負載骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 微球的可注射水凝膠的抑菌和成骨 性能評價

劉立立，崔文國,

1. 蘇州大學(xué)藥學(xué)院，蘇州 215000；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海市傷骨科研究所，上海市中西醫(yī)結(jié)合防治骨與關(guān)節(jié)病損重點實驗室，上海 200025

骨髓炎是指細菌感染骨骼，形成炎性反應(yīng)，累及單一或多處骨骼并導(dǎo)致骨質(zhì)破壞的骨炎癥性疾病[1]。高能量損傷導(dǎo)致的開放性骨折容易引發(fā)感染[2]，形成死骨，進而導(dǎo)致骨折遷延不愈甚至骨髓炎發(fā)生。由于局部感染難以控制、成骨較困難，慢性骨髓炎更是難以治療，從而導(dǎo)致高截肢率和高致殘率[3]。目前，臨床上常常全身應(yīng)用抗生素治療骨感染，但抗生素的廣泛應(yīng)用促使了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等耐藥菌株的出現(xiàn)[4-5]。由于普通抗生素不能完全殺死耐藥細菌，所以裝載普通抗生素的植入材料在治療骨感染中的價值有限[6]。因此，開發(fā)一種無耐藥性且具有抗菌及骨再生作用的材料已成為骨感染治療的迫切 需要。

水凝膠具有高含水量、良好的生物相容性和可調(diào)的機械性能等特點，是一種良好的骨組織再生支架材料[7]。各種功能性水凝膠均已開發(fā)并有望應(yīng)用于臨床，如細胞膜抗炎水凝膠[8]、響應(yīng)性水凝膠[9]、黏附性水凝膠[10]、可注射水凝膠[11]、自愈合水凝膠[12]等。聚乙二醇[poly （ethylene glycol），PEG]水凝膠是基于美國食品藥品管理局批準的聚乙二醇均聚物，由于其具有良好的生物相容性而被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料的研發(fā)[13]。Ag+交聯(lián)的PEG 水凝膠具有優(yōu)良的抗菌性能。然而，當(dāng)PEG 水凝膠被植入機體后，成骨生物活性分子會快速釋放，難以在病灶局部維持有效濃度，降低了成骨生物活性分子的生物利用度，促成骨作用差，且導(dǎo)致了昂貴的成骨生物活性分子的浪費。因此，有必要開發(fā)一種能增加目標組織中生物活性分子緩釋性的水凝膠。

基于此，本研究利用Ag+和巰基（-SH）的配位交聯(lián)原理，開發(fā)一種無活性基團的可注射、抗菌和自愈合的PEG 水凝膠，再使用微流控技術(shù)制備負載重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）的光交聯(lián)明膠微球，將兩者混合從而構(gòu)建負載BMP-2 微球的可注射水凝膠BMP/Gel/SH-Ag，并評價其抗菌和成骨性能。該體系具有如下優(yōu)點：①BMP/Gel/SH-Ag 中的Ag+具有廣譜抗菌性和優(yōu)良的抗菌性能，可在一定程度上緩解抗生素濫用問題。②負載BMP-2 的明膠微球通過緩釋作用，長期維持局部藥物濃度，持續(xù)發(fā)揮促成骨作用。因此，BMP/Gel/SH-Ag 的載藥系統(tǒng)在促成骨和抗感染方面有良好的表現(xiàn)，并有望在骨髓炎的預(yù)防中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1 試劑 明膠（批號 180LB8，羅賽洛明膠有限公司），甲基丙烯酸酐（CAS 號760-93-0，阿拉丁試劑有限公司），2-羥基-4′-（2-羥基乙氧基）-2-甲基苯丙酮（CAS 號106797-53-9，北京百靈威科技有限公司），巰基化的聚乙二醇[4-arm thiol-terminated poly （ethylene glycol），4SH-PEG]（ 批 號TZQ09095， 美 國Creative PEG Works；相對分子質(zhì)量20 000），硝酸銀溶液（批號20170808，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），紅色鋼筆墨水（貨號 204，上海英雄有限公司），BMP-2（批號10426-HNAE，北京索萊寶科技有限公司），ELISA 試劑盒 （貨號 70-EK1108-48，杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司），CCK-8試劑盒（貨號CK04，日本Dojindo），氯化硝基四氮唑藍/氯化硝基四氮唑藍（nitrobluete trazolium chloride/5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，BCIP/NBT）堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（批號C3206，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（貨號RASMX-90021，賽業(yè)生物科技有限公司），α-MEN 培養(yǎng)基（貨號30265.01，美國Hyclone）。

