鴨體內(nèi)一種絳蟲的分子生物學(xué)鑒定

張弘弢，李春林，陳媛媛，常巧呈

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)科科技學(xué)院，大慶 163319）

家畜絳蟲的病原體屬于扁形動(dòng)物門中的一種絳蟲綱，其中只有假葉目與圓葉目的絳蟲對(duì)人和家養(yǎng)動(dòng)物具有感染性，感染絳蟲的人或者動(dòng)物都會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的疾病[1]。絳蟲蟲體的主要形態(tài)包括扁平形、分節(jié)形以及帶狀形，蟲體體長(zhǎng)大小不等，一般在毫米到數(shù)十厘米的之間。絳蟲的蟲體共有頭節(jié)、頸節(jié)和體節(jié)3個(gè)部分。頭節(jié)一般比較細(xì)小同時(shí)又附著器官，根據(jù)器官又可分為三類：包括吸盤型、吸葉型和吸槽型。頸節(jié)位于頭節(jié)的后部，是生長(zhǎng)體節(jié)的部位，比頭節(jié)要細(xì)一些，不會(huì)分節(jié)[2]。由節(jié)片組成的鏈體構(gòu)成體節(jié)，體節(jié)的數(shù)目決定絳蟲的大小，隨著體節(jié)的增多，絳蟲的蟲體會(huì)增大。生殖器官存在于各個(gè)節(jié)片，尾部節(jié)片內(nèi)的生殖器官會(huì)慢慢的萎縮，但其尾節(jié)的子宮會(huì)存在大量蟲卵，因而尾節(jié)又被稱為孕卵節(jié)片[3]。為保持蟲體大小不變，在蟲體末端的孕卵節(jié)片會(huì)逐漸地從蟲體上脫落的同時(shí)，新節(jié)片也會(huì)不斷從頸節(jié)后部長(zhǎng)出。我國(guó)致使鴨絳蟲病的主要絳蟲包括矛形劍帶絳蟲、片形皺褶絳蟲和美麗膜殼絳蟲等[4]。片形皺褶絳蟲（Fimbriaria fasiolaris）為膜殼屬大中型絳蟲，真頭節(jié)較小，易脫落，長(zhǎng)度為200.0～400.0 mm，寬 2.0～5.0 mm，其頭節(jié)上有吸盤，吻突上有小鉤，頭節(jié)后有一個(gè)附著器（成掃帚狀很大的皺褶假頭），大小有 1.9～6.0 mm×1.5 mm[5]。在其體內(nèi)有3個(gè)睪丸，呈橢圓形。網(wǎng)狀分布的卵巢被連接在全部成熟的孕節(jié)片內(nèi)，其子宮呈短管狀且遍布蟲卵，蟲卵大小為131.0×74.0μm，呈橢圓形，蟲卵兩端都呈尖狀，蟲卵外模呈薄而透明狀。

