β-拉帕醌抑制下咽癌Fadu細(xì)胞增殖和遷移機(jī)制的研究

張雙雙,崔憶旋,劉學(xué)寶,許彬彬,蔡常琦,朱慧慧,韓亞娟,丁曉嬌,韓躍峰*,趙 報(bào)#

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,蚌埠 233000;2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:hanyf1015@126.com;#共同通訊作者,E-mail:zhaobao86@126.com)

下咽癌是一種少見的頭頸部惡性腫瘤,約占頭頸部惡性腫瘤的3%-5%,其病理類型以鱗狀細(xì)胞癌為主[1,2]。下咽癌往往發(fā)現(xiàn)比較晚,70%-85%的病例診斷時(shí)已經(jīng)屬于Ⅲ期或Ⅳ期。下咽癌生物學(xué)特性惡劣,發(fā)生部位隱蔽難察覺,且極易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,預(yù)后差,生存率低[3,4]。盡管對下咽癌的手術(shù)治療、放療、化療及靶向藥物治療取得了重要進(jìn)展,但下咽癌患者的預(yù)后尚無明顯改善。因此,有必要尋找與下咽癌治療進(jìn)展相關(guān)的新策略。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是細(xì)胞重塑的一個(gè)重要過程,其特征是上皮表型的逐漸喪失和間充質(zhì)表型的逐步增加,EMT不是一個(gè)全有或全無的過程,而是上皮細(xì)胞向中間細(xì)胞狀態(tài)的間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變[5]。腫瘤轉(zhuǎn)移是延長癌癥患者壽命的主要障礙,上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫瘤侵襲、浸潤和轉(zhuǎn)移形成等致癌過程中起著重要作用,對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移尤為重要[6]。上皮標(biāo)志物如E-cadherin和間充質(zhì)標(biāo)志物包括N-cadherin和vimentin的表達(dá)水平被用來定義上皮-間充質(zhì)狀態(tài)[7]。EMT轉(zhuǎn)錄因子snail是一種EMT的調(diào)控因子,其抑制上皮基因的表達(dá)[8]。實(shí)驗(yàn)證明,處于EMT中間狀態(tài)的癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性,從而形成集體癌簇以克服壓力環(huán)境[9]。因此,確定更多的EMT藥物靶點(diǎn)作為癌癥治療手段將是發(fā)展抗癌治療的必要條件。

NAD(P)H ∶醌氧化還原酶1(NQO1)蛋白又稱醌氧化還原酶,既是一種保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的黃素酶,也是人體內(nèi)一種非常重要的化學(xué)致癌物代謝酶[10]。β-拉帕醌(β-lapachone),分子量242.273 8 g/mol,是NQO1蛋白的一種有效抑制劑,從中南美洲天然產(chǎn)物紫檀樹的樹皮中分離獲得[11]。β-拉帕醌的生物學(xué)作用廣泛,包括抗細(xì)菌、抗真菌、殺錐蟲、抗銀屑病、消炎和抗腫瘤等作用[12]。并且對多種癌細(xì)胞具有良好的抗腫瘤作用,包括肝癌、乳腺癌、胰腺癌等[13]。然而其在下咽癌中的作用及機(jī)制尚不清楚。因此,本文以下咽癌Fadu細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對象,體外分析β-拉帕醌對下咽癌細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用,并初步探討其分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人下咽癌Fadu細(xì)胞株購自武漢普諾塞生命科技有限公司,培養(yǎng)于蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院生化實(shí)驗(yàn)室。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(含EDTA)及雙抗(青霉素/鏈霉素)均購自美國Hyclone公司,胎牛血清(FBS)購自浙江天杭生物科技股份有限公司,MTT試劑、雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin Ⅴ-FITC/PI)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、Transwell小室均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,一抗(Bcl-2、Bax、E-cadherin、vimentin、Snail)、β-actin及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗均購自于美國CST公司等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人下咽癌細(xì)胞Fadu培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞長至70%-80%時(shí)消化傳代。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的Fadu細(xì)胞消化,離心,棄上清,制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后接種于96孔板,調(diào)整培養(yǎng)液為100 μl/孔,細(xì)胞數(shù)約為1×104個(gè)/孔,于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)內(nèi)培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞長至密度達(dá)80%左右,向96孔板內(nèi)分別加入濃度為0,1,2,3,4,5,6 μmo1/L的β-拉帕醌溶液,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,每孔加入配制好的MTT溶液15 μl,MTT濃度為5 g/L,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,小心吸去培養(yǎng)液,每孔加入150 μl DMSO,繼續(xù)于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中培養(yǎng)30 min后,在490 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測吸光度值(OD490 nm)。計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD490 nm/對照組OD490 nm×100%。取平均值繪制藥物劑量效應(yīng)曲線,并計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50),實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值,篩選適宜的藥物作用濃度。

