不同培養(yǎng)基配方對(duì)酸棗組培苗生長(zhǎng)的影響

盧登洋，楊彥強(qiáng)，張喬喬，閆芬芬，林彩霞*，吳翠云*

（1 塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院/兵團(tuán)南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工國(guó)家地方聯(lián)合工程研究室，新疆阿拉爾 843300；2 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所）

酸棗（Ziziphus acidojujuba C.Y.Cheng et M.J.Liu）為鼠李科（Rhamnaceae）棗屬（Ziziphus Mill.）植物，原產(chǎn)中國(guó)華北，又叫“野棗”[1]。酸棗是具廣闊開發(fā)利用前景的野生果樹資源，也是重要的中藥材資源，含有豐富的蛋白質(zhì)，鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)和多種維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)含有三萜烯酸、氯原酸、黃酮類化合物等藥用成分[2-5]。酸棗不僅可以綠化荒山，保持水土，還可作棗樹的砧木、育種的原始材料[6]。酸棗作為我國(guó)特有的生態(tài)經(jīng)濟(jì)型樹種，主要處于野生狀態(tài)，近年來出現(xiàn)了人工栽培的勢(shì)頭，但由于缺乏良種，嚴(yán)重限制了產(chǎn)業(yè)發(fā)展[7]。在此形勢(shì)下，酸棗組織培養(yǎng)則提供了快速培育良種苗木的有效途徑。近年來，科研工作者們對(duì)葡萄柚、黃連木、白芨、金線蓮、香樟的快速繁殖進(jìn)行了大量研究。關(guān)于酸棗組培快繁技術(shù)研究卻鮮見報(bào)道，因此快速培育良種苗木，是當(dāng)前亟需解決的重要科學(xué)問題。本研究以酸棗種子在離體培養(yǎng)條件下萌發(fā)的幼苗為外植體，研究不同培養(yǎng)基配方對(duì)不定芽誘導(dǎo)、增殖及生根的影響，為將來開展酸棗砧木育種及其無性系砧木的繁育提供條件，并為開展酸棗幼苗相關(guān)研究提供均一試驗(yàn)材料，為酸棗的快速繁育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)材料為9 月份采自山西省晉中的野生成熟酸棗果實(shí)。自然陰干后，置室內(nèi)干藏，在試驗(yàn)前3d 脫去果皮和種皮，同時(shí)取出種仁備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初代培養(yǎng)。酸棗種仁處理采用3 因素2 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，即自來水浸泡時(shí)間（12h、24h）、次氯酸鈉消毒濃度（1%、2%）和消毒的時(shí)間（10min、20min），采用全組試驗(yàn)，共計(jì)9 個(gè)處理，每處理接種6 瓶，每瓶接種酸棗種仁5 粒。每個(gè)處理接種量為30 粒種子。

選取大小一致，飽滿無損傷的酸棗種子，用自來水溶液浸泡，無菌水沖洗2～3 次，75%酒精浸泡30s，不同濃度次氯酸鈉溶液振蕩消毒處理，無菌水沖洗2～3 次，剝?nèi)シN皮后分別接種于MS 培養(yǎng)基中，置于25±2℃、2500Lx 光照強(qiáng)度和14h 光照10h 黑暗條件下培養(yǎng)。

在接種后第3d，應(yīng)用計(jì)數(shù)法分別查出每個(gè)處理的培養(yǎng)基中酸棗種子萌發(fā)的個(gè)數(shù)（以芽長(zhǎng)超過種子長(zhǎng)度的1/2 為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)）計(jì)算萌發(fā)率，以及每個(gè)處理的培養(yǎng)基中酸棗種子污染的個(gè)數(shù)，并計(jì)算污染率。

