綠豆蛋白超聲微波協(xié)同提取工藝技術(shù)研究

李朝陽，刁靜靜，李良玉

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)/國家雜糧工程技術(shù)研究中心，大慶 163319）

綠豆（Vigna radiata（L.）Wilczek）是我國主要的雜糧作物之一，并具有著悠久的種植和食用歷史，中醫(yī)認(rèn)為其具有活血利水、清熱解毒等功效，經(jīng)現(xiàn)代分析技術(shù)檢測綠豆中含有豐富的蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素、礦物質(zhì)以及人體所需的必要氨基酸[1-2]，其中蛋白質(zhì)含量可達(dá)19.5%～33.1%[3]。目前，國內(nèi)對綠豆的生產(chǎn)加工主要為綠豆淀粉和綠豆粉絲的生產(chǎn)，生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物綠豆蛋白多作為生產(chǎn)廢料或畜牧飼料，這樣既造成了資源浪費(fèi)又污染了環(huán)境[4-7]。近幾年科研人員越來越多關(guān)注蛋白肽的研究，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取的研究也越來越多。在日常生活中綠豆產(chǎn)品主要有綠豆糕、綠豆掛面、綠豆餅、綠豆粉絲、綠豆淀粉等，這些產(chǎn)品主要是利用綠豆淀粉為原材料來生產(chǎn)的，對綠豆蛋白的研究以及采用綠豆蛋白為原料的食品相對較少?，F(xiàn)在提取蛋白質(zhì)的方法廣泛使用傳統(tǒng)堿液水提法，雖然這種方法有工藝簡單，制得的蛋白質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但存在著提取率低和能耗高的弊端[8-9]。目前，蛋白質(zhì)的高效提取主要采取堿溶酸沉法[10]、超聲波法[11]以及超聲微波協(xié)同萃取法[12]，其中超聲微波協(xié)同萃取技術(shù)是今年來發(fā)展較快的一種輔助提取技術(shù)，具有提取率高、提取時(shí)間短、能耗低等優(yōu)勢，目前已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性物質(zhì)提取方面。在此背景下，研究以綠豆為原料，采用超聲微波協(xié)同萃取技術(shù)對提取綠豆中的蛋白質(zhì)，并對提取的條件進(jìn)行優(yōu)化，分別對提取溫度、提取時(shí)間、微波功率以及料液比提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合綠豆淀粉生產(chǎn)工藝，在不影響綠豆淀粉生產(chǎn)的前提下，以期獲得最佳的綠豆蛋白超聲微波協(xié)同提取工藝，可為綠豆蛋白的高效提取與利用提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

綠豆（蛋白含量24.2%）：國家雜糧工程技術(shù)研究中心種質(zhì)資源庫提供；NaOH（分析純）、HCl（分析純）：購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州榮冠實(shí)驗(yàn)分析儀器廠；pH計(jì)：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；超低溫冰箱：美國Thermo公司；H-04140007冷凍干燥機(jī)：丹麥SCANVAC公司。DR6000紫外可見光分光光度計(jì)：HACH；超聲微波處理機(jī)CW2000：北京金洋萬達(dá)科技有限公司；酸度計(jì)S220K：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綠豆總蛋白的提取過程

取一定質(zhì)量的綠豆，挑選、清洗、烘干，將烘干后的綠豆粉碎過100目篩，過篩后的綠豆粉以料液比20 mL·g-1加入容器中，在處理溫度35℃、超聲頻率24 KHz、微波功率300 W的條件下處理20 min，處理結(jié)束后，溶液為綠豆蛋白的粗提液，通過離心的方式將固液分離，調(diào)節(jié)pH至4.3使蛋白質(zhì)沉淀，將蛋白質(zhì)凍干處理，獲得蛋白質(zhì)粗粉[13]。

1.3.2 綠豆蛋白的測定方法

采用考馬斯亮藍(lán)方法測定。

1.3.3 單因素試驗(yàn)方法[14-15]

1.3.3.1 微波功率對綠豆蛋白提取的影響

為研究不同微波功率對綠豆蛋白提取效果的影響，稱取綠豆粉10 g，按照液料比20 mL·g-1加入去離子水，調(diào)pH至9.5，提取溫度35℃，提取時(shí)間20 min，微波功率分別為 100、200、300、400、500 W，每個(gè)水平做3次平行實(shí)驗(yàn)，以綠豆蛋白提取的工藝路線步驟進(jìn)行試驗(yàn)，按照得到綠豆蛋白量與原料量的比值計(jì)算綠豆蛋白得率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出綠豆蛋白得率與微波功率之間的關(guān)系曲線圖，分析綠豆蛋白得率隨著微波功率變化的規(guī)律。