鴨片形皺褶絳蟲在世界范圍內(nèi)廣泛分布，主要附生在雁形目鳥類的小腸中。且大多為散發(fā)性的，偶爾為地方性流行。片形皺褶絳蟲在感染鴨類宿主時(shí)是需要中間宿主參與的，中間宿主主要為撓足類，有普通鏢水蚤（Diaptomus vulgaris）和劍水蚤等[6]。在中間撓足類宿主體內(nèi)經(jīng)過18～20 d，鴨片形皺褶絳蟲蟲卵在8～14℃條件下發(fā)育為成熟的擬囊尾蚴，然后鴨類等動(dòng)物在進(jìn)食過程中吞食了含有片形皺褶絳蟲成熟擬囊尾蚴的撓足類昆蟲，經(jīng)過16 d后再鴨類體內(nèi)的片形皺褶絳蟲成熟擬囊尾蚴就會(huì)發(fā)育成成蟲，從而使鴨感染上片形皺褶絳蟲。片形皺褶絳蟲主要附生在鴨類動(dòng)物的小腸中，致使患禽腸壁上形成結(jié)節(jié)樣病變，鴨類動(dòng)物發(fā)生消化障礙，開始導(dǎo)致鴨類出現(xiàn)消化不良、缺乏營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)緩慢等問題，同時(shí)存在于鴨體內(nèi)的片形皺褶絳蟲還會(huì)分泌一種神經(jīng)毒素，加重鴨類的病情，嚴(yán)重的情況還會(huì)導(dǎo)致鴨群產(chǎn)生嚴(yán)重的腸炎、腹瀉、貧血和黃疸，大量的片形皺褶絳蟲在小腸內(nèi)聚集從而導(dǎo)致小腸出現(xiàn)堵塞或者穿孔，最終導(dǎo)致死亡。病鴨顯著的癥狀為食欲不佳、生長(zhǎng)緩慢和發(fā)育阻滯并伴隨著貧血、黃疸以及腹瀉，剖檢的病鴨小腸內(nèi)可見大量附生的片形皺褶絳蟲，引發(fā)小腸產(chǎn)生炎癥，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成小腸穿孔或者堵塞小腸。片形皺褶絳蟲能侵染不同年歲的鴨，但17日齡以后的雛鴨對(duì)片形皺褶絳蟲抵抗能力最弱，雛鴨也因此在25～40日齡喪生，導(dǎo)致養(yǎng)殖戶損失嚴(yán)重，這也是我國(guó)大部分養(yǎng)鴨養(yǎng)殖戶很頭疼問題[7]。

為了解決養(yǎng)殖戶們遇到的困難，減少他們的經(jīng)濟(jì)損失，研究選擇了黑龍江省大慶市大同區(qū)成年鴨體內(nèi)的鴨絳蟲進(jìn)行采集。目的是辨別鴨體內(nèi)絳蟲的類別，以便能更有針對(duì)性的治療鴨絳蟲病，絳蟲選取后進(jìn)行清洗，并保存在70%的酒精中帶回進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[8]。由于蟲體較長(zhǎng)且上半身纖瘦，易成簇狀，在拆解時(shí)由于頭節(jié)的細(xì)小和操作不當(dāng)而無法獲得完整的頭節(jié)，頭節(jié)又是形態(tài)學(xué)鑒別蟲體的重要依據(jù)，故該蟲體無法選用染色、裝片的形態(tài)學(xué)鑒定[9]，所以在接收該蟲體后決定以蟲體DNA為模板，分別以核糖體DNA（rDNA）內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）和線粒體DNA（mtDNA）中細(xì)胞色素c氧化酶第Ⅰ亞基（cox1）的部分基因（pcox1）作為遺傳標(biāo)記對(duì)蟲體進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列分析，進(jìn)而確定蟲體種類[10]。通過實(shí)驗(yàn)對(duì)鴨絳蟲的分子生物學(xué)測(cè)序，為片形皺褶絳蟲蟲體的鑒定和對(duì)病鴨是否感染片形皺褶絳蟲提供參考依據(jù)[11-15]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 寄生蟲來源

鴨絳蟲采集于黑龍江省大慶市大同區(qū)成年鴨體內(nèi)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Ex Taq DNA 聚合酶、Ex Taq Buffer、DNA Marker（2 000）、DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit）、超凈水、引物、核酸電泳緩沖液（TAE）、6×Loading Buffer、瓊脂糖（AGAROSE G-10）、dNTP Mixture、溴化乙錠（EB）。

1.1.3 主要儀器

LX-100手掌型離心機(jī)（江蘇海林市其林貝爾儀器制造有限公司）；2-16PK型高速臺(tái)式離心機(jī)（SIGMA公司）；PCR 儀（TaKaRa）；YP202N 電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；微波爐（青島海爾制品有限公司）電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；Hws24電熱恒溫水浴鍋（上海一恒儀器有限公司）Gel Doc 2 000紫外凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-RAD）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA的提取