1.1.2 細胞和菌株 大鼠BMSCs（實驗室自提取并分選鑒定），金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）和大腸埃希菌（Escherichia coli，E. coli）（貨號Atcc43300、Atcc11229，北京陸橋技術(shù)股份有限公司）。

1.1.3 儀器 微流控裝置（保定蘭格恒流泵有限公司），熒光顯微鏡（德國Zeiss），掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（日本Hitachi），酶標儀（美國BioTek）。

1.2 BMP/Gel/SH-Ag 的制備及表征

1.2.1 光交聯(lián)明膠的制備 將10 g 明膠溶解在 100 mL 磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）。待明膠完全溶解后，在60 ℃下，向錐形瓶內(nèi)逐滴加入8 mL 甲基丙烯酸酐，滴加過程持續(xù)0.5 h。滴加結(jié)束2 h 后，將預(yù)熱至50 ℃的400 mL PBS 加入錐形瓶中稀釋溶液以停止反應(yīng)，再持續(xù)攪拌30 min。之后將錐形瓶內(nèi)的液體倒入透析袋中（截留相對分子質(zhì)量8 000 ～14 000），透析2 周。 收集透析袋內(nèi)的液體，冷凍干燥得到修飾后的光交聯(lián) 明膠。

1.2.2 光交聯(lián)明膠微球的制備 微流控技術(shù)用于制備負載BMP-2 的光交聯(lián)明膠微球（圖1）。簡而言之，制備明膠微球，向10.0%（質(zhì)量分數(shù)）的光交聯(lián)明膠溶液加入2.5%的BMP-2，再加入1.0% 2-羥基-4′-（2-羥基乙氧基）-2-甲基苯丙酮（光引發(fā)劑） 和0.25%的海藻酸鈉作為分散相，含有15.0%山梨醇酐單油酸酯的肉豆蔻酸異丙酯作為連續(xù)相。將2 種相分別注入微通道，分散相形成單分散液滴。調(diào)節(jié)分散相和連續(xù)相的流速以獲得直徑約350 μm 的液滴。收集的油包水型乳狀液在紫外光（365 nm）照射15 s 后聚合成光交聯(lián)明膠微球（圖1）。

1.2.3 BMP/Gel/SH-Ag 的 制 備 稱 取4SH-PEG 10 mg，溶 解 于50 μL 去 離 子 水，再 加 入40 μL 負 載BMP-2 的光交聯(lián)明膠微球。將30 μL 硝酸銀溶液（0.1 mol/L）用20 μL 去離子水稀釋。將2 種液體混合，其在數(shù)秒后形成負載光交聯(lián)明膠微球的水凝膠BMP/Gel/SH-Ag（圖1）。稱取4SH-PEG 10 mg，溶解于50 μL 含有1 mg BMP-2 的去離子水中，再與硝酸銀溶液混合，以類似方式制備負載BMP-2 的水凝膠BMP/SH-Ag。

圖1 BMP/Gel/SH-Ag 形成的示意圖Fig 1 Schematic formation of BMP/Gel/SH-Ag

1.2.4 BMP/Gel/SH-Ag 的表征 利用SEM 對冷凍干燥后的水凝膠進行評價。切取冷凍干燥2 d 的厚度為2 mm 的水凝膠片，固定在導(dǎo)電板上，采用離子濺射儀對其進行45 s 噴金處理，最后利用SEM 采集圖像。為了考察BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag 的釋藥行為，將每組3 個樣品浸沒于PBS 中，于轉(zhuǎn)速為100 轉(zhuǎn)/min、37 ℃的搖床中進行藥物釋放實驗。溫育1、2、4、6、8 d 取釋放介質(zhì)，用ELISA 試劑盒測定BMP-2 的釋放量。用1 mL 注射器（針頭直徑0.5 mm）注射攜帶紅色鋼筆墨水的BMP/Gel/SHAg，觀察BMP/Gel/SH-Ag的可注射性。用瓊脂擴散法測試水凝膠抗菌性能。將100 μLS. aureus和100 μLE. coli[吸光度值D（600 nm）約0.07]分別分散到LB 瓊脂平板上。分別將BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag 置于瓊脂平板上并在37 ℃下溫育24 h，每組3 個樣品，觀察水凝膠樣品周圍的細菌環(huán)并于24 h 測定抑菌環(huán)直徑。