計(jì)算公式：萌發(fā)率（%）=萌發(fā)數(shù)/接種數(shù)×100；污染率（%）=污染數(shù)/接種數(shù)×100。

1.2.2 繼代培養(yǎng)。于初代培養(yǎng)酸棗無菌苗中選擇健壯單株，切取莖段置于MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L 培養(yǎng)基中進(jìn)行多代轉(zhuǎn)接，繁殖獲得150 株無性株系，將其分成5 組，分別轉(zhuǎn)接到5 個(gè)不同繼代培養(yǎng)基：S1：MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.1mg/L；S2：MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L；S3：MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1mg/L；S4：MS+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.5mg/L 和 S5：MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.1mg/L，每個(gè)處理接種30 株。接種后每隔5d 觀察幼苗生長(zhǎng)變化，數(shù)出葉片數(shù)，用直尺測(cè)量幼苗子葉到生長(zhǎng)點(diǎn)的高度，統(tǒng)計(jì)增殖數(shù)，并計(jì)算酸棗幼苗株高凈增加量、葉片數(shù)增加量和增殖數(shù)增加量。

計(jì)算公式：酸棗幼苗株高凈增加量=每次觀察株高-初始株高；酸棗幼苗葉片增加量=每次觀察葉片數(shù)-初始葉片數(shù)；酸棗幼苗增殖數(shù)增加量=每次觀察增殖數(shù)-初始增殖數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)。選擇繼代培養(yǎng)中健壯植株轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，設(shè)置6 個(gè)不同激素濃度的生根培養(yǎng)基：R1：1/2MS+IBA 0.1mg/L；R2：1/2MS+IBA 0.3mg/L；R3：1/2MS+IBA 0.5mg/L；R4：1/2MS+IBA 0.1mg/L+IAA 0.1mg/L；R5：1/2MS+IBA 0.3mg/L+IAA 0.1mg/L 和R6：1/2MS+IBA 0.5mg/L+IAA 0.1mg/L，每個(gè)處理30 株。轉(zhuǎn)接培養(yǎng)后，每隔5d 觀察幼苗生長(zhǎng)變化，數(shù)出葉片數(shù)，用直尺測(cè)量幼苗子葉到生長(zhǎng)點(diǎn)的高度，數(shù)出增殖數(shù)和根系數(shù)，計(jì)算酸棗幼苗株高凈增加量、葉片增加量和增殖數(shù)增加量，用根測(cè)儀測(cè)定酸棗根系長(zhǎng)度和根系粗度。

計(jì)算公式：酸棗幼苗株高凈增加量=每次觀察株高-初始株高；酸棗幼苗葉片增加量=每次觀察葉片數(shù)-初始葉片數(shù)；酸棗幼苗增殖數(shù)增加量=每次觀察增殖數(shù)-初始增殖數(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。使用Excel 2010 軟件對(duì)調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，DPS 作方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 初代培養(yǎng)中不同消毒處理對(duì)酸棗種仁滅菌效果的影響

由表1 可知，從萌發(fā)率來看，酸棗種仁在不同消毒處理下，萌發(fā)率差異不大。從污染率來看，處理5、6、7、8 的酸棗種仁污染率低于其他5 個(gè)處理，污染率最低為3.33%。從萌發(fā)率和污染率綜合分析來看，處理5 較好，其萌發(fā)率達(dá)到96.87%，污染率為3.33%，說明處理5 是最適宜初代培養(yǎng)中酸棗種仁滅菌的培養(yǎng)基。

表1 不同消毒處理對(duì)酸棗種仁滅菌效果的影響

2.2 繼代培養(yǎng)中不同培養(yǎng)基配方對(duì)酸棗幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 繼代培養(yǎng)中不同培養(yǎng)基配方對(duì)酸棗株高的影響。由圖1 可知，酸棗幼苗在不同繼代培養(yǎng)基配方下，株高增加量均隨著轉(zhuǎn)接天數(shù)增加呈上升趨勢(shì)，但各培養(yǎng)基配比間酸棗株高存在顯著差異。隨著轉(zhuǎn)接天數(shù)的增加，S2培養(yǎng)基中株高凈增長(zhǎng)量明顯高于其他培養(yǎng)基。且在轉(zhuǎn)接第25d 時(shí)，S2酸棗株高增加量是S3培養(yǎng)基配方中的1.18 倍，說明S2培養(yǎng)基有利于促進(jìn)酸棗幼苗株高的生長(zhǎng)。