具體步驟如下：

（1）取蟲體，將蟲體用去離子水多次沖刷（3～5次，每次吸5下）。

（2）放入1.5 mL離心管，加200μL緩沖液GA和20μL蛋白酶K，56℃水浴消化3～4 h。

（3）向離心管中加入200μL緩沖液GB混勻，放入70℃水浴鍋10 min，再置于4℃冰箱3 min，取出瞬離除壁上水珠。

（4）取出后加200μL無水乙醇，震動(dòng)15 s，瞬離。

（5）所得溶液放入血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒的吸附柱CB3內(nèi)，講吸附柱放入收集管中。顛倒混勻，放入高速離心機(jī)中12 000 rad·min-1離心30 s，倒廢液，重新安置到吸附柱上。

（6）在吸附柱CB3內(nèi)加入500μL緩沖液GD，12 000 rad·min-1離心 30 s，倒廢液，重新安置到吸附柱上。

（7）在吸附柱CB3內(nèi)加入700μL漂洗液PW，12 000 rad·min-1離心 30 s，倒廢液，重新安置到吸附柱上[14]。

（8）重復(fù)步驟七，但是所用漂洗液PW改為500μL。

（9）12 000 rad·min-1空離 2 min，倒廢液，將吸附柱安置到離心管，室溫靜置3 min。

（10）將吸附柱CB3放于一個(gè)干凈的離心管，加入100μL洗脫緩沖液TE，注意加在吸附柱CB3的白色膜上，但不要戳破白色膜。室溫放置2～5 min；再放入高速離心機(jī)，12 000 rad·min-1離心2 min；重復(fù)上述步驟一次，將溶液收集到離心管中，-20℃保存。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增

以pcox1作為目的基因的引物為通用引物由Gasser等[16]設(shè)計(jì)。上游引物：5’-ATGATH TTYTTYTTYTTRATGCC-3’；下游引物：5’-ACAWCHARHCCHACHGTRAACAT-3’。

以ITS作為目的基因的引物為通用引物由Gasser等[14]設(shè)計(jì)。上游引物：5’-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3’；下游引物：5’-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3’表1為PCR反應(yīng)體系。

表1 PCR反應(yīng)體系Table 1 PCR reaction system

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳

（1）根據(jù)試驗(yàn)樣本數(shù)量，選擇小板小孔。

（2）稱取0.2 g AGAROSEG-10（瓊脂糖），20 mL 1×TAE。

（3）為使混合物完全溶解，先使用微波爐進(jìn)行加熱，在自然散熱，降溫至不燙手，點(diǎn)溴化乙錠并搖勻，倒入提前放置好的板中，靜止約25 min。大約在PCR結(jié)束時(shí)就可直接進(jìn)行下一步。

（4）將凝膠拿出，放入電泳槽，注意放在規(guī)定位置。

（5）取出所需加入板內(nèi)的模板、6×Loading Buffer（保存在4℃冰箱中）、PL 2 000 Maker。取塑料紙片，將取出的Loading Buffer根據(jù)樣本數(shù)量分別點(diǎn)3μL在紙上。再分別用適量的DNA模板與Loading Buffer混勻，吸取，加入凝膠孔中。Maker加在左側(cè)，大約3μL。注意加樣時(shí)不要把凝膠戳破。

（6）加樣完畢后，蓋上電泳槽，電壓設(shè)置120 V，電流設(shè)置140 mA，開始運(yùn)行。

（7）在加樣緩沖液中的溴酚藍(lán)遷移至足夠分離DNA片段的距離時(shí)，關(guān)閉電源，取出凝膠，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.4 PCR產(chǎn)物送檢測(cè)序

將鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物冰凍，委托上海生工生物工程公司測(cè)序。

1.2.5 目標(biāo)基因ITS序列比較分析

研究中對(duì)的線蟲進(jìn)行同源性分析軟件為MegAlign軟件。

1.2.6 進(jìn)化分析

（1）從GenBank上選取一種線蟲作為外群，對(duì)膜殼科的6種絳蟲和戴維科的3種絳蟲共11種絳蟲的相關(guān)基因，應(yīng)用MEGA軟件構(gòu)建研究中蟲體pcox1進(jìn)化樹，鑒定其所屬關(guān)系。