1.2.3 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)期生長狀況良好的Fadu細(xì)胞消化,離心,棄上清,制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后接種于6孔板,調(diào)整培養(yǎng)液為2 ml/孔,細(xì)胞數(shù)約為5 000個(gè)/孔,于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)內(nèi)培養(yǎng)24 h后,向6孔板內(nèi)分別加入濃度為0,2,4,6 μmo1/L的β-拉帕醌溶液,再放入培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)2周;待細(xì)胞生長至出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞集落時(shí),終止細(xì)胞培養(yǎng);棄去培養(yǎng)基,用預(yù)先冷卻的PBS溶液清洗2遍后,每孔滴加1 ml 4%多聚甲醛溶液固定15-20 min;棄去固定液,然后向每孔中滴加1 ml 結(jié)晶紫染色15-20 min;回收保留結(jié)晶紫,用自來水洗滌6孔板3次,自然風(fēng)干并拍照。使用軟件Image J計(jì)算細(xì)胞克隆數(shù)。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的Fadu細(xì)胞消化,離心,棄上清,用無血清的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后,將約含2×105個(gè)細(xì)胞/ml的無血清細(xì)胞懸液加入100 μl至上層小室,并在上層小室中分別加入濃度為0,2,4,6 μmol/L的β-拉帕醌溶液,在下層小室內(nèi)加入600 μl的DMEM完全培養(yǎng)液,于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)內(nèi)培養(yǎng)48 h后,丟棄上室液體,將小室放入雙蒸水中輕輕洗滌1遍后,再將小室放入含600 μl 4%多聚甲醛溶液的24孔板中固定15-20 min,丟棄固定液,將小室放入雙蒸水中洗滌1遍后,再將小室放入含600 μl結(jié)晶紫的24孔板中染色15-20 min,回收保留結(jié)晶紫,再將小室放入雙蒸水中洗滌1遍,用棉簽擦拭小室內(nèi)。最后,用光學(xué)顯微鏡200倍放大觀察并拍照。使用軟件Image J計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)(Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的Fadu細(xì)胞消化,離心,棄上清,制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后接種于6孔板,調(diào)整培養(yǎng)液為2 ml/孔,細(xì)胞數(shù)約為5×105個(gè)/孔,于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)內(nèi)培養(yǎng)24 h后,向6孔板內(nèi)分別加入濃度為0,2,4,6 μmo1/L的β-拉帕醌溶液,于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞并收集細(xì)胞,其中空白孔(0 μmo1/L組)分為4份,分別為空白對照組、PI組、Annexin Ⅴ-FITC組以及對照組。500g離心5 min,棄上清,用預(yù)冷的PBS清洗2遍,每組加入200 μl Annexin Ⅴ-FITC結(jié)合液混勻,再加入1.5 μl Annexin Ⅴ-FITC染色液輕輕混勻,在4 ℃冰箱中避光孵育15 min;之后再加入1.5 μl PI染色液,在4 ℃冰箱中避光孵育5 min,1 h內(nèi),用流式細(xì)胞儀分析檢測細(xì)胞凋亡率,激發(fā)波長488 nm;發(fā)射波長530 nm。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot法檢測Bcl-2、Bax、E-cadherin、vimentin、Snai1蛋白表達(dá)水平 將對數(shù)期生長狀態(tài)良好的Fadu細(xì)胞用不同濃度的β-拉帕醌溶液處理,濃度分別為0,2,4,6 μmol/L,于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)中繼續(xù)培養(yǎng),48 h后將細(xì)胞消化收集至離心管,PBS洗滌2遍后,加入含有PMSF的裂解液冰上裂解30 min,放入-20 ℃冰箱過夜,次日離心30 min(12 000 r/min,30 min),棄去沉淀,取上清液。用BCA法測出蛋白濃度,然后加入上樣緩沖液,并計(jì)算出每組樣本所需上樣量。將蛋白總量相同的樣本加入到蛋白凝膠(SDS-PAGE)內(nèi)進(jìn)行蛋白分離,待溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底部后終止,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h于室溫?fù)u床上搖晃,用TPBS洗滌5 min,重復(fù)3次。用一抗稀釋液分別稀釋Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、vimentin(1 ∶1 000)、Snail(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)一抗,將PVDF膜放于不同的一抗中4 ℃孵育過夜,次日室溫下在搖床上搖晃30 min后,用TPBS洗膜,洗滌5 min,重復(fù)3次,再將PVDF膜放入二抗中室溫孵育2 h于搖床上搖晃,之后用TPBS洗膜5 min,重復(fù)3次。最后ECL發(fā)光試劑盒顯色、成像。β-actin蛋白作為內(nèi)參。使用軟件Image J分析各組條帶灰度值,計(jì)算目標(biāo)蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組間差異采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較各組間差異,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-拉帕醌對Fadu細(xì)胞存活率的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,當(dāng)濃度為0,1,2,3,4,5,6 μmol/L的β-拉帕醌作用于Fadu細(xì)胞48 h,隨著β-拉帕醌濃度的增加Fadu細(xì)胞的存活率降低,與0 μmol/L相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1),作用48 h的IC50值為3.547 μmol/L。表明β-拉帕醌對Fadu細(xì)胞具有抑制增殖的作用且呈濃度依賴性。