1.3.3.2 提取溫度對綠豆蛋白提取的影響

為研究不同取溫度對綠豆蛋白提取效果的影響，稱取綠豆粉10 g，按照液料比20 mL·g-1加入去離子水，微波功率300 W，調(diào)pH至9.5，提取時(shí)間20 min，提取溫度分別為 25、30、35、40、45 ℃，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，以綠豆蛋白提取的工藝路線步驟進(jìn)行試驗(yàn)，按照得到綠豆蛋白量與原料量的比值計(jì)算綠豆蛋白得率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出綠豆蛋白得率與提取溫度之間的關(guān)系曲線圖，分析綠豆蛋白得率隨著溫度變化的規(guī)律。

1.3.3.3 提取時(shí)間對綠豆蛋白提取的影響

為研究不同提取時(shí)間對綠豆蛋白提取效果的影響，稱取綠豆粉10 g，按照液料比20 mL·g-1加入去離子水，微波功率300 W，調(diào)pH至9.5，提取溫度35℃，提取時(shí)間分別為 10、15、20、25、30 min，每個(gè)水平做3個(gè)平行樣，以綠豆蛋白提取的工藝路線步驟進(jìn)行試驗(yàn)，按照得到綠豆蛋白量與原料量的比值計(jì)算綠豆蛋白得率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出綠豆蛋白得率與提取時(shí)間之間的關(guān)系曲線圖，分析綠豆蛋白得率隨著時(shí)間變化的規(guī)律。

1.3.3.4 液料比對綠豆蛋白提取的影響

為研究不同液料比對綠豆蛋白提取效果的影響，稱取綠豆粉10 g，微波功率300 W，調(diào)節(jié)pH至9.5，提取溫度35℃，提取時(shí)間20 min，液料比分別為5、10、15、20、25 mL·g-1，每個(gè)水平做 3 個(gè)平行樣，以綠豆蛋白提取的工藝路線步驟進(jìn)行試驗(yàn)，按照得到綠豆蛋白量與原料量的比值計(jì)算綠豆蛋白得率，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制出綠豆蛋白得率與提取液料比之間的關(guān)系曲線圖，分析綠豆蛋白得率隨著液料比變化的規(guī)律。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方法

在上述研究的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取過程，以綠豆蛋白得率為Y，分別設(shè)置微波功率（W）為 X1，提取溫度（℃）為 X2，提取時(shí)間（min）為 X3，液料比（mL·g-1）為 X4，試驗(yàn)因素水平編碼表見表 1。

表1 因素水平編碼表Table1 Coding table of factor levels

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 微波功率對綠豆蛋白提取的影響

圖1為不同微波功率對綠豆蛋白得率的影響，由圖可知，微波功率逐漸增加，綠豆蛋白的得率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，當(dāng)微波功率為300 W時(shí)蛋白的得率最大16.58%，但隨著微波功率的繼續(xù)增加，綠豆蛋白質(zhì)的得率下降程度變化不明顯，這是由于微波功率增大增加了微波的熱效應(yīng)，使溶劑分子的運(yùn)動(dòng)速度加快，使原料中的蛋白質(zhì)更快的從溶質(zhì)體系中脫離出來；但當(dāng)微波功率過高時(shí)，微波產(chǎn)生的熱效應(yīng)也會(huì)隨之增加，可能會(huì)導(dǎo)致部分綠豆蛋白結(jié)構(gòu)破壞，從而導(dǎo)致綠豆蛋白得率降低[12]，所以采用超聲微波技術(shù)提取綠豆蛋白時(shí)微波功率應(yīng)適當(dāng)增加不宜過高，過高或過低都會(huì)影響綠豆蛋白的提取。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究微波功率選擇為300 W為最佳。

圖1 不同微波功率與綠豆蛋白提取的關(guān)系Fig.1 Relationship between different power and mung bean protein