（2）從GenBank上選取柯氏偽裸頭絳蟲作為外群，對(duì)膜殼科不同屬絳蟲共6種絳蟲的相關(guān)基因，應(yīng)用MEGA軟件構(gòu)建研究中蟲體ITS進(jìn)化樹，鑒定其所屬關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 pcox1基因的擴(kuò)增

電泳結(jié)果可見下圖1，分析可知對(duì)實(shí)驗(yàn)中蟲體pcox1進(jìn)行擴(kuò)增后，可在約700 bp處見明顯的單一條帶。

圖1 pcox1基因PCR結(jié)果Fig.1 Pcox1 gene PCR results

2.2 ITS基因的擴(kuò)增

電泳結(jié)果可見下圖2，分析可知對(duì)實(shí)驗(yàn)中蟲體ITS進(jìn)行擴(kuò)增后，可在約1 400 bp處見明顯的單一條帶。

2.3 目的基因pcox1的測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，研究蟲體中pcox1序列大小為698 bp（見圖 3）。

圖3 蟲體pcox1基因擴(kuò)增物序列Fig.3 Pcox1 gene amplicon sequence of the insect

圖2 ITS基因PCR結(jié)果Fig.2 ITSgene PCR results

2.4 目的基因ITS的測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果顯示，研究中蟲體ITS序列大小為1 449 bp（見圖 4）。

圖4 蟲體ITS基因擴(kuò)增物序列Fig.4 ITSgene amplicon sequence of the insect

2.5 pcox1序列比較分析

通過與Genbank公布的片形屬未定種絳蟲進(jìn)行pcox1序列相比較，同源性為92.2%，結(jié)果如圖5。

圖5 pcox1基因同源性分析Fig.5 Homology analysis of pcox1 gene

2.6 ITS序列比較分析

通過與Genbank公布的片形屬片形褶皺絳蟲進(jìn)行ITS序列相比較，同源性為99.3%，結(jié)果如圖6。

圖6 ITS基因同源性分析Fig.6 Homology analysis of ITSgene

2.7 pcox1序列進(jìn)化分析

以一種線蟲為外群，對(duì)膜殼科和戴維科絳蟲進(jìn)行建樹，結(jié)果如圖7。由圖可以看出實(shí)驗(yàn)絳蟲與片形屬絳蟲位于同一分支。

圖7 基因pcox1序列對(duì)研究蟲體進(jìn)行進(jìn)化性分析Fig.7 Pcox1 sequence was used to analyze the evolution of the insect

2.8 ITS序列進(jìn)化分析

以一種擬囊絳蟲為外群，對(duì)膜殼科不同屬的絳蟲進(jìn)行建樹，結(jié)果如圖8。由圖可以看出實(shí)驗(yàn)絳蟲與片形褶皺絳蟲位于同一分支。

圖8 基因ITS序列對(duì)研究蟲體進(jìn)行進(jìn)化性分析Fig.8 The ITSsequence was used to analyze the evolution of the insect