2.2 β-拉帕醌對Fadu細(xì)胞增殖的影響

平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Fadu細(xì)胞經(jīng)濃度為0,2,4,6 μmol/L的β-拉帕醌處理2周后,隨著β-拉帕醌濃度的增加Fadu細(xì)胞的克隆形成數(shù)量明顯減少,與0 μmol/L相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01,見圖2)。提示β-拉帕醌可顯著抑制Fadu細(xì)胞的克隆能力,且呈濃度依賴性。

與0 μmol/L相比,*P<0.05圖1 不同濃度β-拉帕醌作用48 h對Fadu細(xì)胞存活率的影響Figure 1 Effect of different concentrations of β-lapachone for 48 h on the survival rate of Fadu cells

圖2 不同濃度β-拉帕醌作用2周對Fadu細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Effect of different concentrations of β-lapachone for 2 weeks on the proliferation of Fadu cells

2.3 β-拉帕醌對Fadu細(xì)胞遷移的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著β-拉帕醌濃度的增加,Fadu細(xì)胞的遷移數(shù)量逐漸減少,與0 μmol/L相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01,見圖3)。表明β-拉帕醌可顯著抑制Fadu細(xì)胞遷移,且呈濃度依賴性。

圖3 不同濃度β-拉帕醌作用48 h對Fadu細(xì)胞遷移的影響Figure 3 Effect of different concentrations of β-lapachone for 48 h on migration of Fadu cells

2.4 β-拉帕醌對Fadu細(xì)胞凋亡的影響

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn),流式分析結(jié)果顯示不同濃度的β-拉帕醌(0,2,4,6 μmol/L)作用于Fadu細(xì)胞24 h,細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞凋亡率明顯增高,與0 μmol/L相比,不同濃度藥物作用后細(xì)胞凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01,見圖4)。提示β-拉帕醌可顯著誘導(dǎo)Fadu細(xì)胞凋亡。

圖4 不同濃度β-拉帕醌作用24 h對Fadu細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 Effect of different concentrations of β-lapachone for 24 h on apoptosis of Fadu cells

2.5 β-拉帕醌對Fadu細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、vimentin、Snai1表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與0 μmol/L相比,不同濃度的β-拉帕醌(2,4,6 μmol/L)作用于Fadu細(xì)胞48 h,Bcl-2、vimentin、Snail蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.05或P<0.01),Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.05或P<0.01,見圖5)。表明β-拉帕醌可下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)并上調(diào)凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax的表達(dá),與此同時(shí),下調(diào)EMT間質(zhì)標(biāo)志物vimentin、Snai1蛋白的表達(dá)和上調(diào)EMT上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白的表達(dá)。

與0 μmol/L相比,*P<0.05,**P<0.01;與2 μmol/L相比,#P<0.05,##P<0.01;與4 μmol/L相比,&P<0.05圖5 Western blot檢測不同濃度β-拉帕醌對Fadu細(xì)胞Bcl-2、Bax、E-cadherin、vimentin、Snail蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of different concentrations of β-lapachone on the expression of Bcl-2,Bax,E-cadherin,vimentin,Snail in Fadu cells by Western blot

