lncRNA NNT-AS1對卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的作用

顧中亮,尉春艷

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710004;*通訊作者,E-mail:weichy1023@163.com)

流行病學(xué)調(diào)查顯示,全球每年約20萬女性罹患卵巢癌,約12.5萬死亡[1]。據(jù)2018年統(tǒng)計資料可知,2008-2018年卵巢癌患者死亡率始終處于較高水平,且五年生存率無明顯改善[2]。卵巢癌作為臨床最常見的女性惡性生殖系統(tǒng)腫瘤,因早期多無明顯臨床癥狀,且缺乏有效可行的篩查及檢出方法,導(dǎo)致多數(shù)患者確診時已處晚期,因此喪失了最佳治療機會[3,4]。研究表明,早期卵巢癌患者5年生存期超過90%[5],故早期診斷和治療對提高存活率尤為重要。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)作為競爭性內(nèi)源RNA,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用,并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡和耐藥等過程[4,6,7]。煙酰胺核苷酸反義轉(zhuǎn)氫酶RNA1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase-antisense RNA1,NNT-AS1)作為新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,可影響細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等,在消化系統(tǒng)和女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中均有特異性異常表達(dá)[8],在消化系統(tǒng)腫瘤、宮頸癌等多種腫瘤中均呈高表達(dá),但在某些腫瘤中卻呈低表達(dá)[9,10]。Wang等[11]研究表明,NNT-AS1在大腸癌患者中高表達(dá),且與經(jīng)淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、血管的浸潤及分化密切相關(guān)。然而,NNT-AS1在卵巢癌中的表達(dá)情況以及對卵巢癌的作用尚未完全清楚,因此,本研究通過對NNT-AS1在卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡中的作用進(jìn)行研究,以期為卵巢癌的早期診斷及治療提供一定的理論依據(jù),具體研究如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑耗材

正常人卵巢上皮細(xì)胞系T29、人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910及SK-OV-3(購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫);胎牛血清[Gibco,賽默飛世爾科技(中國)有限公司,上海],Trizol總RNA抽提試劑盒、Lipofectamine 2000、流式細(xì)胞試劑[Invitrogen,賽默飛世爾科技(中國)有限公司,上海],逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒[Takara,Takara Biomedical Technology(Beijing) Co.,Ltd.,北京],MTT試劑盒[Promega(Beijing) Biotech Co.,Ltd.,北京],caspase-3及caspase-9活性檢測試劑盒(Bioss,北京博奧森生物技術(shù)有限公司,北京);細(xì)胞培養(yǎng)基、Transwell相關(guān)耗材均購自杭州諾揚生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

為研究卵巢癌細(xì)胞中NNT-AS1的表達(dá)情況并探索NNT-AS1對卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移的影響以及可能的作用機制,首先使用qRT-PCR檢測卵巢癌HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞NNT-AS1表達(dá)情況并比較其與正常人卵巢上皮細(xì)胞系T29的差異,隨后將卵巢癌HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞分別分為siNNT-AS1組(NNT-AS1沉默組)、siNC組(陰性對照組)和control組(對照組),siNNT-AS1組和siNC組分別轉(zhuǎn)染NNT-AS1沉默質(zhì)粒siNNT-AS1和陰性對照質(zhì)粒siNC,control組給予空載體,72 h后驗證轉(zhuǎn)染情況,并分采用MTT法檢測細(xì)胞增殖活性、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力,采用比色法檢測caspase-3、caspase-9活力。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染 將T29、HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞系置于內(nèi)含10%胎牛血清、1%鏈霉素的Eagle培養(yǎng)基內(nèi),5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至密度高于80%后,進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染或檢測。

1.2.2 qRT-PCR檢測NNT-AS1表達(dá)情況 采用Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA,設(shè)計引物序列見表1,隨后按照說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并采用qRT-PCR檢測NNT-AS1表達(dá)情況[12],隨后使用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量。

1.2.3 NNT-AS1基因沉默 HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞分別分為siNNT-AS1組、siNC組和control組。siNNT-AS1組、siNC組分別采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染siNNT-AS1(5′-GCAGGAGAGUAGCCAAGUCCA-3′)和siNC(5′-CUAGAUGCCAGUGUCCAGGGA-3′),control組僅加入空載體。質(zhì)粒由上?；蛑扑幱邢薰驹O(shè)計構(gòu)建。轉(zhuǎn)染72 h后采用qRT-PCR檢測兩種細(xì)胞系NNT-AS1表達(dá)情況以驗證基因沉默效果,并進(jìn)行MTT實驗、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實驗以及caspase-3和caspase-9活性檢測。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性 將處于對數(shù)生長期的HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞分別制成單細(xì)胞懸液后,接種至96孔板(5×103/孔),按說明書加入MTT溶液后繼續(xù)培養(yǎng),隨后分別在24,48,72 h時更換為150 μl/孔DMSO后,測490 nm處吸光度值(OD490 nm)并繪制生長曲線。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞分別消化并PBS洗滌,Binding Buffer制備1×106/ml重懸液,加入內(nèi)含5 μl PI及Annexin Ⅴ-藻藍(lán)蛋白的100 μl的染色緩沖液中并避光孵育后,使用流式細(xì)胞儀檢測Annexin Ⅴ陽性的凋亡細(xì)胞。