3 討論

3.1 目的基因選取的討論

目前用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的基因，以線粒體pcox1和核糖體ITS1、ITS2基因應(yīng)用最為廣泛。其中，在使用pcox1基因作為分子標(biāo)記時(shí)范圍沒有核糖體ITS1、ITS2基因那么廣。pcox1和ITS都擁有高度的保守性，但pcox1基因的特點(diǎn)為種內(nèi)分化弱，種間分化強(qiáng)，而rDNA序列功能上具有進(jìn)化時(shí)鐘性，目前已經(jīng)被應(yīng)用到物種分類與進(jìn)化分析中，尤其是種間的分類[17-18]。ITS進(jìn)化快，物種內(nèi)發(fā)生變異的幾率小，物種間發(fā)生變異的幾率大[19]。通過分析ITS序列可以構(gòu)建進(jìn)化樹并分析其親緣關(guān)系。但是實(shí)驗(yàn)由于基因庫中沒有片形褶皺絳蟲的pcox1基因，所以用pcox1作為目的基因只鑒定了該未知蟲體的屬，而無法確定鑒定該絳蟲具體是什么，而基因庫中有片形褶皺絳蟲ITS的序列，所以我們可以確切的證明未知絳蟲為片形褶皺絳蟲。理論上種屬的鑒定ITS比較可靠，但是因?yàn)闂l件不同所以在試驗(yàn)中無法說明到底哪種目的基因好。因此完善的基因庫對(duì)于鑒別蟲體就顯的至關(guān)重要，同時(shí)這也是分子生物學(xué)鑒定方法發(fā)展至今的一個(gè)亟待解決的問題，需要科研工作者積極研究、共享。

3.2 鑒定方法的討論

對(duì)寄生蟲進(jìn)行分類和鑒定是進(jìn)行此類研究的基礎(chǔ)。因此形態(tài)學(xué)鑒定與分子生物學(xué)鑒定收到大家的青睞，被廣泛使用[20]。

第一，形態(tài)學(xué)在寄生蟲鑒定非常直觀，沒有太多的步驟；只要蟲體保存完整，人們可以進(jìn)行若干次的重復(fù)觀察，還可以與標(biāo)準(zhǔn)模板比對(duì)，進(jìn)一步減少誤差。第二，形態(tài)學(xué)鑒定方便，無需大量?jī)x器，易操作；部分寄生蟲形態(tài)特征明顯，對(duì)于這類寄生蟲，形態(tài)學(xué)鑒定是最便捷的措施。第三，形態(tài)學(xué)鑒定無需花費(fèi)大量時(shí)間，如果是具有明顯形態(tài)學(xué)特征的寄生蟲，經(jīng)驗(yàn)豐富的鑒定人員可以在最短的時(shí)間內(nèi)鑒定出結(jié)果；而分子生物學(xué)鑒定需要幾天時(shí)間才能完成。與此同時(shí)，形態(tài)學(xué)鑒定也有不足的地方。對(duì)于一些形態(tài)差異很小的近緣種或者近似物種，很難利用形態(tài)學(xué)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，對(duì)于經(jīng)驗(yàn)不夠豐富者而言就更加困難。而如果蟲體經(jīng)過運(yùn)輸?shù)仍?，保存不?dāng)，導(dǎo)致蟲體被破壞，就更加難以利用形態(tài)學(xué)鑒定。

對(duì)于難以利用形態(tài)學(xué)鑒定的蟲體，分子生物學(xué)鑒定的優(yōu)勢(shì)就凸顯出來。分子生物學(xué)能夠識(shí)別和鑒定形態(tài)上非常相似的不同亞種、生物型、地理種群[21]。但高新技術(shù)在使用過程中也總是伴隨著各種不足。比如儀器緊密程度，每一個(gè)環(huán)節(jié)中所使用的化學(xué)試劑與生物制劑的質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)環(huán)境的分子污染問題等都能影響。并且分子生物學(xué)鑒定的研究歷史不長(zhǎng)，積累的基因庫資料不夠豐富也可能會(huì)導(dǎo)致無法對(duì)需要鑒定的寄生蟲準(zhǔn)確鑒定。

研究中由于獲得寄生蟲蟲體保存不當(dāng)，不利于進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。為確定蟲體種類，選擇以蟲體DNA為模板，以核糖體DNA（rDNA）內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）及線粒體DNA（mtDNA）中細(xì)胞色素c氧化酶第Ⅰ亞基（cox1）分別作為遺傳標(biāo)記，對(duì)蟲體進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列分析[22]。