2.1.2 處理溫度對綠豆蛋白提取的影響

圖2為不同處理溫度對綠豆蛋白提取效果的影響。由圖可知，隨著處理溫度的不斷上升，綠豆蛋白得率呈顯著先增加后降低的趨勢，在35℃時(shí)綠豆蛋白得率達(dá)到峰值17.26%，隨后呈下降趨勢。這是因?yàn)殡S著處理溫度的升高，溶劑的溶解能力和溶解速度也隨之提高，溶劑擴(kuò)散率和傳質(zhì)效果增加，綠豆蛋白分子運(yùn)動(dòng)速度也隨之提高，在曲線中表現(xiàn)出來的是溶劑和綠豆蛋白分子在尋求互相融合的速度及能力的平衡過程，最終到達(dá)35℃時(shí)兩者到達(dá)最佳平衡狀態(tài)[16]。當(dāng)處理溫度超過35℃時(shí)，蛋白得率趨于平衡，并略有下降，這是因?yàn)楫?dāng)微波溫度過高時(shí)，導(dǎo)致部分綠豆蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致綠豆蛋白得率降低，所以綠豆蛋白的提取溫度不宜過高，適當(dāng)?shù)臏囟瓤纱龠M(jìn)蛋白質(zhì)的提取，溫度過高不利于綠豆蛋白質(zhì)的提取。因此，處理溫度選擇35℃為中心點(diǎn)進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

圖2 不同處理溫度與綠豆蛋白提取的關(guān)系Fig.2 Relationship between different temperature and mung bean protein

2.1.3 處理時(shí)間對綠豆蛋白提取的影響

圖3為不同處理時(shí)間對綠豆蛋白得率的影響，由圖可知，隨著處理時(shí)間的逐漸增加，綠豆蛋白的得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)處理時(shí)間為15 min時(shí)，綠豆蛋白得率最大17.42%；隨著時(shí)間的繼續(xù)增加，綠豆蛋白的得率逐漸下降，這是由于隨著處理時(shí)間的延長，溶劑和溶質(zhì)可以達(dá)到充分交換，但當(dāng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，溶質(zhì)中的蛋白質(zhì)不再繼續(xù)溶出，之后，隨著處理時(shí)間的增加以及超聲的熱效應(yīng)及空化作用增強(qiáng)，導(dǎo)致影響了蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，甚至?xí)?dǎo)致蛋白部分變性，影響綠豆蛋白的得率[17]，所以綠豆蛋白提取時(shí)間不宜過長，否則不僅會(huì)影響蛋白質(zhì)的提取率，還會(huì)降低蛋白質(zhì)品質(zhì)。因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間選擇15 min。

圖3 不同處理時(shí)間與綠豆蛋白提取的關(guān)系Fig.3 Relationship between different time and mung bean protein

2.1.4 液料比對綠豆蛋白提取的影響

圖4為不同超聲料液比對綠豆蛋白得率的影響。由圖可知，隨著料液比的逐漸增加，綠豆蛋白得率呈先升高后降低的趨勢，在料液比為15 mL·g-1時(shí)，綠豆蛋白得率最高17.83%，當(dāng)超過15 mL·g-1時(shí)，綠豆蛋白得率呈現(xiàn)下降趨勢，這是因?yàn)檫m當(dāng)增加料液比，此時(shí)溶劑量足夠大，溶劑可與溶質(zhì)充分接觸，增大了傳質(zhì)速率，從而使蛋白得率升高，但當(dāng)料液比過高時(shí)，溶液粘度增大，使蛋白質(zhì)溶出時(shí)阻力加大，導(dǎo)致蛋白質(zhì)得率降低[18]。因此料液比選擇15 mL·g-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同超聲液料比與綠豆蛋白提取的關(guān)系Fig.4 Relationship between different ratio of material to water and mung bean protein

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果與分析

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以X1（微波功率），X2（提取溫度），X3（提取時(shí)間），X4（液料比）為自變量X，以綠豆蛋白吸光度值為Y，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)[19]，結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)安排表以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Scheme and results of regression orthogonal rotary design

續(xù)表2 試驗(yàn)安排表以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Continued table 2 Scheme and results of regression orthogonal rotary design

表3 回歸方程的方差分析表Table 3 ANOVA of regression equation

由表3可以看出：回歸模型P＜0.01，而失擬項(xiàng)的P＞0.05，說明該模型擬和結(jié)果較好。一次項(xiàng)、二次項(xiàng)P＜0.01，交互項(xiàng)P＜0.05，說明各項(xiàng)均不同程度影響綠豆蛋白的得率。

