川楝素通過(guò)下調(diào)環(huán)狀RNA circDLST 對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823 的抑制作用

張 靖

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院消化科，上海 200233

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，盡管全球胃癌的發(fā)生率和死亡率呈下降趨勢(shì)[1]，但在我國(guó)胃癌仍位居惡性腫瘤死因的第3 位[2]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在抗腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)、改善患者生活質(zhì)量等方面也具有一定的作用。川楝素（toosendanin，TSN）是川楝樹(shù)根皮及川楝子的有效提取物，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，包括抗腫瘤作用，抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[3-5]。我們前期研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，TSN 可以通過(guò)阻斷蛋白激酶B（protein kinase B，PKB 或AKT）/ 糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）信號(hào)通路抑制胃腸腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化學(xué)治療（化療）敏感性。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一種共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，廣泛存在于各種生物細(xì)胞中，它是由前體線性RNA 反向剪接產(chǎn)生，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、序列保守和組織特異性等特征[6]。circRNA 與胃癌密切相關(guān)：circ_0047905、circ_0138960 和circ_7690-15 在胃癌組織中高表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[7]；circ_100269通過(guò)靶向miR-630 抑制胃癌增殖[8]；circDONSON 通過(guò)核小體重構(gòu)因子（nucleosome remodeling factor，NURF）復(fù)合物依賴的SOX4（SRY-related HMG box transcription factor 4）激活促進(jìn)胃癌生長(zhǎng)和侵襲[9]；circLARP4 通過(guò)吸附miR-424-5p 激活大腫瘤抑制激酶1（large tumor suppressor kinase 1，LATS1） 抑 制 胃 癌 侵 襲 作 用[10]；circDLST 通 過(guò) 吸 附miR-502-5p 和 激 活NRAS（NRAS proto-oncogene，GTPase）/MEK1（mitogen-activated protein kinase kinase 1）/ERK1/2（mitogen-activated protein kinase 1/2）信號(hào)促進(jìn)胃癌生長(zhǎng)和侵襲[11]。我們利用TSN處理組和對(duì)照組篩選差異表達(dá)的circRNA，發(fā)現(xiàn)TSN 明顯調(diào)控circDLST。本研究旨在通過(guò)觀察TSN 對(duì)circDLST表達(dá)及胃癌生長(zhǎng)的影響，為胃癌治療提供潛在的策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑和儀器 TSN（純度≥99%）購(gòu)自上海源業(yè)生物科技有限公司，噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司（南京），TRIzol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，circDLST 過(guò)表達(dá)及其空載對(duì)照慢病毒載體購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Master Mixture 購(gòu) 自 日 本TaKaRa 公 司，Transwell 試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD 公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Kray Technologies 公司，酶標(biāo)分析儀（型號(hào)BS-1101）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.1.2 胃癌細(xì)胞系 人胃癌細(xì)胞系BGC-823 購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 實(shí) 驗(yàn) 動(dòng) 物 雄 性BALB/c 裸 鼠（4 ～5 周 齡，18 ～20 g）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2017-0005。裸鼠飼養(yǎng)于上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，SPF 級(jí)飼養(yǎng)，帶有密封空氣過(guò)濾裝置的塑料籠，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（滬）2016-0020。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 定量PCR 用不同濃度TSN（0、0.5、1.0 和2.0 μmol/L） 處理胃癌細(xì)胞BGC-823 24 h 后，TRIzol 提取總RNA，并通過(guò)M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，使用SYBR Green Master Mixture 試劑盒進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增。circDLST 上、下游引物序列分別為5'-TACAGTCAAAACCCCAGCGT-3'和5'-GTTGTTAATGCTTTCTCCCACC-3'。 以 人β 肌 動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參對(duì)照，上、下游引物序列分別為5'- GTGGCCGAGGACTTTGATTG-3'和5'-CCTGTAAC AACGCATCTCATATT-3'。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.2.2 MTT 增殖實(shí)驗(yàn) 將circDLST 過(guò)表達(dá)及其空載對(duì)照（CON）慢病毒載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC-823，具體轉(zhuǎn)染方法參考文獻(xiàn)[11]。細(xì)胞在96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，密度為5×103/孔。細(xì)胞貼壁48 h 后，以0.5 μmol/L TSN 處理細(xì)胞。每隔24 h 分析細(xì)胞增殖活性，加入20 μL MTT（5 mg/mL）孵育4 h 后，加入150 μL 二甲基亞砜溶解5 min，使用酶標(biāo)分析儀在570 nm 處檢測(cè)吸光度值。實(shí)驗(yàn)分為circDLST+TSN組、CON+TSN 組和CON+PBS 組，重復(fù)3 次。

1.2.3 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn) 將circDLST 過(guò)表達(dá)及其空載對(duì)照慢病毒載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC-823，細(xì)胞貼壁48 h后，以0.5 μmol/L TSN 處理細(xì)胞24 h。使細(xì)胞懸浮在無(wú)血清培養(yǎng)基中饑餓24 h 后，將懸浮細(xì)胞添加到含有基質(zhì)凝膠（3.9 μg/μL）的上層小室；而下層小室含有10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基。最后穿過(guò)凝膠的細(xì)胞用75%乙醇固定，并用結(jié)晶紫進(jìn)行染色。光學(xué)顯微鏡下對(duì)每組挑選3 個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)分為circDLST+TSN 組、CON+TSN 組和CON+PBS 組，重復(fù)3 次。