3.3 預(yù)防鴨絳蟲病的討論

成年攜帶鴨絳蟲病的鴨類是致使鴨絳蟲病傳播的主要傳染源，絳蟲的蟲卵會(huì)潛藏在成年鴨的排泄物中，隨著糞便的排出流出體外。與此同時(shí)，劍水蚤作為中間宿主會(huì)趁機(jī)夾帶糞便內(nèi)的絳蟲蟲卵，幫助絳蟲蟲卵在水中大面積的擴(kuò)散傳播。當(dāng)遇見其它成年鴨或番鴨時(shí)，劍水蚤會(huì)侵染它們，致使其它鴨也患上絳蟲病。為了防止鴨絳蟲病的流行，減少養(yǎng)殖戶們的損失，依據(jù)鴨絳蟲病的傳播方式和流行特點(diǎn)，以及中間宿主劍水蚤的活動(dòng)方式，對(duì)預(yù)防鴨絳蟲病提出了以下幾點(diǎn)建議，第一，應(yīng)選擇在冬天和春天剛剛來臨的時(shí)候，對(duì)成年鴨群進(jìn)行全面驅(qū)蟲，此時(shí)的中間宿主劍水蚤已大部分死亡，這樣可以杜絕中間宿主與成年鴨的接觸，阻礙劍水蚤攜帶絳蟲，將劍水蚤的危害降到最小，驅(qū)蟲后的糞便也應(yīng)及時(shí)處理，保證清潔的衛(wèi)生環(huán)境。第二，對(duì)于鴨絳蟲病流行地區(qū)的雛鴨，應(yīng)當(dāng)合理的做好規(guī)劃，定期的對(duì)雛鴨群進(jìn)行驅(qū)蟲處理，并且在驅(qū)蟲后的21 h內(nèi)及時(shí)清掃糞便并堆積發(fā)酵，以防止寄生蟲的四散傳播。日常也要保證雛鴨居住環(huán)境的衛(wèi)生條件，做到糞便及時(shí)清理，并且做好防范，避免外來因素造成污染。第三，對(duì)于鴨絳蟲病流行區(qū)域的成年鴨和番鴨，要將兩者分開飼養(yǎng)，保持在合理的安全間隔。條件允許的情況下，盡量在不同的區(qū)域居住和放牧，阻斷番鴨和成年鴨接觸的可能性，避免番鴨受到成年鴨的感染。第四，鴨絳蟲流行區(qū)域的飼養(yǎng)場(chǎng)，建議不同區(qū)域的鴨群實(shí)行配備單獨(dú)的飲食裝置和飲水裝置，防止不同區(qū)域的裝置混淆，造成交叉感染。工作人員也應(yīng)及時(shí)清潔飲食裝置和飲水裝置的衛(wèi)生，避免寄生蟲卵的殘留，造成病從口入。第五，在選擇放牧的區(qū)域時(shí)，應(yīng)盡量選擇深水的區(qū)域或水源可流動(dòng)的區(qū)域進(jìn)行放牧，這樣可以減少單位面積內(nèi)劍水蚤的數(shù)量，降低鴨群接觸到劍水蚤的幾率。第六，以鴨的體重作為依據(jù)，在飼料和飲水中定量的加入丙硫苯咪唑。丙硫苯咪作為一種新型的廣譜的驅(qū)蟲藥，對(duì)鴨絳蟲病有著很好的預(yù)防效果，且具有毒性值很小、作用范圍廣的特性，除絳蟲外，對(duì)其他的寄生蟲也有著很好的祛除效果，有著很高的性價(jià)比，是養(yǎng)殖戶們節(jié)約成本的一種較優(yōu)選擇。

4 結(jié)論

對(duì)研究中來自鴨體內(nèi)一種寄生蟲的pcox1序列和ITS序列進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，構(gòu)建了研究中絳蟲蟲體的分子進(jìn)化樹，推斷研究中的絳蟲歸屬于圓葉目、膜殼科、片形屬、片形褶皺絳蟲。