1.2.6 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力 收集HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞后分別接種(1×106/ml)于小室內(nèi),37 ℃培養(yǎng)24 h后,1%多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色,顯微鏡下取9個隨機視野計膜下細(xì)胞數(shù)平均值。

1.2.7 比色法、檢測caspase-3、caspase-9活性 按試劑盒說明,消化并PBS洗滌后,裂解液裂解,10 000 r/min離心1 min取上清,檢測蛋白濃度(3 μg/μl)后加入混有緩沖液的96孔板內(nèi),37 ℃孵育4 h后測405 nm處吸光度值(OD405)。單位蛋白中酶活性=OD405÷蛋白濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 正常卵巢細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞NNT-AS1表達(dá)情況

卵巢癌HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞系中的NNT-AS1相對表達(dá)量均顯著低于正常卵巢細(xì)胞系T29,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖1)。

與T29比較，*P<0.05圖1 正常卵巢細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞NNT-AS1表達(dá)水平對比Figure 1 Comparison of NNT-AS1 expression between normal ovarian cells and ovarian cancer cells

2.2 基因沉默的效果驗證

轉(zhuǎn)染72 h后,由qRT-PCR可見siNNT-AS1組HO-8910和SK-OV-3細(xì)胞系中的NNT-AS1相對表達(dá)量均顯著低于siNC組和control組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),提示NNT-AS1基因沉默成功。

2.3 NNT-AS1對HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞增殖的影響

由MTT實驗可見,HO-8910細(xì)胞系、SK-OV-3細(xì)胞系轉(zhuǎn)染siNNT-AS1后,其各時間點增殖活性均高于對應(yīng)siNC組及control組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖2)。提示NNT-AS1表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞HO-8910、SK-OV-3的增殖。

與同時間siNC組和control組比較,*P<0.05圖2 NNT-AS1對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響Figure 2 Effects of NNT-AS1 on proliferation of ovarian cancer cells

2.4 NNT-AS1對HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,HO-8910細(xì)胞系、SK-OV-3細(xì)胞系轉(zhuǎn)染siNNT-AS1后,其細(xì)胞凋亡率均低于對應(yīng)siNC組及control組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖3)。提示NNT-AS1表達(dá)下調(diào)可抑制卵巢癌細(xì)胞HO-8910、SK-OV-3的凋亡。

與siNC組及control組比較,*P<0.05圖3 NNT-AS1對卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 3 Effect of NNT-AS1 on apoptosis of ovarian cancer cells

2.5 NNT-AS1對HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞侵襲的影響

Transwell結(jié)果表明,HO-8910細(xì)胞系、SK-OV-3細(xì)胞系轉(zhuǎn)染siNNT-AS1后,細(xì)胞穿膜數(shù)均高于對應(yīng)siNC組及control組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖4,5)。提示NNT-AS1表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞的侵襲。

與siNC組及control組比較,*P<0.05圖4 NNT-AS1對卵巢癌細(xì)胞侵襲的影響Figure 4 Effect of NNT-AS1 on invasion of ovarian cancer cells

圖5 Transwell實驗觀察NNT-AS1對HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞侵襲的影響結(jié)果Figure 5 Effect of NNT-AS1 on invasion of HO-8910 and SK-OV-3 cells by Transwell

2.6 NNT-AS1對卵巢癌細(xì)胞caspase-3、caspase-9活性的影響

對caspase-3、caspase-9活性進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),HO-8910細(xì)胞系、SK-OV-3細(xì)胞系轉(zhuǎn)染siNNT-AS1后,其caspase-3、caspase-9活性均分別低于對應(yīng)siNC組及control組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05,見圖6)。

與siNC組及control組比較,*P<0.05圖6 NNT-AS1對卵巢癌細(xì)胞caspase-3、caspase-9活性的影響Figure 6 Effects of NNT-AS1 on caspase-3 and caspase-9 activities in ovarian cancer cells