圖1 培養(yǎng)基配方對(duì)酸棗株高凈增加量的影響

2.2.2 繼代培養(yǎng)中不同培養(yǎng)基配方對(duì)酸棗葉片的影響。由圖2 可知，在轉(zhuǎn)接后第10d，離體培養(yǎng)酸棗幼苗葉片增長(zhǎng)量在各培養(yǎng)基配方間無顯著性差異，轉(zhuǎn)接20d 之后，S1、S2、S3和S4、S5有顯著差異，轉(zhuǎn)接第25d 時(shí)，S2培養(yǎng)基中酸棗幼苗與葉片增長(zhǎng)量最高，而S5培養(yǎng)基中的最低，相差3.35 張。說明S2培養(yǎng)基配方有利于酸棗葉片的增長(zhǎng)。

圖2 培養(yǎng)基配方對(duì)酸棗葉片增加量的影響

2.2.3 繼代培養(yǎng)中不同培養(yǎng)基配方對(duì)酸棗增殖數(shù)的影響。不同繼代培養(yǎng)基配方中酸棗幼苗增殖數(shù)變化情況見表4，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，酸棗幼苗增殖數(shù)量逐漸上升，但各培養(yǎng)基配比間幼苗增殖數(shù)存在差異。在轉(zhuǎn)接25 d 時(shí)，S2培養(yǎng)基配方中酸棗幼苗增殖數(shù)增加量是S4培養(yǎng)基配方的1.41 倍，說明S2培養(yǎng)基有利于促進(jìn)酸棗幼苗分化生長(zhǎng)。

由圖1～3 綜合比較可知，雖然S1培養(yǎng)基配方中酸棗幼苗葉片增加量略高于S2，但從繼代培養(yǎng)的叢生芽數(shù)來看，研究認(rèn)為S2培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L 是最適宜快速繁殖酸棗幼苗的繼代培養(yǎng)基。

圖3 培養(yǎng)基配方對(duì)酸棗幼苗增殖數(shù)的影響

2.3 生根培養(yǎng)中不同培養(yǎng)基配方對(duì)酸棗生長(zhǎng)的影響

由表2 可知，從激素類型來看，只附加IAA 的培養(yǎng)基生根率明顯低于附加了IAA 和IBA 的生根率。從生根率、平均根數(shù)和平均根長(zhǎng)綜合比較分析，IAA 0.3mg/L 的培養(yǎng)基上，雖然生根率達(dá)到76.67%，但由于根部愈傷組織較大，生根數(shù)較少，且著生在愈傷組織上，出苗時(shí)易脫落，易造成成活率低。而在附加IAA 0.1mg/L 和IBA 0.5mg/L 的培養(yǎng)基上，其生根率達(dá)到88.89%，生根數(shù)與平均根長(zhǎng)指數(shù)也較高。因此認(rèn)為1/2MS+IAA 0.1mg/L+IBA 0.5mg/L 培養(yǎng)基是酸棗快速繁殖生根培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

表2 生根培養(yǎng)基配方對(duì)酸棗根系生長(zhǎng)的影響

3 討論

在植物組織培養(yǎng)工作中，無菌外植體的獲取具有十分重要的意義。酸棗種子相對(duì)較小，操作較困難，滅菌和消毒不徹底易造成污染，最終會(huì)影響無菌幼苗的繁殖。對(duì)于種子滅菌，魯松等[8]采取了2 因素3 水平完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置75%酒精（處理時(shí)間30s、45s、60s）、0.1%HgCl2（處理時(shí)間8min、10min、15min）各3 個(gè)水平來達(dá)到有效滅菌的目的。研究通過3 因素2 水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，3 因素2 水平試驗(yàn)方案為自來水浸泡時(shí)間（12h、24h）、次氯酸鈉消毒濃度（1%、2%）和消毒時(shí)間（10min、20min）來控制污染，這與魯松等采用的滅菌方法相比，更簡(jiǎn)便，成本更低，更適合酸棗無菌苗的快速繁殖。