1.2.4 裸鼠皮下移植瘤模型建立 將circDLST 過(guò)表達(dá)及其空載對(duì)照慢病毒載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC-823 后，皮下注射接種（1×107/只），建立裸鼠皮下移植瘤動(dòng)物模型。12 d 后，將模型裸鼠隨機(jī)分為3 組：circDLST+TSN 組（n=6），circDLST 轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞BGC-823 建立裸鼠皮下移植瘤后，每日腹腔注射200 μg/kg TSN[3]；CON+TSN組（n=6），CON 轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞BGC-823 建立裸鼠皮下移植瘤后，每日腹腔注射200 μg/kg TSN；CON+PBS 組（n=6），CON 轉(zhuǎn)染的胃癌細(xì)胞BGC-823 建立裸鼠皮下移植瘤后，每日腹腔注射等量的PBS。每隔1 日用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠皮下腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），計(jì)算腫瘤體積V=1/2ab2。注射32 d 后處死各組裸鼠。動(dòng)物研究獲得上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的倫理許可。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TSN 對(duì)胃癌細(xì)胞中circDLST 表達(dá)的影響

利用不同濃度TSN（0、0.5、1.0 和2.0 μmol/L）處理胃癌細(xì)胞24 h 后，定量PCR 結(jié)果（圖1）顯示，與對(duì)照組（0 μmol/L）比較，TSN 明顯下調(diào)circDLST 的表達(dá)水平，且呈濃度依賴性（均P＜0.01）。

2.2 TSN 通過(guò)調(diào)節(jié)circDLST 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖活性的影響

之前的研究[11]已報(bào)道circDLST 過(guò)表達(dá)載體在BGC-823 胃癌細(xì)胞具有高的轉(zhuǎn)染效率。circDLST 過(guò)表達(dá)載體或空載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后，以0.5 μmol/L TSN 處理。MTT增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，與CON+PBS 組比較，TSN作用72 h 后可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖活性（均P=0.000）；而與CON+TSN 組比較，過(guò)表達(dá)circDLST 可逆轉(zhuǎn)TSN 抗胃癌細(xì)胞增殖活性的作用（P=0.000）。

圖2 circDLST 對(duì)TSN 抗胃癌細(xì)胞增殖活性的逆轉(zhuǎn)效果Fig 2 Reverse effect of circDLST on the anti-proliferation activity of TSN in gastric cancer cells

2.3 TSN 通過(guò)調(diào)節(jié)circDLST 對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)（圖3）顯示，與CON+PBS 組比較，TSN 可顯著抑制胃癌細(xì)胞的侵襲能力（P=0.000）；而與CON+TSN 組比較，過(guò)表達(dá)circDLST 可逆轉(zhuǎn)TSN 抗胃癌細(xì)胞侵襲能力的作用（P=0.000）。

圖3 circDLST 對(duì)TSN 抗胃癌細(xì)胞侵襲能力的逆轉(zhuǎn)效果Fig 3 Reverse effect of circDLST on the anti-invasion potential of TSN in gastric cancer cells

2.4 TSN 通過(guò)調(diào)節(jié)circDLST 對(duì)胃癌皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響

circDLST 過(guò)表達(dá)載體或空載體轉(zhuǎn)染BGC-823 細(xì)胞后皮下注射裸鼠，然后每日腹腔注射TSN 或PBS。結(jié)果（圖4）顯示，注射32 d 后，與CON+PBS 組比較，TSN可顯著抑制胃癌細(xì)胞皮下移植瘤的生長(zhǎng)（P=0.000）；而與CON+TSN 組比較，過(guò)表達(dá)circDLST 可逆轉(zhuǎn)TSN 抗胃癌皮下移植瘤生長(zhǎng)的作用（P=0.020）。

圖4 circDLST 對(duì)TSN 抗胃癌皮下移植瘤生長(zhǎng)的逆轉(zhuǎn)效果Fig 4 Reverse effect of circDLST on the anti-xenograft tumor growth of TSN in gastric cancer cells

3 討論

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者不良預(yù)后的主要原因之一。最近研究[12]顯示，circRNA 異常表達(dá)與胃癌生存、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后密切相關(guān)。circRNA 主要包括外顯子circRNA、外顯子內(nèi)含子circRNA（exon-intron circRNA，EIciRNA）和內(nèi)含子circRNA，其中外顯子circRNA 占絕大多數(shù)。circRNA 的環(huán)狀結(jié)構(gòu)賦予了它們獨(dú)特的生物學(xué)特性，如穩(wěn)定性較強(qiáng)。circRNA 還能與miRNA 及蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，參與蛋白質(zhì)編碼和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[13]。研究[10-13]發(fā)現(xiàn)，circ-102958、circ-0000520、circ-0001017 可能對(duì)早期胃癌具有潛在的診斷價(jià)值；circLARP4、circPSMC3、circDLST的異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我們前期研究[11]亦發(fā)現(xiàn)，circDLST 作為外顯子circRNA 主要定位在胃癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，其異常上調(diào)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，并與患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示其可能成為判斷胃癌患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度TSN 對(duì)胃癌細(xì)胞中circDLST表達(dá)具有抑制作用；同時(shí)TSN 可抑制胃癌細(xì)胞增殖活性、侵襲潛能和皮下移植瘤生長(zhǎng)，而過(guò)表達(dá)circDLST 對(duì)TSN 的抗腫瘤效果具有逆轉(zhuǎn)作用。因此，提示TSN 可能通過(guò)下調(diào)circDLST 抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲；但是TSN對(duì)circDLST 下游的miRNA 及信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用仍有待進(jìn)一步的探究，以期為其抗胃癌作用提供更多的實(shí)驗(yàn) 依據(jù)。

參·考·文·獻(xiàn)

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