌的抗菌活性，但氨曲南容易被大多數(shù)絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶水解，因此AVI的加入正好解決了這一問(wèn)題。近期也有研究結(jié)果表明CAZ/AVI聯(lián)合氨曲南對(duì)包括產(chǎn)NDM酶大腸埃希菌在內(nèi)的產(chǎn)金屬酶腸桿菌科細(xì)菌表現(xiàn)出協(xié)同作用[21]。但鑒于體外藥物敏感性試驗(yàn)與人體內(nèi)真實(shí)情況存在一定差異，以及患者感染程度、藥物特性、實(shí)驗(yàn)菌株數(shù)量及認(rèn)知水平的局限性，對(duì)于這些聯(lián)合用藥方案的臨床價(jià)值還需進(jìn)行深入探究，以評(píng)估其臨床有效性和安全性，為碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的治療奠定基礎(chǔ)。

綜上所述，CAZ/AVI對(duì)CRKP有著良好的體外抗菌活性，可以作為臨床治療CRKP的首選抗菌藥物之一。此外，CAZ/AVI聯(lián)合磷霉素可能成為一種治療3種常見碳青霉烯類耐藥革蘭陰性菌的新的治療策略，但效果需要進(jìn)一步的評(píng)估。