3 討論

2011年Salmena等[13]提出了競爭性內(nèi)源RNA的假說,指出非編碼RNA可通過競爭miRNA反應(yīng)元件來調(diào)節(jié)miRNA的功能。lncRNA作為競爭性內(nèi)源RNA的一種,即可通過上述機制調(diào)控miRNA功能,發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用,并進(jìn)一步參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡和耐藥等過程,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中占重要作用[14,15]。因此,lncRNA可能作為腫瘤的早期診斷、治療及預(yù)后判斷的潛在靶向標(biāo)記物。

目前針對lncRNA在卵巢癌內(nèi)的作用機制研究較少,多集中在肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(關(guān)MALAT1)、Homeobox轉(zhuǎn)錄反義基因間RNA(HOTAIR義)、核富集轉(zhuǎn)錄體1(NEAT1體等lncRNA的研究中,針對NNT-AS1在卵巢癌內(nèi)的作用機制研究較少[16,17]。NNT-AS1作為一類新鑒定出來的長鏈非編碼RNA,最早被發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌[11],隨后在肝癌[18]、胃癌[19]、非小細(xì)胞性肺癌[8]、宮頸癌[7]、白血病[20]等腫瘤中被發(fā)現(xiàn)均有表達(dá)的異常升高,而在卵巢癌中的研究較少[21]。本研究中,采用卵巢漿液性囊腺癌細(xì)胞系HO-8910、人卵巢腺癌細(xì)胞系SK-OV-3進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)與正常卵巢細(xì)胞系T29相比,NNT-AS1表達(dá)下降。隨后基因沉默NNT-AS1后,進(jìn)一步對HO-8910、SK-OV-3卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲水平進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)NNT-AS1沉默后,可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞HO-8910、SK-OV-3的增殖及侵襲并抑制其凋亡。Huang等[21]對卵巢癌細(xì)胞HO-8910、SK-OV-3進(jìn)行NNT-AS1基因沉默后,也發(fā)現(xiàn)其增殖能力上升、凋亡下降,而且侵襲能力增加了60%-70%,與我們的研究結(jié)論一致;他們還對細(xì)胞的遷移能力和修復(fù)能力進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)NNT-AS1基因沉默后卵巢癌細(xì)胞的遷移能力和修復(fù)能力均顯著升高,結(jié)合我們的研究結(jié)果,進(jìn)一步說明NNT-AS1在卵巢癌中可能發(fā)揮保護(hù)性作用。另外,我們通過對caspase-3、caspase-9活性的檢測,發(fā)現(xiàn)其均呈下降趨勢,提示NNT-AS1是通過抑制內(nèi)源性途徑進(jìn)而實現(xiàn)對卵巢癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控[12,22],NNT-AS1可能成為通過內(nèi)源性途徑生物治療卵巢癌的潛在靶點。

分析NNT-AS1在卵巢癌細(xì)胞中與在消化系統(tǒng)腫瘤、肺癌甚至宮頸癌中表達(dá)情況不同的原因,以及在卵巢癌細(xì)胞中與MALAT1、HOTAIR、NEAT1等其他lncRNA表達(dá)升高情況也不同的原因,一方面可能是因為NNT-AS1在不同系統(tǒng)腫瘤中競爭抑制的miRNA或下游信號通路不同,如結(jié)直腸癌中NNT-AS1主要通過活化MARK/Erk信號參與腫瘤發(fā)生[11],而在肝癌或胃癌發(fā)展中則是通過miR-363/CDK6參與[18,23];另一方面是因為即使在卵巢癌細(xì)胞中不同lncRNA的作用機制不同所致[23]。由于有研究表明,在卵巢癌中,lncRNA ADAMTS9-AS2表達(dá)下調(diào),且與卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān),該表達(dá)特點與NNT-AS1相似,而前者是通過miR-182-5p/FOXF2信號軸進(jìn)而發(fā)揮對卵巢癌進(jìn)展的抑制作用[24],因此,NNT-AS1是否通過某種miRNA對FOXF2或通過類似機制進(jìn)而實現(xiàn)對卵巢癌的調(diào)控作用,有待進(jìn)一步探索。

綜上所述,卵巢癌HO-8910、SK-OV-3細(xì)胞增殖、侵襲增加及凋亡下降可能與NNT-AS1表達(dá)下降有關(guān),對NNT-AS1進(jìn)行檢測或干預(yù)可能發(fā)揮預(yù)防或治療卵巢癌的作用。然而,NNT-AS1在卵巢癌細(xì)胞中的具體作用仍需設(shè)計拯救實驗,通過上調(diào)其表達(dá)進(jìn)一步驗證;另外,參與其作用過程的具體miRNA及信號通路也需進(jìn)一步深入探索。