HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)定黃金連清解片中有效主成分的含量

祝 芳,陳 順

(1解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心藥劑藥理科,北京 100048;2長(zhǎng)征醫(yī)院藥材科)

黃金連清解片是由黃芩、黃連、黃柏、金銀花、連翹等5味中藥組成的中藥復(fù)方制劑,具有清熱解毒功效,用于風(fēng)溫?zé)岵?發(fā)熱咳喘,口瘡咽腫,熱淋瀉痢等癥。其中黃芩、黃連清熱燥濕,瀉火解毒;黃柏清熱燥濕,瀉火除蒸,解毒療瘡;金銀花清熱解毒,疏散風(fēng)熱;連翹清熱解毒,消腫散結(jié),疏散風(fēng)熱,諸藥合用發(fā)揮清熱解毒功效[1]?，F(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)中并未對(duì)其含量進(jìn)行控制,不能全面反映組方質(zhì)量,也不符合中成藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),目前未見(jiàn)多成分含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道[2-6]。因此,本試驗(yàn)建立HPLC波長(zhǎng)切換法同時(shí)測(cè)黃金連清解片中黃芩苷、綠原酸、連翹苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量,對(duì)復(fù)方中全部5味組方藥材進(jìn)行質(zhì)量控制,以便為藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀(四元泵,VWD檢測(cè)器,自動(dòng)進(jìn)樣器,ChemStation化學(xué)工作站);Mettler AE240型電子天平;KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器。

對(duì)照品:黃芩苷(批號(hào)110715-201318;純度93.3%)、綠原酸(批號(hào)110753-201415;純度96.2%)、連翹苷(批號(hào)110821-201615;純度94.9%)、鹽酸巴馬汀(批號(hào)110732-201611;純度86.8%)、鹽酸小檗堿(批號(hào)110713-201613;純度86.8%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;黃金連清解片(長(zhǎng)征醫(yī)院藥材科;批號(hào):190408、190422、190520);乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純,水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品溶液配制 精密稱(chēng)取黃芩苷、綠原酸、連翹苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對(duì)照品適量,加甲醇制成1.785 mg/ml黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液,0.944 mg/ml綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液,0.519 mg/ml連翹苷對(duì)照品儲(chǔ)備液,0.381 mg/ml鹽酸巴馬汀對(duì)照品儲(chǔ)備液,1.241 mg/ml鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備液;精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,加甲醇制成含黃芩苷142.80 μg/ml、綠原酸37.77 μg/ml、連翹苷31.13 μg/ml、鹽酸巴馬汀15.24 μg/ml、鹽酸小檗堿74.46 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液配制 取本品10片,研細(xì),取約0.1 g,精密稱(chēng)定,置于錐形瓶中,精密加入甲醇25 ml,稱(chēng)定質(zhì)量,超聲處理30 min,放冷,再稱(chēng)定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液制備 按處方比例和制備工藝分別配制缺黃芩、金銀花、連翹、黃連和黃柏的陰性樣品,按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脫(0-7 min,5%-15% A;7-25 min,15%-23% A;25-30 min,23%-28% A);流速1.0 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):0-10 min,327 nm;10-20 min,280 nm;20-25 min,277 nm;25-30 min,345 nm,柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μl;理論塔板數(shù)按黃芩苷計(jì)算不應(yīng)少于3 000[7]。

2.3 專(zhuān)屬性考察

分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液與陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,黃芩苷、綠原酸、連翹苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿與其他峰分離度均大于1.5,峰形較佳,各成分理論塔板數(shù)均不低于3 000,色譜圖見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液1,2,5,10,15,20 μl,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜峰的峰面積。以對(duì)照品的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程、線性范圍以及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

2.5 精密度考察

精密吸取混合對(duì)照品溶液,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積,計(jì)算黃芩苷、綠原酸、連翹苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿色譜峰峰面積的RSD分別為0.87%,0.56%,0.83%,1.01%,0.95%(n=6),結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性考察

取同一批號(hào)樣品(批號(hào):190408),按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份,按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,測(cè)得黃芩苷、綠原酸、連翹苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量的平均值分別為36.28 mg/g,9.680 mg/g,8.173 mg/g,3.928 mg/g,18.37 mg/g,RSD分別為1.37%,0.56%,1.52%,1.71%,0.49%(n=6),結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察

取供試品溶液(批號(hào):190408),按“2.2”項(xiàng)下色譜條件,分別在0,1,2,4,8,12 h進(jìn)樣,測(cè)定黃芩苷、綠原酸、連翹苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿色譜峰峰面積,峰面積的RSD分別為0.95%,0.45%,1.52%,1.24%,1.23%(n=6),表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.綠原酸(chlorogenic acid);2.黃芩苷(baicalin);3.連翹苷(phillyrin);4.鹽酸巴馬汀(palmatine hydrochloride);5.鹽酸小檗堿(berberine hydrochloride)圖1 混合對(duì)照品、供試品、金銀花陰性樣品、黃芩陰性樣品、連翹陰性樣品、黃連和黃柏陰性樣品的色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances, sample, negative sample without Honeysuckle, negative sample without Scutellaria, negative sample without Forsythia, negative sample without Coptidis Rhizoma and Phellodendri Cortex

表1 5個(gè)成分的回歸方程與線性關(guān)系

2.8 加樣回收率考察

精密稱(chēng)取已知含量的樣品(批號(hào):190408)6份,每份約50 mg,置于錐形瓶中,分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5個(gè)成分的加樣回收率考察結(jié)果

2.9 樣品含量測(cè)定

取3個(gè)批號(hào)黃金連清解片樣品,按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,分別計(jì)算黃芩苷、綠原酸、連翹苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品中5個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果 (mg/g,n=3)

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

試驗(yàn)對(duì)一系列不同濃度的甲醇(100%,70%,50%,30%)進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)采用純甲醇作為提取溶劑時(shí),各個(gè)成分提取效率較高,雜質(zhì)較少,最終確定采用甲醇作為提取溶劑。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

試驗(yàn)同時(shí)測(cè)定黃金連清解片中黃芩苷、綠原酸、連翹苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量,5個(gè)成分最大紫外吸收波長(zhǎng)各不相同,在同一波長(zhǎng)下測(cè)定難以得到滿意的靈敏度,通常會(huì)采用分別測(cè)定的方法,但試驗(yàn)繁瑣,檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),成本較高。因此,本試驗(yàn)采用波長(zhǎng)切換法,分別在其最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定,既可保證靈敏度同時(shí)可以節(jié)約成本,提高效率。參照2015年版《中國(guó)藥典》(一部)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[7,8],確定黃芩苷、綠原酸、連翹苷、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為280 nm,327 nm,277 nm,345 nm,345 nm[9-11]。

3.3 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液,發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí),色譜峰基線較穩(wěn),結(jié)合上梯度洗脫,各個(gè)成分可以得到很好的分離效果、峰形,出峰時(shí)間也較短,因此采用乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相。

通過(guò)對(duì)5味組方藥材黃芩、黃連、黃柏、金銀花、連翹的各自指標(biāo)性成分黃芩苷、綠原酸、連翹苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿進(jìn)行含量測(cè)定,可以完整描述黃金連清解片的質(zhì)量情況。隨著分析技術(shù)和方法的不斷進(jìn)步,采用多成分含量同時(shí)測(cè)定的方法被越來(lái)越多地用于中藥質(zhì)量控制,較以往依靠單一成分評(píng)價(jià)中藥復(fù)方制劑的做法更為全面和嚴(yán)謹(jǐn),將成為中藥研究的發(fā)展方向。