1.3 細胞實驗

1.3.1 CCK-8 收 集BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag 的 浸出液，加至鋪有BMSCs 的96 孔板中（5 000 個/孔），分別于第1、3、5 日去除培養(yǎng)液，用PBS 洗滌2 次，每孔加入100 μL 培養(yǎng)基和10 μL CCK-8 試劑，放入培養(yǎng)箱避光孵育2 h。酶標儀450 nm 波長下檢測吸光度值[D（450 nm）]。以使用α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的BMSCs 作為對照組。每組3個樣品。

1.3.2 活/死細胞染色 使用BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag 的 浸 出 液 于24 孔 板 中 培 養(yǎng)BMSCs（30 000 個/孔）。以使用α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的BMSCs 作為對照組。每組3 個樣品。培養(yǎng)1 d 后，去除培養(yǎng)液，用PBS 洗滌3 次。 將5 μL 鈣黃綠素和20 μL 溴乙非啶豪莫二聚體分別加入10 mL PBS，配制成活/死細胞染色溶液。將200 μL 活/死細胞染色溶液加入每孔中，室溫避光孵育30 min，去除染色溶液，PBS 洗滌2 次，用熒光顯微鏡采集圖像。

1.3.3 ALP 測定 將大鼠BMSCs 接種在24 孔Transwell板中（30 000 個/孔），并加入α-MEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。1 d 后，分別將BMP/Gel/SH-Ag、BMP/SH-Ag 放于Transwell 板的上室中，不加入水凝膠材料的BMSCs 作為對照組，每組3 個樣品，并用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基替代α-MEM 培養(yǎng)基。14 d 后，PBS 洗滌2 次，無水乙醇于室溫下固定細胞30 min，去離子水洗滌3 次，加入ALP 染色液。在室溫下避光孵育30 min 后，去離子水洗滌，用光學(xué)顯微鏡采集圖像。

1.3.4 茜素紅S 染色 將大鼠BMSCs 接種在24 孔Transwell 板中（30 000 個/孔），并加入α-MEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。1 d 后，將BMP/Gel/SH-Ag、BMP/SH-Ag 放于Transwell 板的上室中，不加入水凝膠材料的BMSCs 作為對照組，每組3 個樣品，并用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基替代α-MEM 培養(yǎng)基。21 d 后，PBS 洗滌2 次，無水乙醇于室溫下固定細胞 30 min，去離子水洗滌3 次，加入茜素紅S 染色液。在室溫下孵育10 min 后，去離子水洗滌2 次，用顯微鏡采集圖像。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMP/Gel/SH-Ag 的考察

2.1.1 BMP/Gel/SH-Ag 的外觀、微觀結(jié)構(gòu)和藥物釋放 光交聯(lián)明膠微球外表光滑，粒徑分布均勻（～350 μm）（圖2A）。將稀釋后的硝酸銀溶液加入4SH-PEG 溶液中， 2 種溶液在數(shù)秒后形成淡黃色的BMP/Gel/SH-Ag（圖2B）。SEM 結(jié)果顯示，BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag 都呈現(xiàn)孔洞狀的微觀結(jié)構(gòu)，孔徑為50 ～150 μm（圖2C、2D）。在藥物釋放考察中，BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag 在第8 日分別釋藥（81.8±3.6）%和（84.4±3.2）%（圖2E）。相較于BMP/SH-Ag，BMP/Gel/SH-Ag 具有更好的緩釋效果。