3 討論

在所有頭頸部惡性腫瘤中,下咽癌的生存率最低,總體預(yù)后差,95%以上的下咽癌患者被證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌,通常表現(xiàn)為黏膜表面的病變[14]。下咽癌在其行為上通常具有侵襲性,并表現(xiàn)出一種自然史,其特征是彌漫性原發(fā)腫瘤伴黏膜和黏膜下局部擴(kuò)散,早期頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,以及相對較高的遠(yuǎn)端擴(kuò)散率[15]。目前下咽癌的治療方式以手術(shù)治療為主,但由于術(shù)后復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等原因,治療效果不理想。尋找新的藥物來治療下咽癌成為科研工作者研究的熱點(diǎn)。

在過去的30年里,天然化合物的藥用價(jià)值一直很高,并且一直是癌癥治療的主要藥物[16]。天然化合物β-拉帕醌(β-lapachone)化學(xué)名為3,4-二氫-2,2-二甲基-2H-萘并[1,2-b]-吡喃-5,6-二酮,屬于1,2-萘醌類[17]。β-拉帕醌為新型抗癌候選藥物,是一種有力的細(xì)胞毒性劑,顯示出對多種腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[18]。但其在下咽癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制尚不清楚,本研究旨在探討β-拉帕醌對下咽癌細(xì)胞的抗癌作用,為此本研究在體外進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)探討β-拉帕醌對下咽癌細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制。

細(xì)胞不受控制的增殖與腫瘤的整體進(jìn)展密切相關(guān),而許多惡性腫瘤細(xì)胞通過凋亡逃逸獲得無限的增殖能力[19]。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白平衡的破壞是凋亡逃逸的一種機(jī)制[20]。而Bcl-2基因家族與細(xì)胞凋亡的關(guān)系密切,如家族中的抗凋亡成員Bcl-2、促凋亡蛋白Bax[21]。因此,通過調(diào)控凋亡的關(guān)鍵蛋白或酶的表達(dá)或功能來誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡成為癌癥研究的熱點(diǎn)[22]。因此,本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移等方面著手設(shè)計(jì),觀察β-拉帕醌處理后相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的變化,以期探索可能的作用機(jī)制。經(jīng)β-拉帕醌處理后,由MTT實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知,β-拉帕醌對下咽癌Fadu細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用,且呈濃度依賴性。由Tranwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果和流式細(xì)胞儀分析結(jié)果可知β-拉帕醌還可以抑制下咽癌Fadu細(xì)胞的遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Woo等[23]報(bào)道表明,β-拉帕醌可通過降低BCL-2/Bax途徑誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡。Jeon等[24]報(bào)道表明β-拉帕醌通過凋亡相關(guān)蛋白抑制NSCLC細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡。本研究的結(jié)果與上述報(bào)道一致,Fadu細(xì)胞經(jīng)β-拉帕醌處理后,Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào),而Bax蛋白的表達(dá)上調(diào)(BCL-2/Bax比值明顯下降),提示β-拉帕醌可能通過凋亡相關(guān)蛋白途徑誘導(dǎo)下咽癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

轉(zhuǎn)移是任何類型癌癥死亡的根本原因,而且由于轉(zhuǎn)移過程的復(fù)雜性,人們對癌癥生物學(xué)的這一方面仍然知之甚少[25]。目前,在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中,上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)被認(rèn)為是一個(gè)關(guān)鍵的發(fā)展過程[26]。然而,關(guān)于EMT在β-拉帕醌抑制下咽癌細(xì)胞中的作用尚不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)研究了β-拉帕醌和EMT相關(guān)分子標(biāo)志物之間的關(guān)系,以闡明β-拉帕醌對下咽癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。Western blot檢測結(jié)果顯示,經(jīng)β-拉帕醌處理后的Fadu細(xì)胞中,與0 μmol/L相比,E-cadherin蛋白的表達(dá)水平升高,vimentin和Snail蛋白的表達(dá)水平降低,呈現(xiàn)EMT典型的相關(guān)分子標(biāo)志物的表現(xiàn)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,β-拉帕醌可以顯著抑制Fadu細(xì)胞的EMT進(jìn)展。

綜上所述,β-拉帕醌作為NQO1的有效抑制劑可顯著抑制下咽癌細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)下咽癌細(xì)胞凋亡,還可通過EMT途徑體外抑制下咽癌細(xì)胞的遷移能力。本研究為β-拉帕醌的開發(fā)及下咽癌的治療提供了參考價(jià)值,可以預(yù)見β-拉帕醌有望成為新的靶向治療藥應(yīng)用于下咽癌臨床治療。但詳細(xì)確切的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。