在繼代培養(yǎng)中，6-BA 和IBA 的組合使用比較常見[9-10]。葉維雁等[11]在誘導(dǎo)培養(yǎng)研究中認(rèn)為，6-BA 最佳濃度為0.5mg/L，高于該濃度的處理其誘導(dǎo)能力下降。研究結(jié)果表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基中添加少量的IBA（0.1mg/L），增殖系數(shù)較高，與葉維雁等[11]的研究結(jié)果不一致。葉曉青研究表明[12]，可以通過降低細(xì)胞分裂素濃度來維持較高的平均繁殖系數(shù)，同時(shí)又保持較好的生長(zhǎng)勢(shì)，因此有待進(jìn)一步研究。馬媛春[13]研究認(rèn)為繼代的次數(shù)不一定是越多越好，隨著繼代次數(shù)的增加，組培苗體內(nèi)的激素也會(huì)慢慢積累，從而抑制組培苗增殖。因此在研究酸棗組培苗繼代時(shí)，定期對(duì)繼代的組培苗進(jìn)行更換培養(yǎng)基，或者及時(shí)進(jìn)行再次初代培養(yǎng)，從而避免了這方面問題。

在大部分生根研究中，生根的基本培養(yǎng)基均采用1/2MS 培養(yǎng)基[14-15]，即降低無機(jī)鹽的濃度，沈春修[16]在長(zhǎng)壽花的快速繁殖體系中也提到了低鹽濃度的培養(yǎng)基有利于根的生長(zhǎng)，生長(zhǎng)素對(duì)根的生長(zhǎng)效應(yīng)較明顯。因此，本研究仍采用低鹽的1/2MS 培養(yǎng)基進(jìn)行生根研究，并附加不同濃度的IAA 和IBA 誘導(dǎo)根的形成。其中歐陽(yáng)磊[17]認(rèn)為添加IBA 0.5mg/L 的生根培養(yǎng)基上杉木的生根率較高，生根時(shí)間較短，出根早、根系生長(zhǎng)健壯，而且根長(zhǎng)適中。而王力等[18]研究認(rèn)為興化龍香芋不定芽誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.5mg/L+6-BA 0.2mg/L 活性炭+30g/L 蔗糖。研究在附加IAA0.1mg/L和IBA0.5mg/L 的培養(yǎng)基上，生根率達(dá)到88.89%，生根數(shù)與平均根長(zhǎng)指數(shù)也較高。與歐陽(yáng)磊等[17]的結(jié)果不一致，可能是樹種不同而引起的差異。生根培養(yǎng)中葉片數(shù)增加量和增殖數(shù)增加量在15～20d 中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)的原因是酸棗植株未生根前從培養(yǎng)基中吸收的養(yǎng)分不足，導(dǎo)致生長(zhǎng)點(diǎn)干枯。待根系長(zhǎng)出后，從培養(yǎng)基中吸取養(yǎng)分從而長(zhǎng)出新的生長(zhǎng)點(diǎn)。

4 結(jié)論

綜上所述，酸棗種子經(jīng)預(yù)處理后，用自來水浸泡12h，75%酒精消毒30s，1%和2%的次氯酸鈉各振蕩10min，剝?nèi)シN皮的消毒效果較好，污染率為3.30%，成活率為96.60%；叢生芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L；最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IAA 0.1mg/L+IBA 0.5mg/L，生根率是88.89%。該研究篩選獲得了酸棗組織培養(yǎng)的最佳外植體及各培養(yǎng)階段的最佳培養(yǎng)基配方，研究結(jié)果能有效提高愈傷組織誘導(dǎo)成功率、縮短種苗生產(chǎn)周期。