圖2 光交聯(lián)明膠微球及BMP/Gel/SH-Ag 形態(tài)和藥物釋放Fig 2 Morphology of photocrosslinked gelatin microspheres and BMP/Gel/SH-Ag and the drug release profile

2.1.2 BMP/Gel/SH-Ag 的可注射性 BMP/Gel/SH-Ag 可以用針頭直徑小至0.5 mm 的1 mL 注射器來注射，以產(chǎn)生水凝膠細絲（圖3），從而能夠較好地填充骨感染區(qū)域。

圖3 紅色墨水染色的BMP/Gel/SH-Ag 水凝膠的注射性Fig 3 Injectability of red ink-dyed BMP/Gel/SH-Ag

2.1.3 BMP/Gel/SH-Ag 的抗菌性能 BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag 分別置于涂有S. aureus和E. coli的瓊脂板1 d 后，均出現(xiàn)了抑菌環(huán)，表明BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag 對S. aureus（圖4A、B）和E. coli（圖4D、E）有抑制作用。BMP/SH-Ag 的抗菌效果與BMP/Gel/SH-Ag 相當(dāng)，抑菌環(huán)直徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖4C、F）。

圖4 BMP/Gel/SH-Ag 及BMP/SH-Ag 的抗菌性能Fig 4 Antibacterial properties of BMP/Gel/SH-Ag and BMP/SH-Ag

2.2 BMP/Gel/SH-Ag 的生物相容性

為了研究BMP/Gel/SH-Ag 的生物相容性，使用CCK-8 實驗考察BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag 浸出液對BMSCs 增殖的影響。CCK-8 結(jié)果顯示，在第1、3、5日，BMP/Gel/SH-Ag 組和BMP/SH-Ag 組的吸光度值略低于對照組，但各組吸光度值之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖5A）。觀察BMSCs 存活情況，發(fā)現(xiàn)BMP/Gel/SH-Ag 組、BMP/SH-Ag 組和對照組的細胞生長狀態(tài)良好（圖5B），進一步證明了BMP/Gel/SH-Ag 的生物安全性。

圖5 BMP/Gel/SH-Ag 及BMP/SH-Ag 的生物相容性Fig 5 Biocompatibility of BMP/Gel/SH-Ag and BMP/SH-Ag

2.3 BMP/Gel/SH-Ag 的促成骨分化

采用ALP 染色和茜素紅S 染色對BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag 的促成骨分化能力進行評價。ALP 染色越深，表示其活性越高。BMSCs 在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后，BMP/Gel/SH-Ag 組的ALP 活性高于BMP/SH-Ag 組和對照組（圖6），表明BMP/Gel/SH-Ag 的促成骨能力要強于BMP/SH-Ag。

圖6 BMSCs 的ALP 染色情況Fig 6 ALP staining images of the BMSCs

在成骨分化后期，成骨細胞分泌礦化基質(zhì)，形成的鈣結(jié)節(jié)可被茜素紅S 染成橘紅色。BMSCs 在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d 后，BMP/Gel/SH-Ag 組的鈣結(jié)節(jié)水平高于BMP/SH-Ag 組和對照組 （圖7），表明BMP/Gel/SH-Ag 的促成骨分化能力高于BMP/SH-Ag。

圖7 BMSCs 的茜素紅S 染色情況Fig 7 Alizarin red staining images of the BMSCs

3 討論

本研究基于Ag+和-SH 之間的配位反應(yīng)，制備了一種4SH-PEG 和Ag+交聯(lián)的PEG 水凝膠。然而，單純負載BMP-2 的水凝膠無法延緩BMP-2 釋放，導(dǎo)致BMP-2 的生物利用度降低。因此，在PEG 水凝膠中復(fù)合了裝載有BMP-2 的光交聯(lián)明膠微球，利用微球水凝膠的緩釋作用在局部持續(xù)遞送BMP-2 以促進感染性骨損傷的修復(fù)。