表4 二次回歸模型參數(shù)表Table 4 Parameters of quadratic regression

以綠豆蛋白的得率為Y值，得出X1微波功率，X2處理溫度，X3處理時(shí)間，X4液料比的X的回歸方程為：

Y=-456.36+0.301 9X1+14.721 7X2+17.246 7X3+2.363 7X4-0.000 476X12+0.001 59X1X2-0.003 75X1X3+0.001 1X1X4-0.122X22-0.303 4X2X3-0.090 6X2X4-0.227 8X32+0.129X3X4-0.040 8X42

2.3 交互作用分析

根據(jù)回歸方程的方程分析結(jié)果對交互作用顯著的交互項(xiàng)進(jìn)行交互作用分析，分析交互作用顯著的兩因素對綠豆蛋白提取的影響。圖5是SAS8.2軟件繪出三維曲面及其等高線圖，對這些因素中交互項(xiàng)之間的交互效應(yīng)進(jìn)行分析。

圖5 Y=f（X2，X3）的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖Fig.5 Responsive surfaces plot and its contour map of Y=f（X2，X3）

由圖5可以看出，響應(yīng)曲面坡度相對較大，等高線呈橢圓形，表明X2，X3兩者交互作用顯著。由等高線可知，沿X2方向等高線密集，而X3方向等高線相對稀疏，說明X2相對于X3對響應(yīng)值峰值的影響大，通過響應(yīng)曲面及等高線圖可以看出兩個(gè)存在交互作用，與數(shù)據(jù)分析結(jié)果一致。

2.4 最優(yōu)條件確定

為了進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)的值，采用SAS軟件的Rsreg語句對試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行響應(yīng)面典型分析，以獲得最大提取效果時(shí)的條件，最優(yōu)條件見表5。

表5 最優(yōu)提取條件及得率Table 5 Optimal extraction conditions and OD values

提取效果最高時(shí)的條件為：微波功率338 W，提取溫度37℃，提取時(shí)間15.6 min，料液比17.5 mL·g-1，該條件下理論最大的得率為19.57%。驗(yàn)證試驗(yàn)得到綠豆總蛋白的得率19.52%±0.13%，與理論值非常接近，可以看出建立的模型能夠較好的反映出超聲微波協(xié)同提取綠豆總蛋白的條件。有研究表明微波功率、處理溫度、處理時(shí)間以及料液比都是影響超聲微波提取綠豆蛋白的重要條件，微波功率的改變可增加溶劑環(huán)境中的熱效應(yīng)，從而強(qiáng)化了分子間的熱運(yùn)動(dòng)，增加了蛋白的提取效率，當(dāng)功率過大時(shí)，導(dǎo)致了部分蛋白質(zhì)變性，使蛋白質(zhì)得率降低[20]；處理溫度可直接影響溶劑和溶質(zhì)之間的傳遞速率，但當(dāng)溫度過高時(shí)，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)變性，從而降低了蛋白質(zhì)的得率；隨著處理時(shí)間持續(xù)延長，蛋白質(zhì)得率逐漸增加，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間時(shí)，蛋白溶出速率達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，隨著持續(xù)的高溫，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致了蛋白質(zhì)得率降低；不同的料液比主要影響溶劑和溶質(zhì)之間的傳質(zhì)速率，但當(dāng)溶質(zhì)過多時(shí)，會(huì)導(dǎo)致溶液粘度過大，阻滯了蛋白質(zhì)的溶出，使蛋白質(zhì)的得率降低[21]。

3 結(jié)論

對影響超聲微波協(xié)同萃取提取蛋白質(zhì)得率條件進(jìn)行篩選，并對條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳的綠豆蛋白提取工藝。通過條件優(yōu)化得出最佳的綠豆蛋白提取工藝參數(shù)為：微波功率338 W，處理溫度37℃，處理時(shí)間15.6 min，液料比為17.5 mL·g-1，經(jīng)試驗(yàn)的驗(yàn)證，此時(shí)的綠豆蛋白提取率可達(dá)到峰值，綠豆蛋白的得率為19.52%±0.13%。與傳統(tǒng)方法的提取時(shí)間3.5 h[22]，得率16%具有較大的提升，可見研究結(jié)果顯著提高了綠豆蛋白的提取效率，降低了生產(chǎn)能耗，可顯著增加綠豆加工的附加值，促進(jìn)我國綠豆生產(chǎn)、加工等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。