微球是指藥物分散在成球材料中，形成的骨架型微小球形微粒，可以供注射、口服、滴鼻或皮下埋植使用[14]。根據(jù)其制備材料的不同，分為天然高分子微球、合成高分子微球和無機微球。由于廣泛分布于自然界且具有良好的生物相容性，天然高分子成為備受歡迎的制備微球的材料。常用天然高分子材料包括多糖、明膠、類聚異戊二烯、聚酯、聚酚。明膠是動物結(jié)締組織或表皮組織中的膠原降解的產(chǎn)物，具有非常低的抗原性[15]。分子內(nèi)部含有豐富精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，RGD）序列，對細胞的黏附和遷移有促進作用[16]。因此，明膠微球不但可以發(fā)揮藥物載體的作用，還可以促進細胞黏附和遷移。目前，明膠微球可以負載藥物、生長因子和細胞。Kudva 等[17]通過明膠微球負載轉(zhuǎn)化生長因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）在體外促進軟骨形成。Zhao 等[18]通過制備負載BMSCs 的明膠微球促進成骨；明膠微球可在靶部位釋放至BMSCs，并促進其分化。因此，明膠微球已經(jīng)成為一種極具吸引力的生物醫(yī)用材料。

微流控技術(shù)比傳統(tǒng)的機械攪拌乳化技術(shù)更具優(yōu)越性。本研究用甲基丙烯酸酐與明膠中的氨基進行化學(xué)反應(yīng)，合成了光交聯(lián)明膠，并用微流控裝置制備了負載BMP-2 的明膠微球。該微流控裝置產(chǎn)生的液滴具有高度的單分散性和大小可控的特點。光交聯(lián)明膠溶液和油相的流速是控制微球尺寸的重要因素。通過改變光交聯(lián)明膠溶液與油相速率的比值可調(diào)節(jié)明膠微球粒徑的大小。對于負載藥物的微球載體而言，微球的粒徑越大，藥物緩釋效果越好。Zhao 等[18]制備負載BMSCs 的明膠微球。其選擇163 μm的微球尺寸是為了平衡2 個要求：尺寸大于60 μm，可確保有足夠數(shù)量的封裝細胞以促進細胞接觸和增殖[19]；小于200 μm，可允許通過水凝膠隨時進行氧氣交換，以實現(xiàn)細胞的長期存活[20]。而本研究采用的尺寸 （約350 μm）是為了確保單個微球能夠負載足量的BMP-2 以提升緩釋效果。

本研究將稀釋后的Ag+溶液加入負載光交聯(lián)明膠微球的4SH-PEG 溶液中，2 種溶液在數(shù)秒后形成BMP/Gel/SHAg。其機制可能是通過Ag-S 和二硫鍵的作用，形成了相互交錯的水凝膠網(wǎng)絡(luò)[21]。BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag都呈現(xiàn)孔洞狀結(jié)構(gòu)，孔徑相對較大，可能是由于內(nèi)部化學(xué)交聯(lián)程度不高所致。BMP/Gel/SH-Ag 可以用注射器注射來產(chǎn)生水凝膠細絲，具有優(yōu)良的可注射性，能通過微創(chuàng)的方式更好地填充骨感染區(qū)域。但是當(dāng)注射的水凝膠面臨恒定的機械力時，可能導(dǎo)致變形或損壞。在這種情況下，擁有自我修復(fù)功能的水凝膠將擁有更長的應(yīng)用壽命[22]。Cai等[23]通過雙重交聯(lián)的方法制備了一種負載干細胞的可注射水凝膠來提高細胞的存活率。當(dāng)水凝膠被注射時，星形多肽-聚乙二醇共聚物與工程重組蛋白組裝形成的物理網(wǎng)絡(luò)會被破壞；但當(dāng)注射完成后，物理網(wǎng)絡(luò)能夠重新形成。而BMP/Gel/SH-Ag 可能可以通過恢復(fù)損傷的水凝膠碎片來實現(xiàn)自愈合。此外，這種水凝膠還可以允許醫(yī)師在預(yù)先不知道缺損的情況下填充復(fù)雜的形狀，例如，其可應(yīng)用于復(fù)雜骨折的治療[24]。這可能是因為當(dāng)BMP/Gel/SH-Ag 水凝膠受到剪切力時，Ag+與SH 的配位鍵會斷裂；而當(dāng)剪切力消失時，Ag+與SH 的配位鍵重新恢復(fù)。

BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag 對S. aureus和E. coli均有抑制作用。這是由于BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag釋放的Ag+能夠干擾細菌膜通透性、抑制呼吸酶活性和使DNA 分子凝聚[25]。Guo 等[26]通過Ag+交聯(lián)鞣酸（tannin）制備一種可注射的抗菌黏性水凝膠。因為Ag+在水凝膠中不僅用作抗菌劑，而且還用作水凝膠的交聯(lián)劑，使得水凝膠具有優(yōu)良的抗菌性能和生物相容性。Tian 等[27]用無毒抗菌劑（Fe3+）與乙二胺四乙酸交聯(lián)透明質(zhì)酸制備了可自愈合的抗菌水凝膠。作為交聯(lián)劑的一部分，F(xiàn)e3+可填充整個水凝膠，大大提高了抗菌劑的負載量，延長了抗菌劑的有效期，使水凝膠能夠持續(xù)釋放抗菌劑，直到水凝膠被完全分解。BMP/Gel/SH-Ag 中的Ag+同樣作為水凝膠的抗菌劑和交聯(lián)劑。將抗菌的金屬離子作為水凝膠的交聯(lián)劑不僅可以提高抗菌劑的負載量，提高抗菌性能，而且還可以延長抗菌的有效期。這是由于金屬離子與其他化合物的化學(xué)鍵作用限制了金屬離子的釋放。因此，BMP/Gel/SH-Ag是具有優(yōu)良的抗菌性能的骨修復(fù)生物材料。

作為促成骨和抗感染的生物材料，BMP/Gel/SH-Ag 的生物相容性十分重要。而BMP/Gel/SH-Ag 中的Ag+有較低的生物毒性，同時也有研究[28]表明當(dāng)Ag+在涂層中的裝載量低于9.0 μg/cm2時，材料無細胞毒性。本研究中，BMP/Gel/SH-Ag 裝載的Ag+遠低于這一細胞毒性閾值。此外，Ag+還用作水凝膠的交聯(lián)劑。與直接在水凝膠中裝載Ag+相比， BMP/Gel/SH-Ag 中的Ag+與4SH-PEG 結(jié)合，導(dǎo)致Ag+釋放較慢，降低了Ag+的毒性。4SH-PEG 本身良好的生物相容性也可能對此有所貢獻。CCK-8 和活/死細胞染色實驗結(jié)果印證了BMP/Gel/SH-Ag 對于BMSCs 沒有毒性作用。

盡 管BMP/Gel/SH-Ag 和BMP/SH-Ag 中BMP-2 的 裝載量一致，BMP/Gel/SH-Ag 組的ALP 表達量和產(chǎn)生的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量均高于BMP/SH-Ag 組。這些結(jié)果印證了BMP/Gel/SH-Ag 裝載光交聯(lián)明膠微球的緩釋作用提升了BMP-2的生物利用度。Li 等[29]研發(fā)了一種負載辛伐他汀微球的水凝膠系統(tǒng)，在體外釋放實驗的第3 日，未負載微球的水凝膠釋放近75%的藥物，而負載微球的水凝膠釋放近37%的藥物，表明微球可增強藥物的緩釋作用。而相較于BMP/SH-Ag、BMP/Gel/SH-Ag 的BMP-2 的釋放需要突破2 層屏障，首先BMP-2 要從微球釋放到水凝膠，然后釋放到水中。因此，BMP/Gel/SH-Ag 具有更好的緩釋效果。

綜上，本研究通過微流控技術(shù)制備負載BMP-2 的光交聯(lián)明膠微球；為了實現(xiàn)BMP-2 的緩釋，將光交聯(lián)明膠微球負載到4SH-PEG 和Ag+交聯(lián)的PEG 水凝膠中，制備出BMP/Gel/SH-Ag。體外試驗表明，BMP/Gel/SH-Ag 具有優(yōu)良的抗菌性能、可注射性、生物相容性和促成骨分化性能。因此，這種負載BMP-2 微球的可注射水凝膠在促成骨和抗感染方面有良好的表現(xiàn)，有望在骨髓炎的預(yù)防中發(fā)揮作用。

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